《诊断酶学》课件

第五章诊断酶学第一节概述一、酶的组成、结构和功能1、酶的本质和特性本质：蛋白质〔绝大局部〕或核酸〔极少数〕

核酶:核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一类特殊的RNA，能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反响.1982美国T.Cech和Altman于1989年共获诺贝尔化学奖。酶的特性：极高的催化效率、高度的特异性、催化的可调节性。2、酶的结构与功能单纯酶：由约100～10000个氨基酸肽键相连而成酶结合酶蛋白质——酶蛋白辅酶非蛋白局部——辅因子辅基2、酶的结构与功能酶是蛋白质，具有一、二、三、四级结构

单体酶：只由一条多肽链构成的酶

寡聚酶：由多个相同或不同亚基以非共价键连接的酶

多酶体系：在细胞内存在着许多由几种不同功能的酶彼此聚合而成的多酶复合物酶的活性中心酶的必需基团在一级结构上可能相距很远，但在空间结构上彼此靠近，组成具有能与底物结合并起催化反响的特定空间结构区域，称为酶的活性中心。对结合酶来说，辅酶或辅基参与酶活性中心的组成。二、酶的催化作用机制1、活化能2、酶降低活化能的作用机制酶通过与底物形成一种或多种中间复合物来降低反响的活化能三、酶的命名、分类与编号一、血清酶的来源根据酶的来源及其在血浆中发挥催化功能的情况，将其分为：一般代谢酶组织专一酶血浆特异酶非血浆特异酶外分泌酶细胞酶一般代谢酶组织专一酶血浆特异酶非血浆特异酶外分泌酶细胞酶血清酶第二节血清酶

1、血浆特异酶主要指作为血浆蛋白的固有成分，在血浆中发挥特定的催化作用的酶，如凝血酶原。2、非血浆特异酶

这类酶在血浆中浓度很低，并且在血浆中很少发挥催化作用。可分为：

①外分泌酶指来源于消化腺或其他外分泌腺的酶，如胰淀粉酶等。它们在血液中含量与相应的分泌腺的功能及疾病有关。

②细胞酶指存在于各组织细胞中进行代谢的酶类。随着细胞的新陈代谢，有少量酶释入血液。其中大局部无器官专一性，只有小局部来源于特定的组织，有器官专一性。这类酶细胞内外浓度差异悬殊，病理情况下极易升高，其下降的临床意义很少。这些酶最常用于临床诊断，如转氨酶、LD、CK等。

名称

血浆特异酶

非血浆特异酶

外分泌酶细胞酶一般代谢酶组织专一酶来源肝消化腺或其它外分泌腺

各组织器官

（无器官专一性）

肝

（有器官专一性）

种类凝血酶原、Ⅹ因子、Ⅻ因子、纤溶酶原、ChE、CER、LCAT、脂蛋白脂肪酶等

胰淀粉酶、胰脂肪酶、胰蛋白酶、ACP、ALP等LDH、AST、ALT、CK、MDH等

OCT等

二、血清酶的去路1、血清酶的半寿期酶失活至原来活性一半时所需时间称为酶的半寿期。一般以半寿期来代表酶从血中去除的快慢。血清酶甚至同工酶之间半寿期差异很大。这些有助于了解同一疾病不同酶升高持续时间的差异，半寿期长的酶，在血清中持续时间长。2、血清酶的失活和排泄研究说明酶主要是在血管内失活或分解的，酶的去除与血浆蛋白的去除途径并不完全相同。血清酶受蛋白酶水解而产生的低分子多肽或氨基酸可经小肠粘膜排至肠腔，再彻底分解成氨基酸后重吸收，其中大局部氨基酸可被组织利用，不能利用的氨基酸可经尿排出体外。

三、血清酶变化的病理机制

正常情况下血清酶活性相对恒定。但在一些病理情况下，如细胞膜通透性增加或细胞坏死，细胞内酶合成增加，酶排泄障碍，恶性肿瘤异位分泌，酶合成障碍，中毒及遗传缺陷等，常导致血清中酶活性的改变。三、血清酶变化的病理机制〔一〕合成异常合成减少合成增多肝损害导致合成酶的能力受损（ChE、LCAT）酶基因变异引起酶合成减少（铜氧化酶）增生性疾病（骨骼疾病，ALP)恶性肿瘤（前列腺癌，ACP)酶的诱导作用（乙醇，γ-GT）(二)酶释放增加

酶从病变(或损伤)细胞中释放增加是疾病时大多数血清酶增高的主要机制。研究说明，炎症、缺血／缺氧、能源供给缺乏、坏死和创伤等是细胞释放大分子酶蛋白的重要原因。细胞酶的释放量还受下述一些因素影响：1．细胞内外酶浓度的差异2．酶的相对分子量3．酶的组织分布4．酶在细胞内的定位和存在形式(三)酶排出异常

约有24％的血清AMY由肾脏排出，肾功能减退时，血清AMY活性升高可能因酶排泄障碍而在血液中滞留所致。胆道梗阻时，血清ALP升高的原因是梗阻区ALP合成加强，ALP排泄受阻而逆流人血。但对于大多数酶而言，并不存在酶经肾脏或胆道排出异常而导致血清酶升高的这种去除机制。四、血清酶的生理差异1．性别:多数血清酶的男女性别差异不大，但少数酶如CK、ALP及γ-GT等有性别差异，男性高于女性。2．年龄:血清中有些酶的活性常随年龄而变化。最明显的一个例子是ALP3．进食:血清中大多数酶不受进食的影响，故测定酶活性不一定需要空腹采血。高脂、高糖饮食后血清ALP活性升高。4．运动:剧烈的肌肉运动可使血清中多种酶，如CK等活性升高。5．妊娠:妊娠胎盘组织可分泌一些酶进入母体血液，如耐热ALP、LD等，引起血清中这些酶升高。6．其他:血清中有些酶与同工酶有种族差异.第三节酶促反响动力学一、酶促反响K1K2E+SESE+PK-1酶底物酶-底物复合物酶产物反响级数及特征一级反响：反响速率与反响物的浓度的一次方成正比。二级反响：反响速率与两种物质浓度的乘积成正比。零级反响：反响速率与反响物浓度无关而受它种因素影响而改变的反响。混合级反响：一级反应混合级反应零级反应V[S]

Vmax［S］VO=Km+［S］米-曼氏方程最大反响速率底物浓度米氏常数反响速度〔一〕Km假设v=0.5Vmax，那么Km=[S]，可见Km值等于酶促反响的初速率为最大速率Vmax一半时的底物浓度。Km值一般在10-6～10-2mol／L之间。Km只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。Vmax［S］VO=Km+［S］Km意义：

Km是酶的特征性常数之一，在临床酶学分析中具有重要意义。1．1／Km可近似地表示酶对底物的亲和力的大小，Km值越小，表示酶与底物的亲和力越大，反之亦然。2．如果一个酶有几种底物，那么对每一种底物各有一个特定的Km值，其中Km值最小的底物大都是该酶的最适底物或天然底物。

Vmax［S］VO=Km+［S］3．如酶的Km，可计算某一底物浓度时反响速率v和最大速率Vmax的比值，并可推知酶的活性中心被底物饱和的分数。同样，如要求v和Vmax有一定的百分比，也可算出所需底物浓度为其Km的多少倍。4．利用工具酶来测定体液中某一成分的浓度或某一酶的催化活性浓度时，可根据米-曼氏方程或其衍变方程式来计算工具酶的用量。5．测定Km值可鉴别不同来源但催化相同反响的酶是同一种酶或是同工酶。

Vmax［S］VO=Km+［S］6．如一个酶催化正逆两个方向，测定正逆两个方向底物的Km及底物浓度，可大体推测该酶在体内催化反响的方向及其催化效率。7．在代谢酶系中，当一组酶催化连续的代谢反响时，如各酶的Km及其相应底物的浓度，有助于寻找代谢的限速步骤。一般Km值最大的酶所催化的反响为该酶系的限速步骤。Vmax［S］VO=Km+［S］(二)Vmax

Vmax表示在一定酶量下的最大反响速率，即酶完全被底物饱和时的反响速度，与酶浓度呈正比。在酶的浓度不变时，对于特定底物而言，Vmax也是一个常数。

(三)Km和Vmax的测定将米－曼氏方程进行倒数处理，而转换成直线方程为：1／Ｖmax01［Ｓ］１－Km1Ｖo斜率＝双倒数作图法三、酶促反响的影响因素1、酶浓度2、底物的种类和浓度3、缓冲液的种类、离子强度和pH4、温度5、激活剂与抑制剂6、其它1、酶浓度在［S］＞＞［E］时，酶促反响随酶浓度的增加而增加，即反响速率与酶的浓度成正比。病理情况下，酶浓度过高时，底物过早而且过多的被消耗，影响酶活性的测定，故需用生理盐水或其它缓冲液进行适当的稀释，但要注意稀释对测定结果的影响，如低酶浓度时，酶易解离为单体，常比多聚体更易失活。2、底物的种类和浓度一级反响零级反响一般选择Km最小的最适底物，酶测定时底物浓度最好为Km的10～20倍。(三)缓冲液的种类、离子强度和pH酶与底物结合的能力，酶的催化活性，会受不同pH的影响，只有在最正确缓冲系统内才能充分表达。各种酶都具有使酶促反响速率最大时的pH，即最适pH。一般来说，动物酶多在6.5～8.0之间。但ACP反响的最适pH为4.0～7.0而ALP那么为9.0～10.0。最适pH并非酶的特征性常数，易受缓冲液的种类、离子强度及底物浓度不同等因素影响。临床酶学测定时发现，用不同种类的缓冲液配制相同pH介质所测酶活性并不相同。缓冲液的离子强度也可影响酶的活性。必须强调的是，各种体液样品本身也是缓冲液，和底物混合后不一定维持原来pH，也会影响酶活性测定结果，所以应严格掌握测定样品与底物的用量比例，一般样品在总体积中的比例应不超过10％。此外，缓冲液中的物质不应与分析系统中的任何物质反响，否那么应特别加以说明。(四)温度

酶促反响也有一个最适温度，在其两侧反响速率都比较低。在到达最适温度以前，温度每增加10℃，反响速率增加1～2倍。但温度对酶活性的影响具有双重性，一方面温度升高可加快酶促反响；而另一方面温度可能使酶失活。T（℃）V最适温度人体大多数酶的最适温度为37℃左右，超过42℃酶活性就逐渐降低，至60℃时酶因蛋白变性而失去活性。反之，酶在20℃以下时几乎无催化反响。酶的最适温度与底物浓度、pH、离子强度、保温时间等许多因素有关。(五)激活剂与抑制剂临床酶学测定中广泛应用金属离子等激活剂来提高测定的灵敏度。例如所有转磷酸的酶，如激酶类和ALP的反响都需要Mg2+的参加，如在反响体系中参加EDTA等螯合剂或以其为抗凝剂常抑制一些酶的活性。测定CK活性时，参加的激活剂有Mg2+和巯基，其中Mg2+是CK的辅基，含巯基的N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)使CK被激活。抑制剂所产生的抑制作用分为不可逆性与可逆性两类。前者抑制剂与酶共价结合，使酶活性丧失。后者抑制剂通过非共价键与酶可逆性结合。在设计和选择酶测定的方法时，应设法防止抑制剂对酶促反响的影响。1.竞争性抑制

V

=Vmax[S]

Km(1+)+[S]Ki[I][E]=[Ef]+[ES]+[EI]作用特点

：Vmax不变，Km变大，Km随[I]的增加而增大，抑制分数与[I]成正比，与[S]成反比。通过增加底物浓度来消除或降低抑制剂的作用。2.混合性抑制

V=Vmax[S]

(Km+[S])(1+)Ki[I][E]=[Ef]+[ES]+[EI]+[ESI]作用特点

：Vmax变小，Km不变，Vmax随[I]的增加而减小，抑制分数与[I]成正比，与[S]无关。不能通过增加底物浓度来消除或降低抑制剂的作用。3、非竞争性抑制4.反竞争性抑制[E]=[Ef]+[ES]+[ESI]V=

Vmax[S]Km+[S](1+)Ki[I]作用特点

：Vmax

和Km都变小，并且Vmax和Km随[I]的增加而减小，抑制分数与[I]和[S]成正比，酶活性浓度概念酶活性浓度测定连续监测法检测酶活性浓度工具酶血清酶活性浓度测定条件的优化酶活性浓度的单位一、酶活性浓度的概念1.酶的特性：微量性、高效性等。直接测量非常困难（mmol/L或mg/dl）通过测定被加速化学反应的反应速率，来间接反映酶的浓度2.酶促反响SSEE+ESEPE+PV＝dsdt或V＝dpdtES

3.酶活性浓度即酶所催化的化学反响的反响速率，用酶促反响中单位时间内底物的减少量或产物的生成量来计算。注意：只有当酶所催化的反响速度仅与[E]成正比，而不受其它因素影响时，即在酶促反响的零级期，才能根据酶所催化的化学反响速率来确切表示酶活性浓度的大小。但仅在上述前提下，只能在反响的零级期，即只有在酶促反响的最适条件下，才能真实地代表酶含量。因此可根据酶促反响进程曲线，采用合理的方法进行酶活性浓度的检测。零级一级[P][S]V＝dpdt反响级数时间4.酶促反响进程延滞期线性期非线性期

LagphaseZeroorderLinearphaseFirstorder酶促反响时间进程曲线单试剂测定体系酶促反响进程曲线二、酶活性浓度测定方法〔一〕按检测方法分类1、量气法其原理是通过测量一封闭反响系统中气体变化后的气体体积或压力，从而计算出气体的变化量适用于测定在反响中产生或消耗气体的酶2、分光光度法酶促反响的底物与产物结构不同，光吸收谱也有差异，不仅能在可见光范围测定有色溶液的浓度，还能在紫外光波长范围测定特异的带有双键或环状结构的无色物质3、荧光法和放射性核素法通过荧光光度计测定酶促反响生成荧光物质的速率，此速率与酶浓度成正比4、其它方法〔二〕按反响时间分类1、定时法〔取样法、终点法、两点法〕优点：简单，测定时酶促反应已被终止，故比色计或分光光度计无需保温设备，显色剂的选择不考虑对酶活性的影响。缺点：无法知道在整个酶促反应进程中是否都是零级反应。注意：应先做预实验找出酶促反应速率恒定的时期，确定线性时间；保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要精确。定时法，早期测定酶活性浓度的方法，大多是使酶作用一段时间，然后参加强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反响，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反响的平均速度。连续监测法，即指连续测定酶促反响过程中某一产物或底物浓度随时间变化的多点数据，求出酶促反响初速度，间接计算出酶活性浓度的方法。其是临床测定酶活性浓度最常用方法。2、连续监测法〔动力学法、速率法〕优点：容易找到直线区域，选择线性反响期来计算酶活性，不需终止反响。缺点：线性反响期因酶种类和反响条件而异，必须用实验方法进行确定，必须选取酶促反响的最适反响条件，需要有可以连续监测的设备。3、平衡法目前临床应用较少，通过测定酶促反响开始至反响到达平衡时产物或底物浓度的总变化量来求出酶活性浓度的方法。三、连续监测法测定酶活性浓度〔一〕种类1.直接法不终止酶促反响条件下，直接通过测定反响体系中底物或产物理化性质的变化〔如：A、荧光、旋光性，pH、电导率、粘度等〕，从而计算出酶活性浓度。评价方法简单，但只有底物与产物之间，在理化性质方面有显著性差异时，才能使用直接法，只有很少一局部酶能用直接法测定。

〔1〕目前以分光光度法最为广泛，利用340nm处吸光度的变化测定各种脱氢酶。NAD(P)++H+NAD(P)H

仅在260nm处有吸收峰

在260、340nm处有吸收峰340nm处A的变化可以反映反响体系中NAD(P)H量的增减，进而反映酶活性浓度。〔2〕利用一类人工合成的所谓色原性底物，其本身为无色或微黄色，酶作用后生成有色化合物。人工合成的色素原底物待测酶产物的毫摩尔吸光系数对硝基苯酚磷酸二钠盐（PNPP-Na2）ALP对硝基酚（PNP）（405nm，pH10.3）18.5L-γ-谷氨酰-3-羧基对硝基苯胺GGT2-硝基-5-氨基苯甲酸（405nm，pH8.1）9.492-氯-硝基酚-α-半乳糖-麦芽糖苷AMS2-氯酚（2-CP）（405nm，pH6.0）6.12-氯-硝基酚-α-岩藻糖苷α-岩藻糖苷酶（AFU）2-CP（405nm，pH6.5）6.2底物和测定对象：〔1〕在原反响体系中参加一些试剂，其只和酶反响物迅速作用，产生可被检出的物质，但该试剂不和酶反响，也不影响酶的活性。SPE+试剂可被检出的物质〔2〕酶偶联法目前应用最多，即在原反响体系中参加另一些酶试剂，所进行的酶促反响和被测酶反响偶联起来。〔二〕酶偶联反响反响模式ABPExEi被测酶被测酶始发反响始发反响指示反响指示酶指示反响指示酶ABCPExEaEi辅助酶辅助反响酶偶联体系辅助酶辅助反响1.酶偶联反响时相酶偶联反响一开始不能反映酶活性，在反响中存在几个时相。以临床常规酶学分析中常见的ALT的检测为例，在该酶偶联体系中的指示酶为脱氢酶，反响原理如下：L-丙氨酸＋α-酮戊二酸α-丙酮酸＋L-谷氨酸α-丙酮酸＋NADH乳酸＋NAD+ALTLDH此时反响的方向由NADH转变为NAD，随反响进行，A应随之而下降，通过检测反响产物A在340nm处A的变化速率，可以检测指示酶反响。ALT双试剂法测定中，首先使血清与缺少α-酮戊二酸的底物溶液混合，37°C保温5m，将样品中所含的内源性α-酮酸消耗完。然后再参加α-酮戊二酸启动ALT催化的反响。反响一开始参加的试剂1中只有丙氨酸，不存在α-酮戊二酸，在此时相中，存在于样品中的干扰物质〔内源性α-酮酸〕消耗完。参加试剂2〔即α-酮戊二酸〕启动反响，在初始阶段，产物α-丙酮酸开始出现，并逐渐增多，但处于较低水平，指示酶反响速度也较低，不能代表待测酶的Vx。随着产物α-丙酮酸增加到一定程度，Ex和Ei反响V相同，到达稳态期。此阶段340nm处A出现明显的线性变化。最后由于底物的消耗，反响V逐渐减慢，偏离线性。

1．酶偶联法指示酶的反响系统：以NAD〔P〕+或NAD〔P〕H为辅酶的脱氢酶类作为指示酶，监测其反响物NAD〔P〕H于340nm处紫外吸收或在紫外激发光365nm波长照射下，其在460nm发射强烈荧光的变化速率的测定系统；是偶联过氧化氢〔H2O2〕以过氧化物酶〔POD〕为指示酶的测定系统。Trinder反响：2.酶偶联反响本卷须知(1)延滞期应越短越好，测定时间要避开此期。(2)不是所有的酶都适合用酶偶联法进行测定，酶偶联反响V应超过或等于Vx，Ei反响必须是一级反响，即指示酶反响速率和测定酶的产物B浓度成正比。只有使用大量的Ei及其Km值很小时才能做到。(3)从经济方面考虑应选用一些来源容易且价格廉价的酶〔指示酶〕制剂。(4)适当的指示酶的用量，反复实验法确定，即做到酶偶联速率不随酶量的增加而升高，并在所选的最适条件下，指示酶偶联反响速率和酶活性浓度成正比。〔三〕干扰因素(1)其他酶和物质的干扰(2)酶的污染(3)非酶反响(4)分析容器的污染(5)沉淀形成

解决方法之一可通过试剂空白管检出并加以校正，另一个有效途径就是不用单一试剂而改用双试剂测定酶活性。P151

五、血清酶活性浓度测定条件的优化方法仪器设备试剂自动生物化学分析仪参数设置标本的采集、运输与保存标本的采集、运输与保存溶血：细胞内酶而言，细胞内外浓度差异大；所以应及时进行别离，静脉采血后应在1～2h内别离血清。抗凝剂：利用草酸盐、枸橼酸盐、EDTA抗凝的血浆一般不用作酶活性测定；肝素对ALT、AST、CK、LD、ACP检测均无影响，可用于急诊；临床多用血清为首选测定标本。温度：大局部酶在低温中比较稳定，一般在血清别离当天测定，否那么应放冰箱冷藏；通常在0～4°C下使用、处理及保存，除了一些冷变性的酶；液氮可作为酶学测定时血清标本及质控长期保存的方法。P155

六、酶活性浓度单位〔一〕酶活性单位惯用单位用首先报告该种酶测定方法的临床酶学家的名字来命名其单位，即使同一种酶因方法不同而有数种活性单位，参考值差异很大。国际单位1963年，1IU＝1μmol/min〔25°C及其他最适条件下〕1976年，1U＝1μmol/min〔特定条件下〕1979年，1Katal＝1mol/s〔规定条件下〕，1U＝16.67nKatal例：碘色法测定血清淀粉酶〔AMS〕【单位定义】1惯用单位：100ml血清AMS在37℃15min，水解5mg淀粉。【操作】测定管：稀释10倍后的血清0.2ml中加0.4g/L的淀粉溶液1ml37℃水浴7.5min后显色。校准管(“比照〞校准管)：用蒸馏水替代血清，其它步骤相同。反响完成后，660nm处以蒸馏水调零，分别测出△Au、△Ac。【计算】

测定管：血清0.1ml加底物液等后于37℃水浴15min，再加显色液显色。同时，设立除先不加血清、其它步骤相同的空白管〔在反响最后加血清〕，510nm处以空白管调零测出△Au。校准管：以校准曲线中第2管为例。取0.05mg/ml的酚校准液0.4ml，加显色液等至总体积与测定管相等，用蒸馏水替代酚校准液、其它步骤相同的空白管调零，510nm处测出△Ac。【计算】

可见，第2管相当于酶活性单位为：20金氏单位/100ml血清，常简写为20金氏单位。【单位定义】1金氏单位：100ml血清ALP在37℃与底物作用15min，产生1mg酚。【操作】例:金氏法测定血清ALP。〔二〕酶活性浓度单位以每单位体积所含的酶活性单位数表示；各国学者习惯用U/L表示体液中酶催化活性浓度，

1U/L=16.67nKatal/L正常上限〔upperlimitsofnormal，ULN〕倍数把酶测定值转换为正常上限值的倍数；易于比较解释来自不同方法的结果，利于各实验室间质评调查；可将ULN进一步适当分级，制定出轻度、中度及重度增加的范围，使检测结果更加一目了然；

〔三〕酶活性浓度计算连续监测法检测酶活性浓度时，使用摩尔消光系数〔ε〕。其定义为：特定条件下，一定波长的光，光径为1.0cm时，通过所含吸光物质的浓度为1.00mol/L时的吸光度。连续监测法测定在线性范围内每分钟吸光度的变化〔ΔA/min〕U/L＝ΔAmin×V×106ε×v×LΔA—吸光度变化106

—把mol换算成μmolv—样品量（ml）L

—比色杯光径（cm）V—反应体系体积（ml）ε—摩尔消光系数（cm2

·mol-1）自动生物化学分析仪测定同一酶，条件固定时，从理论上讲V，v和L均为固定值，ε为常数，那么可将公式简写为：U/L＝ΔAmin×KV×106ε×v×LK=K为酶活性浓度定量系数主要用于临床酶活性测定的计算与校正K值设置应考虑酶的参考值上限及测定时间两方面，这些均与仪器测定的噪音有关。第五节

酶的免疫化学测定一、报告方式酶活性浓度单位：U/L质量浓度单位：ng/ml，μg/L二、优点灵敏度高特异性高能用于检测一些不表现酶活性的酶蛋白特别适用于同工酶的检测样品中其他方法不易测出的少量或痕量酶不受体液中其它物质的影响酶原或去辅基酶蛋白

三、缺点要制备足够量多的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清步骤多，操作繁琐测定本钱高

第六节

同工酶及其亚型测定一、概念同工酶〔isoenzyme〕

同一种属中由不同基因或等位基因所编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的催化功能，但其分子组成、空间构象、理化性质、生物学性质以及器官分布和细胞内定位不同的一类酶。亚型〔isoform〕

即指基因在编码过程中由于翻译后修饰的差异所形成的多种形式的一类酶，往往在基因编码产物从细胞内释入血浆时因肽酶作用降解而形成。

二、分析方法临床同工酶的分析可分为两步首先精确地别离出某酶的各同工酶组分测定酶的总活性和各同工酶或亚型组分的活性二、分析方法〔一〕电泳法原理方法同工酶氨基酸组成不同〔一级结构不同〕，pI不同，电泳迁移率也就不同，电泳可将其分开。

显色染料偶氮染料四唑盐离子型化合物，易溶于水，难溶于一般的有机试剂，利用其进行的偶合反响，生成不同颜色的偶氮色素进行同工酶谱检测受氢体作用，四唑盐可被复原成紫红色的formazan，常用的有：NBT、INT、MTT等。其中NBT使用最多。扫描定量光密度计荧光计〔二〕色谱法柱色谱法离子交换色谱亲和色谱商品化微型色谱柱〔三〕免疫分析法免疫抑制法免疫沉淀法其它免疫学方法

利用同工酶的一种亚基与相应抗体结合后，酶活性受到抑制，测定加与不加抗体前后样品中酶活性的变化

利用分离提纯的同工酶作抗原制备的抗体与含该型同工酶的待测样品混合，在一定条件下抗原抗体复合物形成沉淀，离心后测定上清液中其它型别的酶活性，将加入抗体前测得的总活性减去上清液酶活性，即可求出被沉淀的同工酶的活性。免疫电泳、RIA、EIA和CLIA〔四〕动力学分析法底物特异性分析法抑制剂分析法

pH分析法热失活分析法三、同工酶检测意义提高酶诊断的特异性提高诊断的灵敏度对某些疾病的预后有评价价值有些同工酶有明显的组织分布和细胞内定位差异有些同工酶的变化可在总酶变化之前发生线粒体酶的测定第七节工具酶及其临床应用工具酶：酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶。指示酶和辅助酶作为反响系统中的试剂。〔一〕工具酶〔二〕常用工具酶常用工具酶多为氧化复原酶类工具酶纯度不必要求过高工具酶中杂质的含量有一定的限制〔三〕工具酶参与的指示反响临床生化检验中，很多工程的测定往往使用有工具酶参与的类似的反响原理－－共通〔通用〕反响途径。1.偶联H2O2的工具酶及其指示反响葡萄糖尿酸胆固醇甘油丙酮酸葡萄糖氧化酶尿酸氧化酶胆固醇氧化酶甘油氧化酶丙酮酸氧化酶H2O2以H（e）为受体的指示酶以NAD(P)H为辅酶参与的指示酶触酶POD(最常用〕2H2O2+4-AAP+酚醌亚胺(红色)+4H2OPOD例：葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖Glu＋O2＋H2OGA＋H2O2H2O2＋4-AAP＋酚H2O＋O2＋红色醌类化合物GODPOD葡萄糖氧化酶〔glucoseoxidase，GOD〕利用O2和H2O将Glu氧化成GA，并释放H2O2，过氧化物酶〔peroxidase，POD〕在色原性氧受体存在时将H2O2分解为H2O和O2，并将色原性氧受体4-AAP和酚去氢缩合为红色醌类化合物，即Trinder反响。红色醌类化合物的量与Glu含量成正比。2.NAD(P)+或NAD(P)H偶联的脱氢酶及其指示反响许多氧化复原反响，尤其是作为工具酶如LD、GLD、G6PD等参与时，常将底物的H去除后传递给NAD(P)+形成NAD(P)H。借助NAD(P)H340nm处特征性的光吸收，借此用分光光度法检测。如：葡萄糖、尿素、β-羟丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、ALT、AST、LD、GLD、CK、ALD、G6PD、ICD等。例：尿素＋H2O2NH3＋CO2NH3＋α-酮戊二酸＋NADH＋H+谷氨酸＋NAD+＋H2O尿素酶GLD

P+NAD(P)H+H+PH2+NAD(P)+

第八节临床常用血清酶分析临床各系统疾病的酶学诊断一、肝脏疾病诊断肝实质细胞受损的酶：ASTALTLD(LD5)反映肝细胞合成功能的酶：ChELCAT凝血酶原诊断肝纤维化的酶：MAO诊断胆道梗阻的酶：ALPGGT

5`-NT二、骨骼及骨骼肌疾病诊断骨骼疾病：ALP诊断骨骼肌疾病：CK(CK-MM)ASTLD(LD5)三、胰腺疾病AMYLPS四、前列腺疾病

ACPPSA五、心肌酶谱

CK-MB：AMI诊断的金指标

ASTm：判断预后

LD：LD1>LD2一、转氨酶〔Aminotransferases〕及其同工酶丙氨酸氨基转移酶(Alanineaminotransferases，ALT)/谷丙转氨酶GPT天冬氨酸氨基转移酶(Aspartateaminotransferases，AST/谷草转氨酶GOT1.催化反响L-丙氨酸＋α-酮戊二酸α-丙酮酸＋L-谷氨酸L-天冬氨酸＋α-酮戊二酸α-草酰乙酸＋L-谷氨酸ALTAST两种酶均需要磷酸吡哆醛〔VitB6〕为辅基，不含磷酸吡哆醛的酶蛋白为脱辅基酶蛋白，无催化活性。

ALT

&

AST

丙氨酸氨基转移酶Alanineaminotransferase(ALT)天门冬氨酸氨基转移酶Aspartateaminotransferase(AST)ALT80%AST20%ASTALT&

ASTALT、AST体内分布情况及半衰期变化分布半衰期（小时）脏器肝细胞ALT肝脏、骨骼肌、肾脏、心肌等主要在胞质47AST心肌、肝脏、骨骼肌、肾脏等80%在线粒体20%在胞浆172.组织分布

ALT大量存在于肝组织，其次为肾、心、骨骼肌等。其有两种活性同工酶，α(ALTs)、β(ALTm)，分别存在细胞质及线粒体中。肝细胞中ALT大多存在细胞质，少量在线粒体，肝细胞坏死时血清中以ALTs为主。

AST存在多种器官，按含量多少为心、肝、骨骼肌和肾。其有两种同工酶ASTs、ASTm，分别存在细胞质及线粒体中。细胞轻度损伤ASTs显著升高，而严重损伤时ASTm大量出现于血清中。血中AST升高多来自心脏或肝脏损伤。ALT&

AST参考值范围Referenceinterval:ALT:5-40U/LAST:8-40U/LALT/AST≤13.标本溶血标本不能用于检测

宜用血清，4℃

冰箱中可贮存1星期，活性无明显改变。4.临床意义

ALT是反映肝损伤的一个灵敏指标急性肝炎早期升高，ALT>AST；急性肝炎恢复指标Deritis比值可用于肝炎诊断、鉴别诊断及判断转归酶胆别离是肝细胞坏死先兆

AST主要用于肝脏疾病的诊断AMI发病6-8h即升高，48-60h达顶峰，4-5d恢复正常。由于AST在AMI时升高迟于CK，恢复早于LD，故目前诊断AMI价值不大。急性肝炎，AST升高程度不及ALT；慢性肝炎，特别肝硬化、慢性活动性肝炎时，AST升高程度超过ALT。ALT&

AST临床意义Clinicalsignificance疾病ALT与ASTALT/AST急性病毒性肝炎Acuteviralhepatitis↑↑＞1慢性病毒性肝炎ChronicviralhepatitisN或↑＞1酒精性肝病、脂肪肝Alcoholicliverdiseases,FattyliverN或↑＜1肝硬化LivercirrhosisN、↓或↑＜1N：正常；↑：轻度升高；↑↑：明显升高；↓：降低二、γ-谷氨酰转移酶及其同工酶γ-谷氨酰转移酶〔γ-glutamyltranspeptid,γ-GT/GGT〕1.催化反响又称：γ-谷氨酰转肽酶〔γ-GTP/GGTP)一种含巯基的线粒体酶，可催化γ-谷氨酰基从GSH或其它含γ-谷氨酰基化合物中转移至另一肽或氨基酸分子上。

GSH＋氨基酸

γ-谷氨酰氨基酸＋半胱氨酰甘氨酸GGT

2.组织分布

肾脏中含量最多，其次为胰、肺、肝等。血清中的GGT主要来自肝胆。

3.标本

GGT较稳定，室温下可放置2d，

4℃可存放1w，-20℃可储存1y；RBC中几乎无GGT，因此溶血标本可以检测。参考值范围：<50U/L

4.临床意义

有助肝胆疾病的鉴别诊断与ALP联合进行肝脏疾病检测胆道疾病，GGT阳性率高，而且升高明显，可高达5-30ULN，肝实质疾病是GGT一般只是中度升高，可达2-5ULN。假设ALP升高而GGT正常，那么完全排除ALP的肝来源，假设ALP和GGT都增加，那么应先排除肝外引起GGT增加的原因，一旦排除，那么GGT增高为肝病所致。(1)肝胆疾病检出阳性率最高的酶

(2)用于判断恶性肿瘤有无肝转移

(3)乙醇、巴比妥类药物等可诱导GGT的升高。P168

三、肌酸激酶及其同工酶和亚型肌酸激酶〔creatinekinase，CK〕1.催化反响CK催化肌酸和ATP或磷酸肌酸和ADP之间的磷酸转移的可逆性反响，所产生的磷酸肌酸含高能磷酸键，是肌肉收缩时能量的直接来源。磷酸肌酸＋ADP肌酸＋ATPCK2.组织分布广泛分布于全身，在骨骼肌含量最高，其次是心肌和脑。CK由两种不同亚基〔M，B〕组成的二聚体，细胞质中存在三种同工酶：CK-BB(CK1)、CK-MB(CK2)、CK-MM(CK3)，线粒体中存在CK-Mt(CK4)，其电泳速率最慢。CK同工酶又可分为不同亚型，CK-MM有三种亚型，CK-MM1，CK-MM2，CK-MM3，电泳速率依次减慢；CK-MB有CK-MB2和CK-MB1两种亚型。3.标本

不得用溶血标本，RBC中含有AK，可干扰测定，引起测定值偏高；测定样品宜用血清或肝素抗凝血浆，其它抗凝剂都抑制CK活性。

4.临床意义

CK及其同工酶和亚型是目前临床上测定次数最多的酶之一，主要用于心肌、骨骼肌和脑疾患的诊断。

(1)AMI的早期诊断总CK在AMI诊断中意义不大CK-MB为诊断AMI的金指标CK-MM3/CK-MM1>1.0为诊断AMI的标准（排除急性骨骼肌损伤）CK-MB2>1.9U/L或CK-MB2/CK-MB1>1.5为诊断AMI的标准之一

(2)全身疾病特别是肌肉疾病时，CK极度升高

四、乳酸脱氢酶及其同工酶和亚型乳酸脱氢酶〔lactatedehydrogenase，LD/LDH〕1.催化反响

LD催化乳酸氧化成丙酮酸，同时将氢转移给辅酶而成为NADH，依条件不同而有可逆性。L-乳酸＋NAD+丙酮酸＋NADH＋H+pH8.8～9.8Ph7.4～7.8

2.组织分布

LD是一种含锌的糖酵解酶，广泛存在于人体各组织中，以肝、心肌、肾、肌肉、RBC含量最高。LD是由两种不同亚基（M和H）组成的四聚体，形成5种结构不同的同工酶，即LD1(H4)，LD2(H3M)，LD3(H2M2)，LD4(HM3)和LD5(M4)。1.以LD1为主，主要在心肌，可占总LD活性50％以上，也存在于RBC内；2.以LD5为主，以横纹肌为代表，肝脏中也有；3.以LD3为主，存在于脾肺。一般成年人血中LD同工酶存在如下规律：LD2>LD1>LD3>LD4>LD5，部分正常儿童血中可见LD1>LD2。LDH的亚基分为两类：骨骼肌型〔M〕、心肌型〔H〕

五种同工酶的亚基组成分别为：

HHHH，HHHM，HHMM，HMMM,MMMM乳酸脱氢酶同工酶的电泳图谱肝脏肌肉横隔膜心肾3.标本一般用血清，用血浆需离心去除血小板〔血小板中含有大量的LD〕，采血后迅速别离血清；因RBC中LD含量比血清高100倍以上，不宜用溶血标本。LD4、LD5宜冷变性，不应放在冰箱中，25℃放2-3d，LD活性变化不大。4.临床意义

亚急性心肌梗死诊断有一定价值，但其特异性差；

(1)诊断心脏疾病心肌梗死和心肌炎时以LD1和LD2升高为主，大多数AMI患者血中会出现“反转比率〞，即LD1>LD2；

(2)诊断肝脏疾病

肝细胞损伤时常出现LD5>LD4;

急性肝炎时LD1LD2相对下降，LD5升高；慢性肝炎时LD5升高，且LD1<LD3；肝硬化时为LD2下降和LD5升高；肝癌时LD5升高，但LD1>LD3；

(3)诊断骨骼肌疾病

骨骼肌损伤时常出现LD5>LD4;五、碱性磷酸酶及其同工酶碱性磷酸酶〔alkalinephosphatase，ALP/AKP〕1.催化反响一种含锌的糖蛋白，在碱性环境中〔pH10.0〕可以水解各种天然及人工合成的磷酸单酯化合物。2.组织分布

ALP广泛存在于各组织器官中，其