MiR-130b通过TGF-β1通路调节自噬对糖尿病肾脏纤维化的作用和机制的研究

MiR-130b通过TGF-β1通路调节自噬对糖尿病肾脏纤维化的作用和机制的研究目的:糖尿病肾病(DN)又称糖尿病肾小球硬化症,糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见的微血管并发症,同时也是导致糖尿病患者致死的首位原因。DN的发病机制庞杂,参与调控的通路众多,在诊断上一般依赖尿微量白蛋白和肾脏组织活检,缺乏有效的、稳定的、非创伤性的检测方法。医治上给予降血糖和血压,仅能延缓DN的发展。而人工透析和肾脏移植治疗不仅代价高昂,而且应用上有局限性。随着对DN研究的深入,人们发现自噬与DN肾脏纤维化联系尤为密切。另一方面,miRNA是在机体稳定存在的、拥有高度组织特异性的小分子RNA,在DN发生发展过程中作用重大。本研究旨在通过建立db/db小鼠模型和人肾小球系膜细胞的培养,对miR-130b的表达、纤维化相关蛋白以及自噬活性水平进行研究,探讨miR-130b对DN的自噬与肾脏纤维化的影响,并对其靶基因进行预测,以揭示糖尿病肾病纤维化过程中的潜在机制,为DN的肾脏纤维化的预防和治疗提供新方向。方法:动物实验用db/db小鼠及C57BLKS小鼠建立糖尿病肾病模型和对照,监测各组小鼠的一般情况和指标,喂养结束后收集相应标本检测小鼠的空腹血糖、血肌酐等,并用HE和Masson染色观察各组小鼠肾脏组织的病理学变化,透射电镜下观察肾脏细胞的微结构。qRT-PCR法和Westernblotting法检测小鼠肾脏组织纤维化和自噬相关因子的表达情况。细胞实验方面,分别用miR-130bmimics和inhibitor及相应的对照瞬时转染浓度为0或10ng/mlTGF-β1处理的HMC细胞,qRT-PCR法、Westernblotting法、JC-1法检测各组肾脏及细胞的自噬及纤维化相应因子,以明确过表达或者下调miR-130b对肾脏和HMC细胞自噬和纤维化的影响,明确TGF-β1对HMC细胞自噬和纤维化的影响,明确miR-130b、TGF-β1、自噬与糖尿病肾脏纤维化之间的关系。预测miR-130b的靶基因并明确其与miR-130b的联系。结果:db/db小鼠的空腹血糖较正常对照组明显上升,血清肌酐明显上升(P<0.001)。在db/db组的肾脏中可观察到肾间质出现纤维化和基底膜变厚等病理变化。miR-130b、纤维化因子Ⅰ型胶原蛋白、FNmRNA的表达都是db/db模型组肾脏较正常对照组肾脏组织中的表达升高明显,差异显著,分别为(P<0.01,P<0.05,P<0.01)。WB检测db/db模型组小鼠肾组织FN蛋白、colⅠ蛋白表达水平与正常对照组小鼠相比升高明显,且2组间的差异很大(P<0.001,P<0.01);db/db模型组小鼠肾组织ACVR1的表达水平比正常对照组要低(P<0.01);而自噬相关蛋白Beclin1、LC3的表达是降低的(P<0.01,P<0.01),p62的表达却高于对照组(P<0.01)。透射电镜下db/db模型组小鼠肾小球基底膜增厚明显。在细胞实验方面,qRT-PCR检测各组细胞纤维化相关因子结果显示:高糖培养的模型组HMC细胞,其miR-130b和FN、ColⅠ的mRNA表达是高于正常对照组的(P<0.01),而miR-130b靶基因ACVR1的mRNA表达水平则低于对照组(P<0.01)。转染miR-130bmimics组与miR-130bmimicsNC组比较,miR-130b和FN、ColⅠ的mRNA表达水平升高,ACVR1mRNA的表达明显减弱。相反地,转染miR-130binhibitor组与miR-130binhibitorNC组比较,miR-130b与FN、ColⅠ的mRNA表达下降,但是ACVR1mRNA的表达水平升高。而转染miR-130bmimics+TGF组与miR-130bmNC+TGF组相比,miR-130b及其靶基因ACVR1的mRNA表达分别呈上升和下降趋势,同时有FN、ColⅠ的表达下降。转染miR-130binhibitor+TGF组与miR-130biNC+TGF组的比较结果显示,前者在miR-130bFN、ColⅠmRNA表达方面比后者减少,伴随着ACVR1mRNA表达的增强。Westernblotting结果可见:与正常对照组相比,模型组的自噬诱导蛋白Beclin1、LC3II/I的表达量都是减少的(P<0.001,P<0.001),而自噬抑制标记蛋白p62的表达量呈上升趋势,且差异有统计学意义(P<0.001)。纤维化相关蛋白FN、ColⅠ的相对表达量是增强的,于此同时,模型组ACVR1的表达量低于正常对照组(P<0.001)。转染miR-130bmimics组相较于其NC组,自噬相关蛋白Beclin1的表达量减少剧烈(P<0.001)、LC3II/I的表达量亦如此(P<0.001),p62蛋白的表达水平则升高(P<0.001)。伴随着FN、ColⅠ的表达增强。转染miR-130bmimics组靶基因ACVR1的表达量也低于其NC组(P<0.001)。而转染miR-130binhibitor组与转染miR-130binhibitorNC组比较,Beclin1、LC3II/I和ACVR1的表达量则是卓越上升的,p62蛋白的表达明显下降,而纤维化增强。与miR-130bmNC+TGF组比较,miR-130bmimics+TGF组Beclin1、LC3II/I和ACVR1的表达水平下降幅度大,而p62的表达水平是升高的,伴有纤维化程度增强。与miR-iNC+TGF-β1组相比,miR-inhibitor+TGF-β1组的Beclin1的表达增强,LC3II/I和靶基因ACVR1蛋白也是如此。自噬抑制标记蛋白p62的表达水平有所下降,纤维化水平增强。JC-1线粒体膜电位检测可见,正常对照组细胞相对于高糖模型组是升高的,说明模型组HMC细胞的线粒体自噬可能受到了抑制。而转染miR-130bmimics组与miR-130bmimicsNC组比较,其膜电位也是相对升高的。转染miR-130binhibitor的情况却恰恰相反,该组细胞的线粒体膜电位是较miR-130binhibitorNC组相对下降的。结论:db/db