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文档简介

关于细菌与噬菌体的遗传重组分析

细菌和病毒在遗传研究中的优越性第2页,共84页,2024年2月25日,星期天

第3页,共84页,2024年2月25日,星期天

第4页,共84页,2024年2月25日,星期天第一节细菌的遗传分析一、细菌遗传的研究方法二、遗传分析转化(Transformation)接合(Conjunction)性导(Sexduction)转导(Transduction)第5页,共84页,2024年2月25日,星期天一、细菌遗传的研究方法

理化诱变:1、合成代谢功能的突变型(营养缺陷型):

ade+

ade-

his

his-2、分解代谢功能的突变型:

lac+

lac-(乳糖)gal+

gal-(半乳糖)3、抗性突变型:3.1抗药性:str+

str-(链霉素)azi+

azi-(叠氮化物)3.2抗噬菌体:T2s(+)T2r(-)tonAs

tonAr

(T1)第6页,共84页,2024年2月25日,星期天第7页,共84页,2024年2月25日,星期天细菌生活条件:基本培养基(BasalMedium):无机盐:SO42-、NO3-、

Ca2+、Mg2+

糖:葡萄糖、蔗糖维生素:生物素、Vbs

仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基

完全培养基:

BM+全部营养物质凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或者半天然培养基选择培养基:

凡是只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基原养型、营养突变型、条件致死突变型p206

第8页,共84页,2024年2月25日,星期天

试验方法:

Lederbergetal.1952

第9页,共84页,2024年2月25日,星期天二、遗传分析(1)发现:

1928,Griffith:肺炎双球菌转化实验

1944,Avery:转化子-DNA

转化是细菌基因重组的方法之一。(2)概念:

细菌吸附游离态的外源双链DNA,将单链DNA分子吸收进入细胞后,不经过复制整合到细菌染色体中,并发生遗传重组的过程。

1、转化(Transformation)p213第10页,共84页,2024年2月25日,星期天(3)转化DNA(转化子)的特点:

a.DNA浓度与转化子数目的关系饱和:50/cell,原因:在细菌的细胞壁或细胞膜上有固定数量的DNA接受座位,故一般细菌摄取的DNA分子数小于10个。

b.DNA片段大小:不能太小:肺炎双球菌转化:DNA片断至少有800个碱基对;枯草杆菌的转化:DNA片断至少有16000个碱基对。

c.双链吸附:单链DNA不被转化

d.单链进入细菌。DNA浓度转化子数目第11页,共84页,2024年2月25日,星期天(4)受体细胞的特点

a.感受态:

DNA合成刚刚停止、蛋白质合成继续活跃,活跃合成的蛋白质可使细菌细胞壁易于接受转化DNA。只有感受态的受体细胞才能摄取并转化外源DNA,而这种感受态也只能发生在细菌生长周期的某一时间范围内。

b.感受态的本质:部分原生质化:10/cell

酶受体:

第12页,共84页,2024年2月25日,星期天(5)转化过程:①.双链结合与单链穿入:

双链DNA分子结合在接受座位上。可逆,可被DNA酶降解,接受座位饱和性;单链DNA摄取,不可逆,不受DNA酶破坏。穿入后,由外切酶或DNA移位酶降解其中一条链。②.联会:

DNA片段与细菌染色体部分联会。亲缘关系越远,联会越小、转化可能性越小。③.整合(重组):单链的转化DNA与受体DNA对应位点的置换,从而稳定地参入到受体DNA中。第13页,共84页,2024年2月25日,星期天(6)转化成功:感受态、吸附、整合。(7)转化与基因重组作图:

第14页,共84页,2024年2月25日,星期天2、接合(Conjugation)(1)概念:在原核生物中,遗传物质从供体-“雄性”转移到受体-“雌性”的过程。

DNA接触(供体donor)(受体receptor)第15页,共84页,2024年2月25日,星期天(2)发现与证实:a.发现:LederbergTatum(1946营养缺陷型)第16页,共84页,2024年2月25日,星期天b.证实转化作用的排除:

A(杀死)+B或者A+B(杀死)(无)

DavisU型管试验(无)

DNase处理(有)回复突变突变的排除:

单个基因回复突变频率=10-6

两个基因同时回复突变的频率=10-6×10-6=10-12<10-7两个菌株间需要直接接触才能形成原养型!

Lederberg和Tatum根据实验作解释,认为上述原养型是两个亲本品系基因的重组体。在E.coli中基因重组经一系列步骤进行:(1)细胞融合;(2)亲本细胞的遗传物质经过融合形成二倍体合子;(3)遗传物质发生交换的合子经过减数分裂产生了带有重组基因的子代细菌。第17页,共84页,2024年2月25日,星期天

上述的解释虽然比较正确,但其中有一点却被Hayes的一个意外发现所否定。Lederbery和Tatum认为两个亲本细菌在基因重组过程中起着同等作用-E.coli的性系统是同宗配合(homothallic)。

Hayes则证明:E.coli遗传物质的传递方式与具有典型减数分裂的生物不同。例如:两个亲本类型对后代的遗传贡献并不相等,有些亲本基因的组合会在后代出现,有一些则不会出现,而且所有后代中出现的基因都是连锁的,因此,E.coli的有性过程应该是异宗配合的(heterothallic)。c.本质(E.coli)遗传物质的单方向(one-way)转移

第18页,共84页,2024年2月25日,星期天Hayes做了一个杂交实验,用的品系与Lederbery和Tatum用的相似,即:

品系A:met-thr+Leu+thi+

品系B:met+thr-Leu-thi-

在杂交前,将品系A用高剂量的链霉素处理(链霉素并不立即杀死它们,只是阻碍细胞的分裂)①Streptomycin处理A×B

基本培养基(BM)

原养型重组体②对照A×BBM

原养型重组体

③A×streptomycin处理BBM无原养型重组体第19页,共84页,2024年2月25日,星期天(3)F因子:a.发现1952年:

W.Hayes试验证明:接合过程中,遗传物质单向转移,供体(donor)-♂A菌株受体(receptor)-♀B菌株1953年:

Hayes,Leaderberg&Cavalli:♂

有F因子♀

无F因子第20页,共84页,2024年2月25日,星期天b.F因子的遗传结构质粒:旧称附加体,是指独立于细菌染色体的可以独立、整合、环出、丢失含有少量基因的双链DNA环状分子F

因子(致育因子、性因子):是一种感染性质粒,由于F因子存在与否决定是否接合,又称为致育因子。F因子的遗传结构:图7-12根据F因子存在的方式,E.Coli可以分为4种菌株第21页,共84页,2024年2月25日,星期天F+HfrF+整合准确环出配对、交换准确环出丢失不准确环出F’F-携带1个基因~半条染色体第22页,共84页,2024年2月25日,星期天c.接合过程F+×F-

F++F+Hfr×F-

Hfr+F-复制:滚环模式第23页,共84页,2024年2月25日,星期天d.部分二倍体、交换与遗传重组cb+a+c+ba单交换I降解第24页,共84页,2024年2月25日,星期天(4)高频重组(highfrequenceyof

recombination,Hfr)第25页,共84页,2024年2月25日,星期天abdhgfce

1

2

3cdefghabI

1

2

3cdefghabefghabcdII

3

2

1ghabcdeffedcbahgF+HfrIII第26页,共84页,2024年2月25日,星期天细菌基因重组的特点:(1)F-细胞得到的只是供体细胞染色体的一部分,而F因子并没有发生转移;

(2)细菌基因重组是在部分二倍体中进行,只有偶数交换才产生有活性的重组体;

(3)相反的重组体不出现.第27页,共84页,2024年2月25日,星期天(a).E.coli染色体的中断杂交和遗传作图Wollman和Jacob的中断杂交试验

Hfr细菌的基因是按一定时间顺序依次地出现在受体细胞,因为基因位于染色体上,即Hfr染色体以线性方式进入细胞中。Hfr:thr+leu+azirtonrlac+gal+strsF-

:thr-leu-azistonslac-gal-strr每隔一段时间取样,人为中断杂交稀释菌液,防止再度配对涂布在含有str的基本培养基上Hfr

F-通气混合培养第28页,共84页,2024年2月25日,星期天将其影印培养到若干不同的选择培养基上,以分析Hfr菌株染色体上非选择标记基因进入F-细菌的顺序和所需时间

时间(分钟)基因频率Thr+8100(选择标记)leu+8100(选择标记)azir990tonr1170lac+1840gal+2525

同一个Hfr菌株的转移起始点和转移顺序在不同的杂交试验中都是一样的。该转移起始点称为原点(origin,O)第29页,共84页,2024年2月25日,星期天Oazitonlacgal09111825minO09111825120azitonlacgalFmin2、中断杂交技术(interruptedmatingtechnique)

根据供体基因进入受体细胞的顺序和时间绘制连锁图的技术。第30页,共84页,2024年2月25日,星期天

用不同的Hfr菌株进行中断杂交实验,都可做成连锁图,基因转移的顺序、转移起点和转移方向很不相同。

根据上图,可以得到直线连锁图;Hfr菌株足够多,可以获得整个E.coli染色体连锁图。例子:O

thithrprolacpurgalhisglythithrprolacpurOOOO第31页,共84页,2024年2月25日,星期天小结(作图步骤):(1)作直线连锁图,确定基因间距离及其染色体全长(分钟)。(2)画圆,根据染色体全长标示刻度,按照基因间距离标示基因。(3)标示Hfr起点、终点、菌株号。HfrAB312第32页,共84页,2024年2月25日,星期天b.重组作图法:

两基因转移时间间距小于2分钟时,中断杂交法的图距不精确,应采用传统的重组作图法。

利用Hfr菌与F-菌株杂交后,在部分二倍体中,若两基因相距越近,在重组体中同时出现的机会越多;两基因相距越远,在重组体中同时出现的机会越少。根据重组体中某一性状单独出现的频率作为两基因间的交换率,就可以进行基因定位。

例:紧密连锁二基因:

lac-(乳糖不发酵)ade-(腺嘌呤缺陷型)第33页,共84页,2024年2月25日,星期天Hfr:lac+ade+

strsF-

:lac-ade-strr在含有str无ade的基本培养基上培养选择ade+

strr的重组子Hfr

F-混合培养60min再在EMB培养基上选择哪些ade+strr的重组子为lac+

,哪些为lac-为何不用lac作为选择标记?第34页,共84页,2024年2月25日,星期天=交换型重组体数交换型重组体数+未交换型重组体数100%=lac-ade+

(lac+ade+)+(lac-ade+)100%请注意与计算真核生物重组值的区别某一性状单独出现的菌落数重组体总菌落数100%两基因间的交换率=两个位点间的时间约为1分钟,大约相当于20%的重组值=20%第35页,共84页,2024年2月25日,星期天lac-ade间发生交换l-a+srl+a+a-l-srsslac-ade间未发生交换l+a+a-l-srl+a+sr1、Hfr片段不能独立复制,未整合进入F-基因组中去则随细胞分裂而丢失;2、无ade的完全培养基上筛选出的菌落为lac+ade+

和lac-ade+,其中前者为两基因外双交换产物,lac和ade

基因并未发生重组,后者为两基因间重组产物;3、另一交换产物lac+ade-在上述培养基中不能筛选出,即便筛出也没意义,因为lac基因先于ade基因进入,而ade基因未进入而形成的交换产物,不能真实反映两基因间的交换频率;这也是为何选择ade为筛选基因的原因!4、只有在缺乏ade基因的完全培养基中筛选出的lac-ade+才是重组子;第36页,共84页,2024年2月25日,星期天第37页,共84页,2024年2月25日,星期天3.性导(Sexduction)概念:接合以F’因子为媒介将供体菌染色体DNA转移到受体细菌,形成部分二倍体的过程。第38页,共84页,2024年2月25日,星期天F’菌株的突出特点:

⑴F’因子转移基因的比率极高,如同F+因子的转移比率;

⑵F’因子的自然整合率极高,但是整合不是随机的,需要

经过配对整合到特定的座位上。第39页,共84页,2024年2月25日,星期天应用:(1)确定基因的显隐性关系(上图)。(2)绘连锁遗传图:原理:F+

不同的Hfr不同的F’距离近的基因容易环出到同一个F’因子上“并发性导”详尽的连锁图.

方法:同“并发转导”第40页,共84页,2024年2月25日,星期天性别细菌状态F因子状态♀F-无F因子♂F+F因子为游离状态♂HfrF因子整合到宿主染色体上♂F

带有部分宿主染色体的F因子,为游离状态1、细菌细胞的两种性别、四种状态:小结第41页,共84页,2024年2月25日,星期天2、F+、F-、Hfr、F'的关系转变关系F+F-丢失杂交F+Hfr整合到E.coli

染色体规则脱离E.coli

染色体F'Hfr

回复到Hfr染色体不规则脱离E.coli

染色体第42页,共84页,2024年2月25日,星期天F+×F-

低频重组Hfr×F+

高频重组F′×F+

一般为低频重组,但对所携带的基因是高频重组。3、重组频率区别第43页,共84页,2024年2月25日,星期天4.转导(Transduction)(1)概念:转导:是指以噬菌体为媒介将供体细菌DNA导入到受体细菌并发生遗传重组的过程。1/1000第44页,共84页,2024年2月25日,星期天转导颗粒:溶菌噬菌体末期,噬菌体装配过程中,外壳蛋白识别一定长度的DNA分子,形成成熟的子代噬菌体时,把寄主细菌的DNA片段“错误”地组装到外壳蛋白中而形成。由于感染细菌的能力决定于噬菌体外壳蛋白,所以转导颗粒具有和正常噬菌体相同的侵染能力。转导体:转导颗粒将供体细菌的染色体片段转移到受体细菌,重组后的受体细菌叫作转导体。第45页,共84页,2024年2月25日,星期天

黎德伯格(Leaderburg)与津德(Zinder)(1951)发现:鼠伤寒沙门氏菌中转导现象:将两个沙门氏菌的营养缺陷型进行杂交:

phe-try-tyr-met+his+×phe+try+tyr+met-his-

混合培养

phe+try+tyr+met+his+

基本培养基(10-5)

证实:a.10-5>10-12

(10-6×10-6)排除回复突变。

b.戴维斯U型管试验(防止细胞直接接触)也获得野生型重组体。排除由于接合或性导

c.DNase处理重组体。排除转化。

推测:某种过滤性因子(FA)可以穿过DavisU型管滤片。抗血清可以抑制重组体出现。P22噬菌体。(2)发现与证实:第46页,共84页,2024年2月25日,星期天(3)普遍性转导:概念供体细菌染色体组的任何部分都可以组装到转导颗粒中,从而可以转移到受体细菌中。(P1)第47页,共84页,2024年2月25日,星期天b.并发性导(co-transduction)与细菌作图合转导(并发转导、共转导):两个基因同时被包装到一个转导颗粒,从而一起重组到受体细菌的染色体上。二因子作图:供体受体合转导频率

a+

b+

a-

b-30%ab近

a+

c+

a-

c-35%ac近a在bc之间

b+

c+

b-

c-3%bc远三因子作图:供体受体合转导频率

leu+

thr+

azi+

leu-

thr-

azi-第48页,共84页,2024年2月25日,星期天实验1:

leuazithrazileuthr实验2:

azileuthr实验3:最大转导片段p227第49页,共84页,2024年2月25日,星期天

根据合转导频率推导基因之间的物理距离d-基因之间的物理距离(bp,kbp)L-转导DNA的平均长度(bp,kbp)X-两个基因合转导的频率第50页,共84页,2024年2月25日,星期天(4)特殊性转导(局限性转导)attatt

温和性噬菌体进行的转导,只能转导部分基因。第51页,共84页,2024年2月25日,星期天NRJANRAJNRRAJNRAJJARNJARNdgalbio+I

噬菌体DNA特异性整合到细菌染色体。II噬菌体DNA准确环出。III噬菌体DNA不准确环出

特殊性转导噬菌体的形成。

dgal/

dbio第52页,共84页,2024年2月25日,星期天

dgal+

E.coliUV50%+50%d

gal(5)高频转导(HFT)NRAJNRJNRAJNRA第53页,共84页,2024年2月25日,星期天第二节噬菌体的遗传分析一、噬菌体是一类病毒病毒(Virus):超显微、无细胞、活细胞专性寄生的大分子(微生物)特点:个体小:通过Davis滤器专性寄生:脱离活体无生命,无代谢无细胞:蛋白质+DNA(RNA)繁殖方式简单第54页,共84页,2024年2月25日,星期天2.分类:动物:球形、卵圆形寄主:植物:杆状、丝状细菌:蝌蚪状

双链DNA:λ,T2、4、6

单链DNA:ΦX类,动物病毒、噬菌体

单链RNA

双链RNA

植物病毒、艾滋病毒遗传物质:第55页,共84页,2024年2月25日,星期天烟草花叶病毒腺病毒T4噬菌体爱滋病病毒

RNADNADANRNA第56页,共84页,2024年2月25日,星期天二、噬菌体分类概念:原指细菌为寄主,后来推广到真菌的病毒。烈性噬菌体:P2、P4、P6、T系列(T1-T7)

2.温和性噬菌体:λ和P1第57页,共84页,2024年2月25日,星期天1.烈性噬菌体(1)形态结构(T偶列)第58页,共84页,2024年2月25日,星期天(2).繁殖和感染周期

(营养繁殖:噬菌体DNA不整合;150噬菌体/Cell)吸附细菌裂解释放出子代噬菌体颗粒细菌染色体降解蛋白质外壳包装DNA成子代噬菌体颗粒第59页,共84页,2024年2月25日,星期天2.温和噬菌体:(1)形态结构第60页,共84页,2024年2月25日,星期天(2)繁殖和感染周期:吸附溶菌周期UV诱导细菌裂解溶源周期

噬菌体(原噬菌体)P1噬菌体第61页,共84页,2024年2月25日,星期天几个相关的概念溶原性:噬菌体外壳蛋白的合成以及溶菌功能受到抑制。溶原性细菌:“携带”原噬菌体的细菌。原噬菌体:溶原性细菌中的噬菌体DNA分子。无外壳;无侵染能力。第62页,共84页,2024年2月25日,星期天λ噬菌体DNA的插入attλ第63页,共84页,2024年2月25日,星期天三、噬菌体遗传的研究方法获得突变株:处理营养期细菌或者游离噬菌体四类突变株:

1)寄主范围突变株(hostrangemutant)

2)噬菌斑(plaquemutant)

3)温度敏感性:野生型:37C、43C

均可繁殖

突变型:43ts:仅37C

繁殖

4)溶菌酶:e+

e第64页,共84页,2024年2月25日,星期天1)寄主范围突变株(hostrangemutant)寄主范围:指噬菌体感染和裂解的菌株范围。某种噬菌体只能侵染某一种菌的个别菌系,突变后寄主范围变宽或变窄。

T2:h+

噬菌体:只侵染E.coli

B株;

h突变株:

E.coliB&B/2第65页,共84页,2024年2月25日,星期天2)噬菌斑突变株(plaquemutant)噬菌斑形状:噬菌斑的大小、边缘清晰度、透明程度。例如:T噬菌体

rAr1r+

r(rapidlysis)

rBr13(噬菌斑小、边缘模糊)(速溶型,噬菌斑大、边缘清晰)rCr7m+

m小型(minute)

c+

c透明(clear)

t+

t半透明(turbid)第66页,共84页,2024年2月25日,星期天2、杂交试验-双重感染

第67页,共84页,2024年2月25日,星期天(1)E.ColiBE.ColiB+B/2

二点测验第68页,共84页,2024年2月25日,星期天基因型噬菌斑h+r+半透明、小h-r-

透明、大h+r-

半透明、大h-r+透明、小重组值=×100%重组型亲型1+21+2+3+

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