2023-2024学年高二下学期生物人教版选择性必修三3-2DNA片段的扩增及电泳鉴定导学案

高二生物学案选择性必修三循序渐进，循序渐进，再循序渐进！班级姓名DNA片段的扩增及电泳鉴定【学习目标】了解PCR和电泳鉴定的基本原理2、尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物【学习重点、难点】PCR和电泳鉴定的基本原理和操作过程课前自主学习一、PCR技术1.利用PCR可以在迅速扩增的技术。PCR利用了，通过调节来控制DNA双链的解聚与结合。2.PCR条件①原料：。②模板：解旋后的两条DNA母链。③酶：。④引物：分别与相结合的引物。⑤其他条件：需要稳定的溶液和能自动调节温度的温控设备即仪等。过程温度主要变化变性℃以上双链DNA解旋为复性℃左右通过碱基互补配对分别与结合延伸℃左右溶液中的四种脱氧核苷酸()在的作用下，根据原则合成新的DNA链3.PCR过程二、电泳1.概念和原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的下，这些基团会带上或，在的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷的电极移动。2.方法：3.作用：在凝胶中DNA分子的迁移速率与、和等有关。凝胶中的DNA分子通过，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。4.电泳缓冲液配制：由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。一般用的电泳缓冲液PH是8，DNA分子带负电，向正极泳动。5.电泳缓冲液作用：在一定范围内，抵制酸或碱对溶液pH的影响，维持pH。三、DNA片段的扩增及电泳鉴定过程1.实验用具(1)PCR仪：该仪器能自动调控，实现DNA的扩增。(2)微量离心管：总容积为0.2mL或0.5mL，实际上是的场所。(3)微量移液器：用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体。(4)原料，引物，扩增缓冲液，电泳装置，电泳缓冲液，凝胶载样缓冲液，琼脂糖和核酸染料等。2.实验步骤（1）准备：用按照配方在中依次加入各组分；（2）离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在；（3）扩增反应：设置好PCR仪的循环程序，将装有放入中进行反应。配置琼脂糖溶液：根据待分离，用配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比为的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍，加入适量的混匀。（4）凝胶成型：将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具并插入合适大小的梳子，以形成。待凝胶溶液，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶为宜。（5）电泳检测：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。接通电源检测，待指示剂前沿迁移到接近凝胶边缘时停止，取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。3.注意事项(1)为等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行。(2)PCR所用的应分装成小份，并在储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上。(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须。所有成分都加入后，盖严离心管的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液，再放入中进行反应。课堂案一、PCR的反应过程1.PCR的条件（1）DNA（目的基因）模板。（2）分别与模板DNA相结合的两种引物。（3）A、T、G、C四种脱氧核苷酸。（4）耐高温的DNA聚合酶。（5）稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）。（6）能严格控制温度的温控设备。（PCR仪）2.PCR一般经过多少次循环，循环之前为什么要进行一次预变性？3.写出每次循环的步骤。二、实验操作1.什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？2.PCR扩增DNA过程中是否还需要解旋酶？为什么？3.PCR技术中需要的两种引物碱基序列相同吗？为什么？4.PCR循环过程中，变性温度设置95℃，时间设置30s的原因是什么？5.在PCR过程中，延伸的温度为什么控制在72℃？三、数量关系复制次数123nDNA分子数2482n含引物的DNA分子数2482n含其中一种引物的DNA分子数21-122-123-12n-1同时含两条引物的DNA分子数21-222-223-22n-2共消耗引物22-223-224-22n+1-2课后案检测1．PCR技术扩增DNA，需要的条件是()①模板NDA②引物③四种脱氧核苷酸④耐高温的DNA聚合酶⑤mRNA⑥核糖体A．①②③④B．②③④⑤C．①③④⑤D．①②③⑥2．下列有关PCR技术的叙述，不正确的是()A．PCR技术利用的是碱基互补配对原则B．PCR技术可用于基因诊断，判断亲缘关系等C．PCR技术需在体内进行D．PCR技术可分为变性、复性、延伸三个阶段3.对PCR的实验操作顺序的叙述，正确的是()A．准备→移液→混合→离心→反应B．准备→移液→离心→混合→反应C．离心→移液→混合→反应D．移液→离心→混合→反应4．标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是()A．92℃、55℃、72℃ B．72℃、55℃、92℃C．55℃、92℃、72℃ D．80℃、55℃、72℃5．PCR实验中用到微量离心管、缓冲液和蒸馏水，使用前必须进行的关键步骤是()A．反复洗涤B．用酒精擦洗C．高压灭菌 D．在－20℃保存6.PCR(聚合酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，如图表示合成过程。下列说法错误的是()A．A过程高温使DNA变性解旋，该过程不需要解旋酶的作用B．C过程要用到的酶在高温下失活，因此在PCR扩增时需要再添加C．如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，控制“95℃—55℃—72℃”温度循环3次，则在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占25%D．PCR中由碱基错配引起的变异属于基因突变7.利用PCR将某小段含目的基因的DNA分子扩增循环n次，则正确的是（）A．需要已知目的基因的全部序列以便设计引物B．共需2n+1-2个引物参与子代DNA分子的合成C．应向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶、缓冲液等D．理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占15/168.PCR一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链做模板时将()A．仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸B．无需与引物结合，在酶的作用下从头合成子链C．同时与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合进行子链延伸D．与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸9．PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行研究的问题，而被广泛应用，与细胞内的DNA复制相比，PCR可以快速扩增所需的DNA片段，请分析回答下列有关问题：(1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中的解旋原理____________。(2)与体内DNA复制相比较，PCR反应要在________________中才能进行，并且要严格控制________条件。上述两个解旋过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的。(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是。(4)PCR中加入的引物有________种，加入引物的作用是_____________________。10．在进行DNA亲子鉴定时，需大量的DNA．PCR技术（聚合链式反应）可以使样品DNA扩增，获得大量DNA克隆分子。该技术的原理是利用DNA的半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制（如图1，图中黑色长方形是引物）。（1）PCR需要模板DNA、引物、_______________和____________等条件，其中的引物实质上是一种_________________。（2）图中的变性、延伸分别是指、。（3）假设PCR反应中的DNA模板为P，第一轮循环的产物2个子代DNA为N1，第二轮循环的产物4个子代DNA为N2，N1、N2中含有模板DNA单链的DNA分别有个、个。（4）若图2为第一轮循环产生的产物，请绘出以a链和b链为模板经PCR扩增的产物DNA片段的扩增及电泳鉴定课前案一、1.体外DNA片段DNA的热变性原理温度2.4种脱氧核苷酸加热变性耐热的DNA聚合酶两条模板链两种缓冲PCR仪3.90单链50两种引物两条单链DNA72A，T，G，CDNA聚合酶碱基互补配对二、1.PH正电荷负电荷电场相反2.琼脂糖凝胶电泳法3.凝胶的浓度、DNA分子的大小构象染色5.稳定三、1.(1)温度(2)进行PCR反应2.微量移液器微量离心管离心管底部反应液的微量离心管PCR仪DNA片段的大小电泳缓冲液0.8%-1.2%冷却后核酸染料加样孔完全凝固1mm3.(1)避免外源DNA高压灭菌(2)缓冲液和酶-20℃缓慢融化(3)更换混合均匀集中在离心管底部PCR仪课堂案一、3.每次循环的都要经过变性、复性和延伸二、1.所谓引物是指两段与待扩增的DNA序列互补的一小段DNA或RNA片段。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此克隆DNA时应加入两种引物。2.不需要。PCR反应是加热至90℃以上时，双链全部解开，不需解旋酶。3.不同。由于DNA两条模板链中碱基序列并不相同，引物需要分别与两条模板链进行碱基互补配对，因此DNA两条模板链在进行扩增时，需要的引物碱基序列是不同