高效液相色谱原理第一讲

关于高效液相色谱原理第一讲1.什么是色谱?色谱是色谱法的简称(又叫色层法,层析法),其本质是一种分离分析方法常见的分离方法蒸馏离心电泳过滤色谱(目前最有效的分离方法)一、色谱概述第2页,共56页，2024年2月25日，星期天2.色谱法简介色谱法(Chromatography)溯源

100多年前俄国植物学家Tswett分离植物色素时采用的实验方法

他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带

Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验方法，即现在的Chromatography(色谱法)第3页,共56页，2024年2月25日，星期天第4页,共56页，2024年2月25日，星期天3.色谱法的发展色谱法是一种现代的分离方法

1906年正式命名20世纪30年代开始广泛研究和应用高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代第5页,共56页，2024年2月25日，星期天4.色谱法原理色谱法的原理利用混合物中各组份在不同的两相(流动相、固定相）中溶解,分配,吸附等化学作用性能的差异,当流动相中所携带的混合物流过固定相时，就会和固定相发生作用(力的作用)。由于混合物中各组分在性质和结构上有差异，与固定相发生作用的大小也有差异。因此，在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出。两相中有一相是固定的,叫作固定相(StationaryPhase),有一相是流动的,称为流动相(MobilePhase),流动相又叫洗脱剂,溶剂第6页,共56页，2024年2月25日，星期天相(Phase):

物理化学术语,特指在某一系统中,具有相同成分及相同物理、化学性质的均匀物质部分。各相之间有明显可分的界面。第7页,共56页，2024年2月25日，星期天

分离分离是一个物理过程。固定相(StationaryPhase)流动相(MobilePhase)进样(Injection)洗脱(Elution)相互作用(Interaction)第8页,共56页，2024年2月25日，星期天Temporalcourse淋洗液色谱分离第9页,共56页，2024年2月25日，星期天5.色谱法的分类(1)按分离过程的机理分:吸附色谱(AbsorptionChromatography)根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离分配色谱(PartitionChromatography)分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同离子交换色谱(IonExchangeChromatography)根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱(IC)第10页,共56页，2024年2月25日，星期天GPC(GelPermeationChromatography)

固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂

GFC(GelFiltrationChromatography)

固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液利用多孔性物质对不同大小的分子的排阻作用进行分离的方法

体积排除色谱(SizeExclusionChromatography)

亲和色谱利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。第11页,共56页，2024年2月25日，星期天(2)按流动相的物态分:气相色谱(GasChromatography,GC)

用气体作为流动相(又叫载气)液相色谱(LiquidChromatography,LC)

用液体作为流动相(又叫洗脱剂)(3)按固定相的形态分:平面色谱纸色谱薄层色谱柱色谱第12页,共56页，2024年2月25日，星期天色谱法分类示意图第13页,共56页，2024年2月25日，星期天二、高效液相色谱(HPLC)HPLC的产生

HPLC的固定相

HPLC的流动相第14页,共56页，2024年2月25日，星期天1.HPLC的产生液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法柱效低、时间长(常有几个小时)。第15页,共56页，2024年2月25日，星期天高效液相色谱法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上,于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀,小颗粒具有高柱效,但会引起高阻力,需用高压输送流动相,故又称高压液相色谱法(HighPressureLiquidChromatography，HPLC).因分析速度快而又称为高速液相色谱法(HighSpeedLiquidChromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。第16页,共56页，2024年2月25日，星期天HPLC是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段

高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵敏度检测器…广泛应用于各个领域:医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业…无论在技术上,理论上,还是在应用上仍有较大的发展空间第17页,共56页，2024年2月25日，星期天2.高效液相色谱的固定相(1)固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0

108～1.0

109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5

108Pa。第18页,共56页，2024年2月25日，星期天表面多孔型固定相它的基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。(2)固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型两类。多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达到平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受到限制。第19页,共56页，2024年2月25日，星期天全多孔型固定相由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗粒细(5～10

m)，孔仍然较浅，传递速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及衡量分析。第20页,共56页，2024年2月25日，星期天3.液相色谱的流动相(1)流动相特性液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况.亲水性固定相常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。

第21页,共56页，2024年2月25日，星期天(2)流动相类别

按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。第22页,共56页，2024年2月25日，星期天(3)流动相选择在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。溶剂的极性越高，则保留时间缩短，通过改变流动相的极性可以得到理想的保留时间。常用溶剂的极性顺序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)。第23页,共56页，2024年2月25日，星期天(4)流动相的要求流动相是液体，它对组分有亲合力，并参与固定相对组分的竞争，因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：溶剂对于待测样品，须具有合适的极性和良好的选择性。溶剂与检测器匹配①对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。(所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量)。②对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。第24页,共56页，2024年2月25日，星期天高纯度由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。化学稳定性好低粘度(粘度适中)若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离①常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；②但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。第25页,共56页，2024年2月25日，星期天(5)选择流动相时应注意的几个问题尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。第26页,共56页，2024年2月25日，星期天按分离机制的不同分为：吸附色谱法分配色谱法交换色谱法（离子）体积排阻色谱法亲和色谱法三、几种主要的HPLC第27页,共56页，2024年2月25日，星期天(一)吸附(液-固)色谱基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸。固定相：固体吸附剂为硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。应用：适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。第28页,共56页，2024年2月25日，星期天基本原理：利用试样各组分在固定相和流动相上的分配比例不同而分离。在固定相上分配多的组分（分配系数高）后出峰，分配少（分配系数低）的先出峰。流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相normalphase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相reversephase）。正相与反相的出峰顺序相反；固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。(二)分配（液-液）色谱第29页,共56页，2024年2月25日，星期天(三)离子交换色谱基本原理：组分在固定相上发生反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长。阳离子交换：R-SO3H+M+=R-SO3M+H+

阴离子交换：R-NR4OH+X-=R-NR4X+OH-

固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂。流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液。应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等第30页,共56页，2024年2月25日，星期天阳离子交换分离机理ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＨＣＯ３－Ｃｌ－ＳＯ４２－Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－TemporalcourseＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＨＣＯ３－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋第31页,共56页，2024年2月25日，星期天

ＳＯ３－ＳＯ３－ＳＯ３－ＳＯ３－Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３Ｎ＋Ｒ３阴离子交换分离机理５μm＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋第32页,共56页，2024年2月25日，星期天(四)体积排阻色谱固定相：具有一定大小孔隙的凝胶；原理：借助多孔性凝胶孔径的大小，使样品中的大分子不能进入凝胶孔洞而完全被排阻，只能沿凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱，而首先被洗脱出来。被分析样品可按分子的相对大小分别先后流出。第33页,共56页，2024年2月25日，星期天(五)亲和色谱

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留.改变淋洗液后洗脱。第34页,共56页，2024年2月25日，星期天按分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较具有锁匙结构络合物的可逆性离解

多孔凝胶的渗透或过滤

可逆性的离子交换

吸附与解吸

分离原理

不同pH值的缓冲溶液，加入改性剂

有机溶剂或一定pH值的缓冲溶液

不同pH值的缓冲溶液

不同极性有机溶剂

流动相

多种不同性能的配位体键联在固相基体上

具有不同孔径的多孔性凝胶

高效微粒离子交换剂

溶解与挥发

不同极性有机溶剂和水

固定液载在固相基体上

全多孔固体吸附剂

固定相

亲和色谱体积排阻色谱离子色谱分配色谱吸附色谱相\色谱第35页,共56页，2024年2月25日，星期天四、HPLC特点、流程及主要部件

特点流程主要部件第36页,共56页，2024年2月25日，星期天HPLC仪器（1）第37页,共56页，2024年2月25日，星期天液相色谱仪（2）第38页,共56页，2024年2月25日，星期天液相色谱仪（3）第39页,共56页，2024年2月25日，星期天液相色谱仪（4）第40页,共56页，2024年2月25日，星期天1.HPLC的特点

分离效能高选择性能高检测灵敏度高分析速度快第41页,共56页，2024年2月25日，星期天2.流程第42页,共56页，2024年2月25日，星期天色谱的基本流程图淋洗液高压泵分离柱检测器泵液分离检测记录进样器抑制器检测器进样第43页,共56页，2024年2月25日，星期天3.主要部件

输液泵(高压)

梯度淋洗器(装置)

进样器(装置)

分离器(柱)

检测器(装置)

结果记录器(计算机及软件)第44页,共56页，2024年2月25日，星期天(1)高压输液泵主要部件之一，压力：150～350×105Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性第45页,共56页，2024年2月25日，星期天(2)梯度淋洗装置外梯度(低压梯度):一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。梯度:不同溶剂的比例.

通过设置不同溶剂之间的比例(梯度)使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。内梯度(高压梯度):两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。第46页,共56页，2024年2月25日，星期天(3)进样装置(器)流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置.有手动与自动进样两种。第47页,共56页，2024年2月25日，星期天(4)检测器(装置)特点：应用广，对大部分有机化合物有响应;灵敏度高(10-9g)；线形范围高；A.紫外检测器(UltravioletDetector,UVD)原理：用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率的变化来测定样品浓度.对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。第48页,共56页，2024年2月25日，星期天常用紫外吸收检测器