分子生物学-聚合酶链反应(PCR)汇编

聚合酶链反应PolymerasechainreactionPCR4/2/20241聚合酶链反应Polymerasechainreac

聚合酶链反应（polymerasechainreaction），简称PCR技术，是近年来发展起来的一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。

PCR特点：操作简单；扩增速度快，可在数小时内使DNA或RNA片段放大百万倍。

PCR应用：PCR技术已渗透到分子生物学的各处领域，在分子克隆、遗传病的基因诊断、法医学等方面得到了广泛应用。4/2/20242聚合酶链反应（polymerasechaPCR的基本原理

细胞中的DNA复制是一个复杂的过程。参与复制的因素有多种。PCR是在试管中进行的DNA复制反应（在体外模拟DNA复制反应），基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。4/2/20243PCR的基本原理细胞中的DNA复制是一个复杂4/2/202444/1/20244PCR循环–第一步–加热变性靶序列靶序列4/2/20245PCR循环–第一步–加热变性靶序列靶序列4/1/2PCR循环-第二步–引物与靶序列退火靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’4/2/20246PCR循环-第二步–引物与靶序列退火靶序列靶序列PrPCR循环-第三步-引物延伸靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase4/2/20247PCR循环-第三步-引物延伸靶序列靶序列Prime第1个PCR循环完成后–

得到两个拷贝的靶序列靶序列靶序列BiotinBiotin4/2/20248第1个PCR循环完成后–

得到30次循环后靶序列扩增的数量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon4/2/2024930次循环后靶序列扩增的数量No.of No.Ampli4/2/2024104/1/202410PCR扩增过程图示4/2/202411PCR扩增过程图示4/1/202411典型PCR反应体系复制模板耐热DNA聚合酶引物缓冲体系底物4/2/202412典型PCR反应体系复制模板耐热DNA聚合酶引物缓冲体系底物4

DNA的合成，无论是在体内，还是在体外，都是在DNA聚合酶的作用下，在模板的指导下合成的。在PCR反应中的模板，指的是待扩增的DNA片段。4/2/202413DNA的合成，无论是在体内，还是在体外，模板DNA：模板可以是基因组DNA、质粒DNA、扩增后的DNA或cDNA等，RNA的扩增需要首先反转录成cDNA后才能进行正常PCR循环。含有靶序列的DNA可以单链或双链形式加入PCR混合液。通常小片段模板DNA的PCR效率要高于大分子DNA，因此PCR反应前用机械剪切或用稀有限制酶酶解基因组DNA，以提高产量。PCR反应中模板加入量一般为102~105拷贝。1μg人基因组DNA相当于3×105个单拷贝的靶分子；10ng酵母DNA相当于3×105靶分子；1ng大肠杆菌DNA相当于3×105靶分子。4/2/202414模板DNA：模板可以是基因组DNA、质粒DNA、扩增后的DN耐热DNA聚合酶包括TaqDNA聚合酶、TthDNA聚合酶、VENTDNA聚合酶和SacDNA聚合酶。其中TaqDNA聚合酶应用最广泛。TaqDNA聚合酶在92.5℃、95℃和97.5℃时半衰期分别为40分钟、30分钟和5~6分钟，故PCR反应中变性温度不宜高于95℃。TaqDNA聚合酶最适温度是72℃，较高温度下的DNA合成错误率较低。因此，一次加酶可满足PCR反应全过程的需要，使PCR走向自动化。4/2/202415耐热DNA聚合酶包括TaqDNA聚合酶、TthDNA聚

DNA聚合酶只能从3’OH延长DNA，而不能从头合成DNA，必须有一个引物引发DNA的合成。因此，选择合适的引物是PCR成功的关键。引物设计的基本要求（原则）：（1）引物长度一般为15~30个核苷酸。引物过短会影响PCR的特异性，引物过长会提高相应的退火温度并使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度，也会影响产物生成。4/2/202416DNA聚合酶只能从3’OH延长DNA，而不能（2）引物中的碱基组成尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。尤其是引物的3’端不应有连续3个G和C。使引物在模板的G+C富集序列区错误配对。G+C含量在引物碱基中一般占40%~60%。设计引物时要考虑3’端和5’端具有相似的Tm值，按引物的碱基组成计算Tm值的公式为：Tm值=4（G+C）+2（A+T）4/2/202417（2）引物中的碱基组成尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶碱基（3）引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。按经验，引物自身存在的连续互补序列，一般不超过3bp。（4）两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠。（5）引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3’末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。4/2/202418（3）引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。按经验，（6）引物3’端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3’端最佳碱基选择是G和C。因为它们形成的碱基配对比较稳定。（7）引物浓度，引物的浓度一般为0.1~0.5μmol/L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增。4/2/202419（6）引物3’端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA

引物3’端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。在标准反应体系中用2UTaqDNA聚合酶和200μmol/LdNTP,以质粒（103个拷贝）为模板，按95℃，25秒；55℃，25秒；72℃，1分钟的循环参数扩增HIV-1gag区时，引物3’端错配对扩增效率的影响为：4/2/202420引物3’端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。在标引物3’端错配对扩增效率的影响5’4/2/202421引物3’端错配对扩增效率的影响5’4/1/20242PCR反应的缓冲体系：PCR的缓冲液一般制成10×，含有：500mmol/LKCl;100mmol/LTris-HCl(pH8.3);15mmol/LMgCl2;0.1%明胶。

使用时稀释10倍。其中Tris-HCl可维持反应体系的pH，KCl有利于引物的复性，但浓度过高会抑制TaqDNA聚合酶的活性，明胶可保护酶不变性失活，Taq酶需要Mg2+，它会影响反应的特异性和扩增DNA的产率，因此要将Mg2+浓度调至最佳。4/2/202422PCR反应的缓冲体系：PCR的缓冲液一般制成10×，含有：5延伸温度与时间：TaqDNA聚合酶的生物学活性：

70～80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

高于90℃时，DNA合成几乎不能进行4/2/202423延伸温度与时间：TaqDNA聚合酶的生物学活性：

延伸温度与时间：延伸温度：一般选择在70～75℃之间常用温度为72℃过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）3～4kb的靶序列需3～4min扩增10Kb需延伸至15min延伸进间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些4/2/202424延伸温度与时间：延伸温度：一般选择在70～75℃之间4/1/

底物：dNTP常用的浓度为20~200μmol/L，而且4种dNTP的终浓度相等。dNTP浓度过高虽可加快反应速度，但会增加碱基的错误掺入率，适当的低浓度会提高反应的精确度。另外，dNTP是磷酸根的来源，会与Mg2+结合，也应注意协调Mg2+浓度和dNTP浓度之间的关系。4/2/202425底物：dNTP常用的浓度为20~200μmPCR温度循环参数：

PCR反应中，变性温度一般为90~95℃。变性所需的时间取决于DNA的复杂性，多用94℃30秒对模板DNA进行变性，过高的温度及过长的时间会降低Taq酶的活性。引物的退火温度通过Tm=4（G+C）+2（A+T）计算得到，一般55~80℃30秒。延伸温度选在70~75℃之间，此时Taq酶的活性最高。延伸反应的时间根据扩增片段的长度而定，一般1kb以内延伸一分钟，更长的片段需相应延长时间。PCR的循环次数取决于模板DNA的浓度一般20~30次。4/2/202426PCR温度循环参数：PCR反应中，变性温度一般PCR实验中应注意的事项：

由于PCR反应具有极强的扩增能力和检测的灵敏性，微量的样品污染便有可能导致假阳性结果的出现。为此在实验操作中应谨防污染的发生，并设置严格的对照，以提高PCR结果的正确性。常采用的措施有（1）隔离不同操作区，包括样品制备区；PCR操作区；反应产物分析区等；（2）对于所用试剂必须分装，以减少重复取样所致的污染；（3）采用一次性吸头和加样器进行PCR取样和加样操作，样品制备应严格按无菌操作原则进行。4/2/202427PCR实验中应注意的事项：由于PCR反应具有为防止PCR过程中出现假阳性，应设置以下几个对照：（1）阳性对照：阳性DNA模板参与的PCR反应；（2）阴性对照：阴性DNA模板参与的PCR反应；（3）试剂对照：不含任何DNA模板，但具有所有反应试剂的PCR反应。4/2/202428为防止PCR过程中出现假阳性，应设置以下几个对照：（1）阳性PCR循环次数与产物的积累：从变性、退火到延伸一次称为一个循环，每循环一次产物增加一倍，即以指数增长。理论上讲，循环次数越多，产物积累越多。但PCR反应是在酶的作用下完成的，随着产物的增加，引物和底物的消耗，使酶促反应越来越慢，达到所谓的平台期。4/2/202429PCR循环次数与产物的积累：从变性、退火到延PCR技术的主要类型筑巢PCR（nested-primerPCR）共享引物PCR(sharedprimerPCR)多重PCR（multiplePCR）不对称PCR（asymmetricPCR）锚定PCR（anchoredPCR）反向PCR（invertedPCR）彩色PCR（colorcomplementationassay）原位PCR（insituPCR）定量PCR（quantifiedPCR）差异显示PCR（differentialdisplayPCR）重组PCR（recombinantPCR）PCR技术的类型4/2/202430PCR技术的主要类型筑巢PCR（nested-primer

筑巢PCR用两对引物进行扩增。第一对引物（外引物），扩增含目的基因的大片段，再用第二对引物（内引物）以扩增的大片段为模板进行扩增的方式，称筑巢PCR。进行筑巢PCR时，外引物设计得比内引物长一些，且用量较少，采用较高退火温度使内引物不能与模板结合，故只有外引物扩增。待外引物用尽后，降低退火温度即可直接进行内引物的扩增。筑巢PCR特点：筑巢PCR扩增时，对目的DNA的特异性高且适合于极少量模板的扩增。4/2/202431筑巢PCR用两对引物进行扩增。第一对引物（外5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’35’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’4/2/2024325’3’3’5’5’3’3’5’5’3’35’3’5’3’5共享引物PCR

共享引物PCR利用3条引物扩增两种不同的DNA序列，其中一条引物与两种待扩增序列都互补，与另两条引物共同组成两对引物。这种PCR方法常用于细菌学鉴定，确定同一种属细菌的不同种类。4/2/202433共享引物PCR共享引多重PCR多重PCR是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR过程。扩增时，不同引物扩增模板的不同片段，得到的产物为模板不同部位、不同长短的混合片段。因此，多重PCR适用于基因片段缺失、突变的检测。PCR后，进行电泳图谱分析，即可找出缺失或突变的片段。back4/2/202434多重PCR多重PC不对称PCR不对称PCR是一种快速制备单链DNA的技术。目前DNA测序时，DNA样品常用这种方法制备。

不对称扩增时，两条引物链的比例相着较大，当较少的引物用尽后，再进行扩增时，所得到的扩增产物，全部为单链DNA产物。4/2/202435不对称PCR不对back4/2/202436back4/1/202436锚定PCR一般的PCR反应，必须知道模板两侧的序列，以便设计引物。但在许多情况下，对模板两侧的序列并不清楚。对这样的模板进行扩增时，可用锚定PCR技术。这一技术经常用于未知cDNA的制备或低丰度cDNA文库的构建，而不适合于基因级DNA的扩增。其原理为，在一通用引物反转录产生的第一条cDNA3’加上同聚物尾（polyG），再用锚定引物（polyC）和通用引物进行cDNA的扩增。4/2/202437锚定PCR一般的PCR反back4/2/202438back4/1/202438反向PCR模板上某一序列是已知的，但我们想扩增其两侧的片段，这种情况在PCR反应中也会遇到，反向PCR就可以解决这一问题。其方法是，用合适的限制酶对基因组DNA进行消化，切除多余DNA后以已知序列DNA片段为核心进行环化，然后再对其进行扩增。4/2/202439反向PCR模板上某一序列是back4/2/202440back4/1/202440彩色PCR

在进行PCR反应时，将各种荧光物质对引物5’端进行标记，扩增后的产物带有不同色彩的荧光染料，在激发灯的照射下可以发出不同的色彩。本法更适合于多重PCR对DNA突变或缺失，以及遗传性疾病的基因基因诊断4/2/202441彩色PCR原位PCR原位PCR是近年来发展起来的一种新型PCR技术，是PCR技术和常规的原位杂交技术的结合，通过PCR技术对靶序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增，使其拷贝数大增，然后通过原位杂交方法检测，从而对靶核酸进行定性定位定量分析。原位PCR具有PCR的快速、灵敏、特异性强和原位杂交的定位精确的特点。4/2/202442原位PCR原位PCR原位PCR原位PCR的流程大致为：（1）染色体、细胞及组织切片样品的制备。此阶段中固定很重要，10%福尔马林、4%的多聚甲醛溶液和酒精为常用固定剂；（2）PCR前处理：包括石蜡切片、去石蜡、染色体变性和细胞穿透；（3）PCR扩增；（4）原位杂交及检测。4/2/202443原位PCR原位PCR的流程大致为：（原位PCR原位PCR按检测方法不同分为直接原位PCR和间接原位PCR，间接原位PCR是在PCR结束后，利用探针来探测专一性扩增序列，特异性较高；直接原位PCR是在PCR中直接掺入标记核苷酸，PCR结束后不必进行原位杂交而直接检测。该方法具有快速、简便的特点，但专一性往往不够，容易产生假象，尤其在组织切片上进行原位PCR。4/2/202444原位PCR原位PCR按检测定量PCR是利用PCR定量检测标本中靶基因的拷贝数的技术，这在研究基因的扩增等方面具有重要意义。该法是将目的基因和一个单拷贝的参照基因置于同一个试管中进行PCR扩增，电泳分离扩增产物后呈两条区带。比较两条区带的丰度或在引物5’端标记上放射性核素后，通过检测两条区带放射性强度即可测出目的基因的拷贝数。4/2/202445定量PCR是利用PC定量PCR定量方法有几种，最直接的是测定PCR产物中的标记核苷酸或引物量，但使用标记核苷酸会造成凝胶电泳时高背景，给测定带来困难。而标记引物法会产生引物二聚体和非特异性扩增，直接测定有时会产生假阳性结果。目前常用的是杂交技术，其中最常用的是同位素标记探针对PCR产物进行Southern杂交，然后对其放射活性进行测定。4/2/202446定量PCR定量方法有PCR反应比较灵敏，不少因素都会对结果产生影响。因此，在定量PCR时，要设内参照。参照基因与待测基因在同一反应试管内进行PCR扩增，目的基因和内参照基因的PCR产物在凝胶电泳上分开，起到校正作用。内参照有两种：一种是内源性的，此基因在许多细胞中都表达，且水平较恒定；另一种是外源性的，是人工合成的RNA或DNA，正常情况下不存在于待测样品中。4/2/202447PCR反应比较灵敏，不少因素都会对结果产生影差异显示PCR高等生物一般具有105个基因，但每个细胞或个体仅表达其中15%的基因，即约15000种mRNA，不同细胞间基因表达的差异决定了生命活动的多样性，如发育和分化、内环境稳定、细胞周期调节、衰老和死亡等。正常的代谢过程或病理变化，不管是由单基因控制还是由多基因体系控制，本质上都是基因表达改变所致。因此，比较研究细胞间基因表达的差异为我们揭示生命活动的规律提供了依据。4/2/202448差异显示PCR高等生物一般具

差异显示PCR就是一种筛选和克隆受发育、突变各种因素影响下差异表达基因的方法。首先将所要比较的两种mRNA样品逆转录生成cDNA第一链，然后利用3’锚定引物和5’随机引物进行PCR反应。

一个理想的显示技术应具备两个最基本的条件：（1）重复性好；（2）便于分离与鉴定。4/2/202449差异显示PCR就是一种筛选和克隆受发育、突变为了体现上述两个基本条件，合成两组引物，通过随机组合，使15000种mRNA均有扩增机会，并显示出清楚的电泳带。利用真核生物mRNA都有3’端的poly(A)，而在poly(A)前面的两个碱基只有倒数第二位可为A，即：——AAAAAAAAAAAAAAAAAA的特点，把mRNA3’端引物设计成T12MN（M）不能为T，共有12种引物，分别对总RNA进行反转录，把mRNA分成12等份，每份将获得1/12的cDNA亚群。再用随机引物对cDNA亚群进行PCR扩增，得到能在测序胶上分辨的条带，电泳后可以发现细胞群体中有差异的cDNA片段，这此有差异的片段就是差异表达基因的cDNA。4/2/202450为了体现上述两个基本条件，合成两组引物，通过完整工作程序4/2/202451完整工作程序4/1/202451重组PCR通过设计两对部分重叠引物，将两个基因分别进行PCR扩增。混合两种PCR扩增产物，经变性和复性，两组PCR产物通过互补序列发生粘连，其中一条重组杂合链可在PCR条件下发生延伸反应产生睛个包含两个不同基因的重组基因用重组PCR技术进行基因融合可组建天然基因、合成基因及突变基因等。

4/2/202452重组PCR通过设计两对部重组PCR方法示意图5’4/2/202453重组PCR方法示意图5’4/1/PCR扩增产物的分析凝胶电泳分析法：PCR产物可通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，后者灵敏度远高于前者，但配制方法复杂，故常用前者。在配制琼脂糖时加入0.5μg/ml的溴化乙锭（EB）或电泳后凝胶用同样浓度的EB染色20min，去离子水漂洗两次，每次15min，于UV灯下观察结果。

4/2/202454PCR扩增产物的分析凝胶电泳分析法：PCR产物可通过琼脂糖PCR扩增产物的电泳分析琼脂糖凝胶电泳常用于临床检测（定性）聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中可用于科研及检测分析4/2/202455PCR扩增产物的电泳分析琼脂糖凝胶电泳4/1/202455琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等4/2/202456琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分凝胶浓度选择琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围4/2/202457凝胶浓度选择琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)电泳缓冲液

常用三种缓冲液Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解4/2/202458电泳缓冲液常用三种缓冲液4/1/20245810×TBE缓冲液的配制配方Tris108克EDTA9.3克硼酸55克H2O至1000mlpH应为8.0～8.2临用时用水稀至0.5×TBE（20倍稀释）4/2/20245910×TBE缓冲液的配制配方4/1/202459核酸电泳的指示剂指示剂：溴酚兰二甲苯青溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性DNA片段琼脂糖凝胶浓度0.6%1%1.4%2%迁移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb4/2/202460核酸电泳的指示剂指示剂：琼脂糖凝胶浓度0.6%1%1.4%2核酸电泳的指示剂二甲苯青：水溶液呈兰色，电泳时，其迁移速率与双链线性DNA大致相当琼脂糖凝胶浓度1%1.4%迁移率2Kb1.6Kb4/2/202461核酸电泳的指示剂二甲苯青：水溶液呈兰色，琼脂糖凝胶浓度1%1载样缓冲液指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液作用：①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内②在电泳中形成肉眼可见的指

示带，可预测核酸电泳的速度和位置③使样品呈色，使加样操作更方便4/2/202462载样缓冲液指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液核酸电泳的染色剂最常用的染色剂溴化乙锭银染色4/2/202463核酸电泳的染色剂最常用的染色剂4/1/202463核酸电泳的染色剂溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般>5ng溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察4/2/202464核酸电泳的染色剂溴化乙锭（ethidiumbromide，核酸电泳的染色剂银染色：银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色灵敏度比EB高200倍，但银染色后，DNA不宜回收4/2/202465核酸电泳的染色剂银染色：银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸电泳电泳装置电泳仪电泳槽灌胶模具等4/2/202466电泳电泳装置4/1/202466电泳槽水平平板垂直平板4/2/202467电泳槽水平平板4/1/2024674/2/2024684/1/2024684/2/2024694/1/2024694/2/2024704/1/202470电泳方法用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶，一般200～400bp的DNA片段（可配制1.2～1.7%）4/2/202471电泳方法用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架电泳方法

配制琼脂糖凝胶及倒胶0.5×TBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化，冷却至60℃(需要时可加入EB)，倒入电泳槽中，待凝固向电泳槽中倒入0.5×TBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子（如样品孔内有气泡，应除去）4/2/202472电泳方法

配制琼脂糖凝胶及倒胶0.5×TBE电泳缓冲液1004/2/2024734/1/202473电泳方法

上样与通电在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为1—5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳，一般200～400bp的PCR产物50V电压，电泳20～40min4/2/202474电泳方法

上样与通电在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液电泳方法

结果观察紫外仪上观察电泳带及其位置并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小4/2/202475电泳方法

结果观察紫外仪上观察电泳带及其位置4/1/2024聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析其装载的样品量大，回收DNA纯度高，长度仅相差0.2%（即500bp中的1bp）的核苷酸分子即能分离4/2/202476聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的D聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED（N，N，N，N‘一四甲基乙二胺）和过硫酸铵的作用下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N，N'一亚甲双丙烯酰胺参与下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的4/2/202477聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED（N，N，N不同浓度丙烯酰胺和DNA有效分离范围

丙烯酰胺（%）有效分离范围（bp）溴酚兰*二甲苯青*3.5100～20001004605.080～500652608.060～4004516012.040～200307015.025～150156020.010～10012454/2/202478不同浓度丙烯酰胺和DNA有效分离范围丙烯酰胺有效分离范围（材料电泳仪器：电泳仪垂直电泳槽及其附件.30%丙烯酰胺丙烯酰胺，29克N，N‘一亚甲基双丙烯酰胺，1克H2O，加至100ml

装于棕色瓶内，4℃可保存二个月4/2/202479材料电泳仪器：4/1/202479材料10%过硫酸铵过硫酰铵，1克，加水至10ml

4℃可保存一周，-20℃可保存一个月1×TBE电泳缓冲液TEMED（四甲基乙烯基二胺）4/2/202480材料10%过硫酸铵4/1/202480聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳配胶：根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出将装好的玻璃电泳板倾斜成45～60℃角按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止4/2/202481聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳配胶：根据分离DNA片段的大小及需聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿下产生气泡，用一有力

的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将玻璃板斜靠在物体上，使成10°角，可减少液体泄漏的机会室温聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽中，上紧，倒入0.1×TBE缓冲液4/2/202482聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳立即插入适当的梳子，密切注意防止梳聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔，因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型不规则将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加到样品孔内，加样时不要产生气泡4/2/202483聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳电泳毕，切断电源，取出胶床板，小心移去一块玻璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上，浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶液中，15～30min后取出水洗，紫外仪下观察结果聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出>10ng以上量的DNA条带（要求更高的灵敏度，可用银染）4/2/202484聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳接好电极，电压为1-8V/cm，进4/2/2024854/1/2024854/2/2024864/1/202486酶切分析根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶进行酶切酶切产物电泳分离后，获得符合理论的片段此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究4/2/202487酶切分析根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶进行酶分子杂交检测PCR产物特异性的有力证据检测PCR产物碱基突变的有效方法主要的杂交Southern印迹杂交斑点杂交4/2/202488分子杂交检测PCR产物特异性的有力证据4/1/202488Southern印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链并作标记（探针）与PCR产物杂交此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。4/2/202489Southern印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链并4/2/2024904/1/2024904/2/2024914/1/2024914/2/2024924/1/202492斑点杂交：将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼龙膜薄膜上寡核苷酸探针杂交观察有无着色斑点主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析4/2/202493斑点杂交：将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼龙膜薄膜上4/14/2/2024944/1/2024944/2/2024954/1/2024954/2/2024964/1/2024964/2/2024974/1/202497PCR扩增产物的分析斑点杂交分析法：将PCR扩增产物固定于硝酸纤维素滤膜上，再用放射性或非放射性标记物标记的与产物部分或全长核苷酸序列的探针进行杂交。本法检测灵敏度高且有助于检测突变DNA的突变类型，常用于人类遗传病诊断和某些基因的分析。常规使用时，用非放射性标记的寡核苷酸探针分析PCR产物，更加安全。4/2/202498PCR扩增产物的分析斑点杂交分析法：将PCR扩增产物固定于PCR扩增产物的分析微孔板杂交法：夹心杂交法：将捕获探针固定于微孔板上后，与PCR扩增产物杂交，然后再用标记的检测探针与产物的另一区域杂交，漂洗后观察结果；直接将特异探针固定于微孔板上，然后用标记的PCR产物与其进行杂交后观察结果。4/2/202499PCR扩增产物的分析微孔板杂交法：4/1/202499PCR扩增产物的分析微孔板杂交的基本过程包括：DNA固定、探针的杂交和酶联显色。关键在于DNA的固定。盐浓度合适时DNA一端被固定在微孔板上，盐浓度过高或过低都可使DNA平躺固定于孔内而影响杂交。要用一系列盐浓度进行摸索以选择最佳盐浓度。4/2/2024100PCR扩增产物的分析微孔板杂交的基本过程包括：DNA固定、PCR扩增产物的分析试剂：固定液：10mmol/L磷酸钠10mmol/LEDTA,pH7.0合适浓度的NaCl漂洗液：PBS0.5%Tween204/2/2024101PCR扩增产物的分析试剂：4/1/2024101PCR扩增产物的分析操作方法（1）待固定DNA100℃加热变性5