高三生物一轮复习课件第37讲微生物的培养技术及应用

第37讲微生物的培养技术及应用主要考点

必备知识考点一微生物的培养技术考点二微生物的选择培养和计数考点一微生物的培养技术相关信息＝＝＝＝＝＝＝＝＝微生物1.概念：难以用肉眼观察的微小生物的统称。光学显微镜可见细胞(μm)；电子显微镜可见细胞器、病毒(nm)SARS病毒、新冠病毒等RAN病毒；噬菌体等DNA病毒个体微小、结构简单◆微生物的共同特点：1.

是研究和应用微生物的前提，也是发酵工程的重要基础。2.实验室培养微生物的条件：①为微生物提供合适的

条件；②要确保

，并将需要的微生物分离出来。防止杂菌污染，获得纯净的微生物培养物微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到，若想得到纯净的微生物，就必须对其进行培养和分离。营养和环境其他微生物无法混入培养基无菌技术一、培养基的配制1.培养基的概念:人们按照微生物对

的不同需求，配制出供其_________的营养基质。营养物质生长繁殖

2.培养基的作用:用以

微生物或

。积累其代谢物培养、分离、鉴定、保存3.培养基的必备营养成分:水、碳源、氮源、无机盐等。有机碳源：⑴碳源（提供碳元素）⑵氮源（提供氮元素）为什么培养基需要氮源？氮是微生物合成蛋白质、核酸等物质必须的元素。无机碳源：CO2、CO32-、HCO3-自养微生物糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油等异养微生物无机氮源：NH4＋、NO3-、NH3等固氮微生物有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等功能：

提供无机营养

调剂PH

维持渗透压无机盐水功能：

良好的溶剂

维持生物大分子结构的稳定一、培养基的配制功能：①构成细胞物质和一些代谢产物②有机碳既是碳源又是能源。（3）特殊需求满足微生物对

、

、

的需求。特殊营养物质pHO2④培养厌氧微生物时，需要提供

的条件。①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加

；②培养霉菌时，需要将培养基调至

；③培养细菌时，需要将培养基调至

；维生素酸性中性或弱碱性无氧表1-11000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成组分含量提供的主要营养牛肉膏5g碳源、磷酸盐和维生素等蛋白胨10g氮源和维生素等NaCl5g无机盐H2O定容至1000ml水维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等

主要提供碳源的是牛肉膏，主要提供氮源的是蛋白胨。一、培养基的配制几种微生物的营养和能量来源一、培养基的配制1.同一种物质不能既做碳源又做氮源有机碳源如糖类，可为异养生物提供碳源，也可提供能源无机碳源如CO2，为自养型微生物提供碳源，但不能提供能量牛肉膏或蛋白胨，可为异养微生物提供碳源和氮源还可提供无机盐2.碳源都能提供能量3.NaHCO3只能提供碳源4.无机氮源也能提供能量NH3：既是硝化细菌的氮源，又是它的能源物质判一判：×××√一、培养基的配制划分标准培养基种类特点用途物理性质化学成分用途不加凝固剂加凝固剂，如琼脂工业生产观察微生物的运动、分类鉴定微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种含化学成分不明确的天然物质工业生产培养基成分明确分类、鉴定在培养基中加入某种化学物质,允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基培养、分离出特定微生物（加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌）在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物鉴别不同种类微生物用伊红美蓝

培养基鉴别大肠杆菌

选择培养基液体培养基半固体培养基固体培养基天然培养基合成培养基鉴别培养基4.种类注：琼脂仅作为凝固剂不为微生物生长提供能量和碳源二、无菌技术获得纯净的微生物培养物的关键是

。无菌技术主要包括

。防止杂菌污染消毒和灭菌(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行

。(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行

。注意事项：实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品

。为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在

。清洁和消毒灭菌超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行相接触1.消毒和灭菌工作主要包括两方面：二、无菌技术比较项目消毒灭菌概念使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子作用强度较为温和的理化因素强烈的物理、化学因素作用程度杀死物体表面或内部的部分微生物杀死物体内外所有的微生物芽孢和孢子消灭部分芽孢能杀灭全部芽孢和孢子适用对象操作空间、活体生物材料、操作者的衣着和双手操作工具、玻璃器皿、培养基等常用方法煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法湿热灭菌法、灼烧灭菌法、干热灭菌法消毒和灭菌的原理都是使微生物的蛋白质变性，借此杀死微生物。但两者的实质不同。消毒的结果实际上是部分灭菌。2.消毒与灭菌的概念及区别：3.常用的消毒与灭菌的方法(1)消毒的主要方法及应用范围方法适用范围操作方法煮沸消毒法巴氏消毒法化学药剂消毒法紫外线消毒日常生活用品(家庭餐具)100℃煮沸5～6min，可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。不耐高温的液体(牛奶、啤酒、果酒和酱油等)62～65℃消毒30min或80～90℃处理30s～1min,可以杀死绝大多数微生物，不破坏营养成分生物活体(皮肤、伤口、动植物组织表面消毒)、水源、手术器械、塑料或玻璃器皿等体积分数为70%-75%的酒精擦拭双手、用氯气消毒水源，碘酒皮肤伤口，石炭酸等房间、仪器设备(接种箱、接种室、超净工作台)紫外线照射30min二、无菌技术3.常用的消毒与灭菌的方法(2)灭菌的主要方法及应用范围方法适用范围操作方法湿热灭菌干热灭菌灼烧灭菌高压蒸汽灭菌锅:压力100kPa、温度121℃下维持15-30min培养基、无菌水等多种器材物品放入干热灭菌箱，160～170℃的热空气中维持2～3h耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(如吸管、培养皿)、金属用具

(如针头、镊子、剪刀等)等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层(外焰)灼烧，可以迅速彻底地灭菌。适用于微生物的接种工具，如涂布器、接种环、接种针或其它金属用具，试管口、瓶口等容易被污染的部位二、无菌技术1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。(1)培养细菌用的培养基与培养皿(2)玻棒、试管、烧瓶和吸管(3)实验操作者的双手无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。(1)、(2)需要灭菌；(3)需要消毒。培养基用高压蒸汽灭菌，培养皿、玻璃棒、试管、烧瓶、吸管可以采用干热灭菌法，实验操作者的双手可以用酒精擦拭。目的：①防止培养物被污染；②防止感染实验操作者。4.微生物纯培养的步骤1.培养物：2.纯培养物：3.纯培养：获得

的过程。配制培养基灭菌接种分离培养等在微生物学中，将接种于

内，在合适条件下形成的含

的群体。由

所获得的微生物群体。纯培养物培养基特定种类微生物单一个体繁殖三、微生物的纯培养(1)菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。(2)单菌落：一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。（3）特征：（4）功能：(4)获得单菌落的方法：1.实验原理将单个微生物分散在固体培养基上的方法稀释涂布平板法、平板划线法。大小、形状、隆起程度、颜色等。鉴定菌种的重要依据微生物群分散或稀释单个细胞繁殖单菌落三、微生物的纯培养酵母菌的纯培养2.方法步骤配制培养基称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖(也可用蔗糖代替)、15～20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。灭菌将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15~30min。将5～8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160～170℃灭菌2h。倒平板待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。(1)制备培养基三、微生物的纯培养酵母菌的纯培养倒平板注意事项：①温度：50℃左右；②操作：在酒精灯火焰附近；③冷凝后平板倒置。倒平板具体操作步骤：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以防止培养基表面的水分过快挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。避免杂菌污染。琼脂在90℃以上熔化，在40℃左右凝固，倒平板时高于50℃则会烫手，低于50℃时，若不能及时操作，琼脂会凝固。(2)接种和分离酵母菌平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。分区划线法原理：单个细胞微生物群单个菌落连续划线分散或稀释生长繁殖三、微生物的纯培养酵母菌的纯培养①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液⑥将皿盖打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划3-5条平行线，盖上皿盖。⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞③试管口通过火焰⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。平板划线的具体操作步骤第1区划线接种环灭菌第2区划线接种环灭菌第3区划线接种环灭菌接种环灭菌分区划线法12345注意事项:①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次②划线首尾不能相接(最后一区不要与第一区相连)③每次划线前接种环进行灭菌(在5个区域划线，接种环灼烧灭菌共6次)④划线后,培养皿倒置培养为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？灼烧时期目的取菌种前每次划线前接种结束后杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞杀死接种环上原有微生物，避免污染培养物。三、微生物的纯培养酵母菌的纯培养完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃

左右(培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异)的恒温培养箱中培养24~48h。警示：在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基在丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。(3)培养酵母菌划3个平板(重复实验)和1个不划线(空白对照)三、微生物的纯培养酵母菌的纯培养考点二微生物的选择培养和计数1.选择培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。分离酵母菌、霉菌等真菌(青霉素能杀死细菌、放线菌)分离固氮微生物分离自养型微生物④加高浓度食盐金黄色葡萄球菌⑤石油是唯一碳源能消除石油污染的微生物③不加含碳有机物②不加氮源①加入青霉素选择培养基的作用：分离并计数某种微生物的数量（例如，能分解尿素的细菌）一、培养基：在培养基中加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应。从而达到鉴定的作用。伊红——亚甲蓝培养基鉴别大肠杆菌（大肠杆菌菌落呈深紫色并有金属光泽）刚果红培养基鉴别纤维素分解菌2、鉴别培养基一、培养基：3.选择培养基与鉴别培养基的比较项目选择培养基鉴别培养基原理用途举例图示尿素分解菌大肠杆菌加入不影响甚至促进目标微生物生长，而抑制或阻止其他种类微生物生长的化学物质加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)，使微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应培养、分离出目标微生物鉴别目标微生物培养酵母菌和霉菌时，可在培养基中加入青霉素，抑制细菌的生长；利用以尿素为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌可用伊红亚甲蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有，则菌落深紫色并有金属光泽)一、培养基：1.原理：通过对土样进行充分稀释，再将菌液涂布到制备好的培养基上，即可得到能纯培养物。2.两个基本操作：系列（梯度）稀释操作

和涂布平板操作二、微生物的选择培养——稀释涂布平板法3.系列稀释操作：常用于将细胞接种到培养基之前，通过液体稀释的方法分散细胞，随着稀释程度的增大，单位体积中的微生物细胞数量减少，细胞得以分散。⑴铲取土壤，将样品装入纸袋中。⑵将10g土壤加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。⑶取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的是试管中，依次等比稀释。1×101mL1mL1×1071×1061×1051×1041×1031×1029mL无菌水1mL1mL1mL1mL90mL无菌水操作步骤：二、微生物的选择培养——稀释涂布平板法①取菌液：取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。②涂布器消毒：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。③涂布器灭菌：将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，培养④涂布平板：用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。4.涂布平板操作：二、微生物的选择培养——稀释涂布平板法5.培养：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的温度下培养1-2d。在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落。培养时要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养，为什么？未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键，如果无菌落生长，说明了什么？培养未接种的培养基的作用是对照。未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生长，说明培养基制备成功、合格，未受到污染。二、微生物的选择培养——稀释涂布平板法用平板划线法接种培养结果的图片如下。请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？不能。平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。与平板划线法相比，为什么稀释涂布平板法可以用于细菌的计数？稀释涂布平板法会进行等比稀释，在合适的稀释倍数下，均匀涂布得到的菌落互不接触，可以确定菌类的密度，再通过计算可以得知原液的菌落数。平板划线法和稀释涂布平板法比较：比较平板划线法稀释涂布平板法主要步骤工具能否用于计数菌体获取结果共同点涂布器接种环都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单细胞菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可以于观察菌落特征不能计数可以计数，但操作复杂，需涂布多个平板接种环在固体平板培养基表面连续划线①一系列的梯度稀释；②涂布平板法操作在具有显著的菌落特征的区域菌落中挑取菌体从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体平板划线法和稀释涂布平板法比较：1.稀释涂布平板法当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目(1)原理(2)计数原则一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目，通常选用一定稀释范围的样品进行培养，在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。数量测定方法：稀释涂布平板法——间接计数法显微镜直接计数法——直接计数法三、微生物的数量测定(3)注意事项：统计的菌落数往往比活菌的实际数目

，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是

菌落。因此，统计结果一般用

而不是用活菌数来表示。少一个菌落数下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析，每克土壤中的菌株数约为多少？约为1.7×109个。1.稀释涂布平板法三、微生物的数量测定（4）计算

C代表某一稀释度下平板上生长菌落数的平均值；

V代表涂布平板时吸取的稀释液体积数值(mL)；

M代表稀释倍数；则每g样品中的菌数=__________

（C÷V）×M例.某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL)（）A.2.34×108B.2.34×109C.234D.23.4B=同一稀释度下菌落数的平均值吸取的稀释液体积×稀释倍数1.稀释涂布平板法三、微生物的数量测定统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。2.显微镜直接计数法：①是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定容积里样品中微生物的数量。

②*血细胞计数板常用对相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等；

细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数；

③优点：________④缺点（1）统计结果一般是_____________________，不能区分死菌与活菌,因此计数的结果比实际值大。（2）个体小的细菌在显微镜下难以观察。快速直观活菌数和死菌数的总和三、微生物的数量测定平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？提示不能，平板划线法最开始的划线很可能菌类会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。三、微生物的数量测定3、微生物的计数方法比较内容显微镜直接计数法（直接计数法）稀释涂布平板法（间接计数法）主要用具显微镜、细菌计数板或血细胞计数板涂布器计数依据细菌个数培养基上菌落数优点计数方便、操作简单计数的是活菌缺点不能区分死菌与活菌当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落计算公式每毫升原液含菌株数＝400×1000×每小格平均菌株数×稀释倍数每毫升原液含菌株数＝平均菌落数/所用涂布液体积×稀释倍数结果比实际值偏大比实际值偏小三、微生物的数量测定1.分离原理绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用________________的_____培养基，可以从土壤中分离出_______的细菌脲酶以尿素作为唯一氮源选择分解尿素常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。四、土壤中分解尿素的细菌的分离和计数2.制备培养基葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g琼脂15.0g蒸馏水1000ml制备选择培养基（尿素为唯一氮源）制备牛肉膏蛋白胨培养基用牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，用以尿素为唯一氮源的培养基做实验组，用来判断选择培养基是否具有选择作用。①提供无机盐；②调节pH。（1）土壤取样3.操作步骤细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表3～8cm的土壤层。因此，取样时一般要铲去表层土。取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。四、土壤中分解尿素的细菌的分离和计数测细菌数：一般用104、105、106稀释液测放线菌：一般用103、104、105稀释液测真菌数：一般用102、103、104稀释液（2）样品的稀释选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300