重组DNA技术的基本工具学历案下学期高二生物人教版选择性必修三

重组DNA技术的基本工具预习案基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。思考·讨论

基因工程的遗传学原理是基因重组。基因工程没有（选填“有”、“没有”）创造新基因，有（选填“有”、“没有”）创造了新的基因型，没有（选填“有”、“没有”）创造新物种。思考·讨论

1972年，美国斯坦福大学的伯格(PaulBerg,1926)等人把一种猿猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA分子连接起来，产生了一种新的重组DNA分子。这是世界上第一个重组DNA分子。1973年，科恩(StanleyCohen,1935)和博耶(HerbertBoyer,1936)等人把两个不同质粒的DNA拼接起来，构成一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，使转入的基因表达，第一次完整地建立起了基因克隆体系，被称为基因工程诞生的里程碑。对DNA如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？

“工欲善其事，必先利其器”。在培育转基因大肠杆菌时，首先要在体外对含有所需要基因的DNA分子进行“切割”、改造和“拼接”；然后，将重组DNA分子导入受体细胞内，并使其在细胞中表达。实现这一精确的操作过程至少需要三种“分子工具”，即准确切割DNA分子的“分子手术刀”——限制性内切核酸酶、将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”——DNA连接酶，以及将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”——载体。科学家正是靠这三种必需的工具(如图),才使培育转基因大肠杆菌这一奇妙构想变成了现实。图

重组DNA技术所需的三种基本工具示意图一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶(restrictionendonuclease)，又称限制酶(restrictionenzyme)。1.来源这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。迄今分离的限制酶有数千种，许多已经被商业化生产。2.

功能它们能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。（内切的含义：从中间切开，不是从边缘一个个切断。）图

双链DNA的结构和磷酸二酯键的位置示意图（关注：单链方向以及磷酸二酯键的位置）

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磷酸二酯键是一种化学基团，指一分子磷酸与两个醇（羟基）酯化形成的两个酯键。磷酸二酯键成了两个醇之间的桥梁。例如前一个核苷酸的羰基中的3'碳上的—OH（羟基）和后一个核苷酸的5'—磷酸基形成酯键，此处的磷酸基同时与前后两个羟基形成酯键，故称磷酸二酯键。依次连下去，形成多核苷酸链。3.

剪切结果大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。例如，EcoRI、SmaI限制酶的识别序列均为6个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端

(如图)。当限制酶在它识别序列的中心轴线(图中虚线)两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端（指单链末端）；当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。图

限制酶切割DNA分子产生两种不同末端的示意图(箭头表示酶的切割位置)思考·讨论

你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？限制酶会不会剪切细菌本身的DNA?查阅资料寻找原因。原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。不会，细菌DNA缺乏特定的核苷酸序列,或修饰（如甲基化）可以被识别的碱基序列,故限制酶无法识别这些DNA,不能剪切。二、DNA连接酶——“分子缝合针”将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子，是靠DNA连接酶来完成的。1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够将两个DNA片段连接起来的酶，称之为DNA连接酶(DNAligase)。1.

功能：连接具有相同黏性末端或平末端的DNA分子，恢复核苷酸之间的磷酸二酯键。（当能发生碱基互补的末端聚集在一起，温度下降后，即可自行形成氢键）图

限制酶和DNA连接酶的作用示意图思考·讨论

DNA连接酶需要在一条DNA链的3'末端具有一个游离的羟基(OH),在另一条DNA链的5'末端具有一个磷酸基团(P),只有在这种情况下，才能发挥其连接DNA分子的作用，形成新的磷酸二酯键。微阅读

值得注意的是，DNA连接酶并不能连接两条单链的DNA分子，被连接的DNA分子必须是双螺旋的一部分。实际上，DNA连接酶封闭的是双螺旋DNA分子的缺口(nick),即在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂。2.分类：根据酶的来源不同，可分为两类。种类来源作用E.

coli

DNA连接酶大肠杆菌只能连接双链DNA片段互补的黏性末端。T4

DNA连接酶T4噬菌体既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以连接双链DNA片段的平末端，但连接平末端的效率较低。思考·讨论

DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？不是一回事。虽然DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化磷酸二酯键形成的酶，但两者存在显著的区别。(1)DNA聚合酶只能催化单个核苷酸加到已有的核酸片段3'末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是催化单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。(2)DNA聚合酶以一条DNA链为模板，催化形成与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶催化具有互补黏性末端或平末端的DNA片段连接起来，它不需要（选填“需要”、“不需要”）模板。此外，两者虽然都是蛋白质，但它们的组成和性质各不相同。归纳：与DNA相关的五种酶的比较:名称作用部位作用结果限制酶磷酸二酯键将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键将两个DNA片段（双链）连接为一个DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键将双链DNA分子局部解旋为单链,形成两条长链三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”怎样才能将外源基因送入细胞呢?通常是利用质粒(plasmid)作为载体(vector)，将基因送入细胞。1.

作用：作为运载工具，将目的（外源）基因转移到宿主细胞中去。也可以利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制。2.

种类：质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别。3.质粒相关问题（1）定义：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。（2）作为载体的特点：质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中。携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。这些质粒上常有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选(如图)。图

大肠杆菌及质粒结构模式图归纳：作为载体的质粒应具备的特点特点相关说明一个或多个限制酶的切割位点供外源DNA片段插入其中。且这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活能在受体细胞中复制自我复制（含一个复制原点），或整合到受体细胞DNA上同步复制含有标记基因便于重组DNA分子的筛选安全的对受体细胞无害；不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去大小应适合以便提取和在体外进行操作，太大不便操作注：天然的质粒很难能满足以上全部条件。基因工程操作中用的质粒多数是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。思考·讨论

根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。1.应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择PstⅠ;不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。2.为避免目的基因及质粒自身环化、正向连接、反向连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因所在片段和质粒(双酶切),如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。3.切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因,即至少要保存一个标记基因,以用于重组DNA的筛选,如图乙中的质粒不能使用SmaⅠ切割。4.如果使用两种识别序列不同、但黏性末端相同的限制性内切核酸酶分别切开目的基因和载体,两者连接后，对于得到的重组DNA分子还能否用相应的限制性内切核酸酶从中重新“卸下”目的基因呢？不能。思考·讨论

如图为四种限制酶BamHⅠ,EcoRⅠ,HindⅢ以及BglⅡ的辨识序列。箭头表示每一种限制酶的特定切割部位。1.其中BamHⅠ和BglⅡ限制酶所切割出来的DNA片段末端可以互补黏合，其末端互补序列为GATC。2.现有一种限制酶X的识别序列和酶切位点是

,则用此酶还能和图中哪种酶的识别序列进行连接?BamHⅠ和BglⅡ。（不同的限制酶切割可以产生相同的黏性末端,只要切下的游离碱基互补即可互补黏合）思考·讨论

下列科尔学发展史，哪些为基因工程发展奠定了理论基础：①②③④⑤⑥⑦⑧。结合基因工程的相关工具研究，可以看出：基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。①19世纪，在发现蛋白质的基础上，1869年瑞士生物学家米歇尔首次从细胞核中分离得到了DNA。②1944年，艾弗里(O.Avery,18771955)等人通过肺炎链球菌的转化实验,不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。③1950年，埃德曼(P.V.Edman,19161977)发明了一种测定氨基酸序列的方法。2年后，桑格(F.Sanger,19182013)首次完成了对胰岛素氨基酸序列的测定。④1953年，沃森(J.D.Watson,1928)和克里克(F.Crick,19162004)建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。⑤1958年，梅塞尔森(M.Meselson,1930)和斯塔尔(F.W.Stahl,1929)用实验证明了DNA的半保留复制。随后不久，克里克提出中心法则。⑥1961年，布伦纳、雅各布和梅瑟生发现了mRNA。⑦1961年，尼伦伯格(M.W.Nirenberg,19272010)和马太(J.H.Matthaei,1929)破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年,64个密码子均被成功破译。⑧1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。图

基因工程的理论基础和技术支撑（过渡：这些复杂的发现我们高中生很难能够亲身体验到，但是教材安排了一个我们能够实现的实验，来体验基因工程得以成功的前提。）

四、探究·实践：DNA的粗提取与鉴定1.实验原理DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。例如，DNA不溶于（选填“溶于”、“不溶于”）酒精，某些蛋白质溶于（选填“溶于”、“不溶于”）酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2

mol/L的NaCl溶液。在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。2.目的要求（1）了解DNA的物理和化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。（2）学会DNA粗提取的方法以及用二苯胺试剂对DNA进行鉴定。3.材料用具（1）材料:新鲜洋葱(也可以选择香蕉、菠菜、菜花和猪肝等作为实验材料，提取DNA的方法可能稍有不同)、研磨液、体积分数为95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。研磨液和二苯胺试剂的配制方法参见教材附录2。注：二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。我们学习过的实验试剂需要现配现用的还有斐林试剂。其中，需要水浴加热的有斐林试剂和二苯胺试剂。（2）用具:烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。4.方法步骤（1）称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。（2）在漏斗中垫上纱布，将研磨洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可以直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min,再取上清液放入烧杯中。（3）在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2