血凝仪检测原理及应用

关于血凝仪检测原理及应用2（一）凝血常规（常规凝血功能筛选组合）

1.凝血常规1（6项）：PT、APTT、TT、Fib-C、D-二聚体、AT-Ⅲ

适合于：干部病房、ICU病房、呼吸内科、消化内科、血液内科、产科、肿瘤科、心内科、肾内科和术后出血患者等，以及其它科室60岁以上高危人群。

2.凝血常规2（4项）：PT、APTT、TT、Fib-C适合于：一般手术患者。第2页,共65页，2024年2月25日，星期天3（二）DIC筛选试验组合：

PT、APTT、TT、Fib-C、D-二聚体、FDP、AT-Ⅲ

（三）血友病组合：

PT、APTT、TT、Ⅷ:C、Ⅸ:C、Ⅷ抑制物检查（四）凝血因子全套检查：

PT、APTT、TT、Fib-C、Ⅱ:C、Ⅶ:C、Ⅷ：C、Ⅸ:C、Ⅹ:C、Ⅺ：C第3页,共65页，2024年2月25日，星期天4（五）药物性出血的监测

1.口服华法林治疗监测组合：PT2.普通肝素治疗监测组合：

TT、APTT、AT-Ⅲ3.溶栓药物治疗（SK、UK、t-PA）监测组合：PT、APTT、D-二聚体、TT、Fib-C、FDP第4页,共65页，2024年2月25日，星期天5出血

血栓形成

正常止血血栓第5页,共65页，2024年2月25日，星期天6三个阶段，两个途径

（内源性、外源性）第一阶段：凝血酶原激活物形成第二阶段：凝血酶形成第三阶段：纤维蛋白形成第6页,共65页，2024年2月25日，星期天7凝子因子参与的凝血途径内源性凝血途径：Ⅷ，Ⅸ，Ⅺ，Ⅻ外源性凝血途径：Ⅲ，Ⅶ共同凝血途径：Ⅰ，Ⅱ，Ⅴ，Ⅹ，ⅩⅢ第7页,共65页，2024年2月25日，星期天8第8页,共65页，2024年2月25日，星期天9传统的凝血途径的修改外源性的Ⅶ因子在组织因子的结合下既可激活Ⅹ因子，又可激活内源性的第Ⅸ因子，从而打破了内源与外源的界限。Ⅻ因子缺乏时并不引起出血，这说明第Ⅺ因子并不一定只被Ⅻ因子激活，现已证明Ⅺ本身具有自身激活作用。凝血酶（Ⅱ因子）也可激活Ⅺ因子，原来认为只有Ⅻ因子才能激活Ⅺ因子。TF被激活并与Ⅶ因子结合后会被一种组织因子途径抑制物（TFPI）所抑制；后者已成为一种新型抗凝剂。第9页,共65页，2024年2月25日，星期天10二、凝血检验标本收集和预处理第10页,共65页，2024年2月25日，星期天11（一）标本采集

1.抽血注意事项（1）抽血管首选优质塑料管；（2）定量抽血完毕，立即将标本轻柔颠倒混匀5次，避免剧烈摇动；（3）许多专家建议抽血的第一管血不用作血栓试验，尽量选第二管。第11页,共65页，2024年2月25日，星期天122.抗凝剂问题（1）世界卫生组织/美国临床和实验室标准协会（WHO/CLSI）都推荐使用0.109mol/L枸橼酸钠（3.2%Na3C6H5O7﹒2H2O）作为凝血检验的抗凝剂；（2）一般选用1份抗凝剂+9份静脉血—当Hct25%～55%时；（3）若Hct＜25%或＞55%时，抗凝剂的用量=0.00185×全血量×[1-Hct]×100；第12页,共65页，2024年2月25日，星期天13Hct异常时抗凝剂和抽血量第13页,共65页，2024年2月25日，星期天14高Hct的影响病例：真性红细胞增多症患者，Hct0.562（1）1：9比例抗凝结果（错误）：

PT19.2s，PT-INR1.78，APTT62.1s，

Fib-C1.67g/L，TT22.9s，与临床不符。（2）0.20.00185×（100-56.2）计算后应抽血2.5ml，结果（正确）为：

PT13.9s，PT-INR1.30，APTT36.2s，

Fib-C1.70g/L，TT19.7s，与临床相符。第14页,共65页，2024年2月25日，星期天15（二）离心问题

1.血栓试验使用的血浆为PPP；

2.一般要求2000～2500g/min（3000r/min），离心时间为10min左右，转速N（转/分）与“g”的转换关系：g=11.18×10-7×半径（mm）×N（转/分）；

3.离心温度室温即可，但不可超过25℃，4℃离心条件应该提倡。第15页,共65页，2024年2月25日，星期天16（三）即时试验标本的要求

1.标本尽可能在4小时内完成；

2.筛查试验和一些因子测定时，应避免将标本长时间室温放置；

3.Ⅶ因子测定时，标本要避免冷藏。第16页,共65页，2024年2月25日，星期天17（四）分离后血浆标本的处理1.建议将标本保存在-70℃以下条件，凝血因子至少可稳定6个月；2.短期保存可在-35℃条件，-20℃条件通常是不理想的；3.冷冻血浆解冻应放置37℃水浴条件，并轻轻摇动4～5分钟，分析前轻柔地颠倒混匀。室温放置自然解冻是不可取的，因室温放置会有冷沉淀形成，Ⅷ:C和vWF会减少，并有纤维蛋白原析出。冷冻过的血浆不能再次冷冻。第17页,共65页，2024年2月25日，星期天18XIIXIIXVIII外源凝血途径检查PT内源凝血途径检查APTT组织因子VII+XXaII凝血酶原IIa（凝血酶）I(FIB)Ia(凝块)V组织因子途径TFTFPI共同途径途径检查TT凝血途径示意图第18页,共65页，2024年2月25日，星期天19三、凝血酶原时间测定（PT）第19页,共65页，2024年2月25日，星期天20IIIIVPLIIICa

,PL2+Ca

,PL2+XIIVIIXIIIIIXVIIIVIIVIVIIIIIXIXII

inBlood血液中

inPlasma血浆中PTReagentFibrinExtrinsicSystem外在系统MeasureClottingTimewithoutTissueFactorCalcium（Ca）2+

Blood

SamplingwithoutwithoutTrisodium

CitrateNormalRange9-14sec37℃XVIXIIXIIIXVIIIXVIIIVIVIIIIIIPhospholipidXIXIII（一）检测原理第20页,共65页，2024年2月25日，星期天21PT检测的原理在受检血浆中加入过量的组织凝血活酶和钙离子，使凝血酶原变为凝血酶，后者使纤维蛋白原与转变为纤维蛋白。观察血浆凝固所需的时间即为凝血酶原时间。CA1500仪器法判断终点采用光学法，即当纤维蛋白原转变为纤维蛋白时，经光照后产生的散射光发生变化，仪器判读终点。第21页,共65页，2024年2月25日，星期天22（二）临床应用

1.延长

（1）见于先天性外源凝血因子（Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ）缺乏症和低/无FIB血症，凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ轻微减少，PT的延长幅度也不大，Ⅱ因子减少病人，其PT经常在正常范围；（2）口服抗凝药，如华法令等；（3）维生素K缺乏症；（4）DIC及原发性纤溶症；（5）肝脏疾病；（6）血中有抗凝物质（狼疮抗凝物、抗磷脂抗体、肝素、FDP以及抗Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ

的抗体）。

第22页,共65页，2024年2月25日，星期天23

2.缩短

（1）血栓前状态和血栓性疾病；（2）见于先天性V因子增多；（3）长期口服避孕药；（4）使用重组的Ⅶ因子治疗时；（5）标本放置在2～8℃，Ⅶ因子冷激活发生，使PT缩短。

3.口服抗凝剂的检测

PT和PT-INR是监测口服抗凝剂的常用指标，中国人PT-INR在1.5-2.5用药较为安全和有效。第23页,共65页，2024年2月25日，星期天24低ISI试剂的优势

ISI=1.0试剂 ISI=2.0试剂

MNPT

11sec 11sec

PT

22sec 15.6sec

PT-INR

(22/11)=2.0 (15.6/11)=2.0

当系统误差是

(21/11)=1.91 (14.6/11)=1.761秒时的INR

(23/11)=

2.09

(16.6/11)=2.28INR误差范围1.91~2.09

1.76~2.28121122第24页,共65页，2024年2月25日，星期天25MNPT的确定方法标本：多份混合血浆（20份以上）年龄：18-55岁性别：男、女（非妊娠、非经期）各半药物的影响：激素、抗生素、口服避孕药、降压药、维生素采血前的要求：勿剧烈运动空腹或只服少量无脂类食物第25页,共65页，2024年2月25日，星期天26四、活化部分凝血活酶時間（APTT）第26页,共65页，2024年2月25日，星期天27PLCa

,PL2+Ca

,PL2+XIXXIXIIIActivatorIVIVIIIXIIIXIIXIXIXVIIIVIIVIIIXIIIXIIXIXIXVIIIVIIVIVIIIIIIAPTT检测原理

inBlood

inPlasmawithout

Blood

SamplingwithoutwithoutTrisodium

CitrateAPTTReagentIntrinsicSystemMeasureClottingTimeEllagicacidCalcium（Ca）2+NormalRange20-40secCaCl2PhospholipidFibrin37℃VIIVIII第27页,共65页，2024年2月25日，星期天28APTT检测的原理37℃条件下，以白陶土（激活剂）激活因子Ⅺ和Ⅻ，以脑磷脂（部分凝血活酶）代替血小板提供凝血的催化表面，在Ca2+的参与下，观察贫血小板血浆凝固所需的时间即为活化部分凝血活酶时间。CA1500仪器法判断重点采用光学法，即当纤维蛋白原转变为纤维蛋白时，经光照后产生的散射光发生变化，仪器判读终点。第28页,共65页，2024年2月25日，星期天29临床应用1.延长

（1）见于内源性凝血因子（Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ）缺乏，如血友病A、血友病B及Ⅺ因子缺乏症；（2）严重的凝血酶原、Ⅴ、Ⅹ和FIB缺乏，如肝脏疾病、阻塞性黄疸、新生儿出血症、肠道灭菌综合征、吸收不良综合征、口服抗凝剂、应用肝素及FIB缺乏血症；（3）纤溶活性增强，如继发性、原发性纤溶亢进及循环血液中有纤维蛋白（原）降解产物（FDP）；

（4）血液中有抗凝物质，如抗因子Ⅷ或Ⅸ抗体，狼疮抗凝物质等。

第29页,共65页，2024年2月25日，星期天302.缩短

（1）高凝状态，如DIC的高凝期、促凝物质进入血液以及凝血因子的活性增高等；（2）血栓性疾病，如心肌梗死、不稳定性心绞痛、脑血管病变、糖尿病伴血管病变、肺梗死、深静脉血栓形成妊以及高症、肾病综合征和严重的灼伤等。第30页,共65页，2024年2月25日，星期天31

3.肝素治疗的监测（1）肝素用于预防血栓形成时，APTT为同时检测的正常对照值的1.5倍；

（2）肝素用于治疗的安全有效范围是APTT为同时检测的正常对照值的1.5-2.5倍。第31页,共65页，2024年2月25日，星期天32APTT测定常见的问题1.分析前因素2.APTT试剂（激活剂）第32页,共65页，2024年2月25日，星期天33五、凝血酶时间测定（TT）第33页,共65页，2024年2月25日，星期天34第34页,共65页，2024年2月25日，星期天35第35页,共65页，2024年2月25日，星期天36临床应用

1延长

（1）见于FIB水平或功能减低，如低FIB血症或异常FIB血症；

（2）应用肝素或肝素类物质存在（如SLE、肝病和肾病等）；

（3）见于FDP增多。第36页,共65页，2024年2月25日，星期天372缩短

见于高凝状态3

作为溶栓药物，如链激酶（SK），尿激酶（UK）和组织性纤溶酶原激活剂（t-PA）等溶栓治疗的监测指标。TT在正常对照值的1.5—2.5倍，治疗安全有效。

第37页,共65页，2024年2月25日，星期天38TT测定常见的问题1.分析前因素2.TT试剂①凝血酶试剂:来源于牛；②对肝素和FDP高度敏感；③TT试剂保存时间较短，不宜重复使用。第38页,共65页，2024年2月25日，星期天39PT、APTT、TT联合分析一第39页,共65页，2024年2月25日，星期天40OATPT、APTT、TT联合分析二第40页,共65页，2024年2月25日，星期天41凝血因子FVIII或IX或XI或XII缺陷PT、APTT、TT联合分析三第41页,共65页，2024年2月25日，星期天42纤溶过程（纤溶系统）FIB（纤维蛋白原）纤维蛋白(血栓）FSPs(包括D-D)FDPs(统称)FDP纤溶酶纤溶酶原(抗纤溶酶)激活剂抑制物抑制物FDP:FibrinogenDegradationProductsFSP:FibrinSplitProducts第42页,共65页，2024年2月25日，星期天43六、纤维蛋白原测定（Fib-C）第43页,共65页，2024年2月25日，星期天44IIaIIaIIIXIIIXIIXIXIXVIIIVIIVIVIIIIIIIXIIIXIIXIXIXVIIIVIIVIVII检测原理（Clauss法）

inBlood

inPlasmawithout

Blood

SamplingwithoutwithoutTrisodium

CitrateFbgReagentFibrinMeasureClottingTimeThrombinNormalRange200-400mg/dLCalculatedforFibrinogenconcentration37℃I第44页,共65页，2024年2月25日，星期天45ODOD1OD2OD3250mg/dl125mg/dl62mg/dlOD3OD2OD1062125250Mg/dl[FIB]时间ODFIBFIBFIBODx[FIB]检测原理（PT演算法）PT演算法的原理

PT测定完后纤蛋白原会转变成纤维蛋白，其形成的浊度与纤维蛋白质的含量成正比，因此不需要任何试剂，即可由产生的浊度直接推算出纤维蛋白原的含量。第45页,共65页，2024年2月25日，星期天46检测原理（免疫学方法）①利用抗FIB多克隆抗体与FIB特异性结合反应进行测定；

②方法有免疫浊度、单向免疫扩散和ELISA等。第46页,共65页，2024年2月25日，星期天47临床应用1增高

（1）动脉粥样硬化（2）糖尿病（3）急性传染病，急性感染（4）结缔组织病（5）急性肾炎和尿毒症（6）妊娠晚期和妊高症（7）放疗后，灼伤，休克，外科大手术后，恶性肿瘤等

第47页,共65页，2024年2月25日，星期天482减少

（1）DIC、原发型纤溶、重症肝炎，肝硬化；

（2）作为蛇毒治疗（抗栓酶、去纤酶）和溶栓治疗（UK、t-PA）的监测指标。FIB在1.2～1.5g/L，治疗安全有效。第48页,共65页，2024年2月25日，星期天49方法学问题①Clauss法—功能检测，操作简单，结果可靠，WHO推荐为Fib-C的参考方法（凝血酶为30～100U/ml，OVB的pH值应在7.35）；②PT演算法—更快速，简便，且重复性较好，当Fib在正常范围或轻度异常时，与Clauss法结果差异不大，但当Fib＞6.0g/L或Fib＜1.5g/L时，PT演算法结果不可信，一般高于Clauss法；第49页,共65页，2024年2月25日，星期天50Clauss法与PT演算法比较第50页,共65页，2024年2月25日，星期天51七、D-Dimer测定第51页,共65页，2024年2月25日，星期天52DDDDDDDDDDDDDDDDVisibleagglutinationDDDDEEDDDEDEnoagglutinationD-DimerD,EfragmentsDDD-DimerLatexAntibodyDED,E碎片D-Dimer—乳胶凝集方法第52页,共65页，2024年2月25日，星期天53D-Dimer临床应用D-Dimer增高提示机体内存在血栓形成和继发性纤溶亢；D-Dimer在血栓形成（高凝状态）、肝脏疾病和恶性肿瘤等疾病的鉴别诊断和治疗检测等方面具有较好的应用效果；由于D-Dimer具有高度的敏感性和良好的阴性预期，对于排除肺栓塞和静脉血栓有较大的价值；手术后患者D-Dimer可显著增高，发生静脉血栓和肺栓塞的风险较大，检测D-Dimer的水平变化可预测患者的血栓风险。第53页,共65页，2024年2月25日，星期天54FDP临床应用

1.原发性纤溶亢进时，FDP含量可明显升高。

2.高凝状态、弥散性血管内凝血、肝栓塞、器官移植的排异反应、妊娠高血压综合征、恶性肿瘤、心、肝、肾疾病及静脉血栓、溶栓治疗等所致的继发性纤溶亢进时，FDP含量升高。第54页,共65页，2024年2月25日，星期天55临床指标

①D-Dimer是交联纤维蛋白的特异性降解产物，是血栓形成的特异性指标；②D-Dimer是继发性纤溶的特异性指标；

③纤维蛋白原和纤维蛋白的降解产物