酶的结构与功能

关于酶的结构与功能酶的发现及研究历史人们对酶的认识起源于生产与生活实践。夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。公元前12世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。酶者，酒母也第一节酶引论第2页,共114页，2024年2月25日，星期天enzyme("inyeast")enzyme是希腊文en=in，zyme=yeast第3页,共114页，2024年2月25日，星期天什么是酶？酶是生物催化剂生物体一切生化反应都需酶催化才能进行！性能远远超过人造催化剂定义：由活细胞产生的、有高度专一性和 高效催化作用的生物大分子。第4页,共114页，2024年2月25日，星期天一、酶是生物催化剂1.只能催化热力学上允许进行的反应；

2.提高反应速度，不改变平衡点;3.只起催化作用，本身不消耗；

4.降低反应的活化能。（一）与一般催化剂相同的特点第5页,共114页，2024年2月25日，星期天一般催化剂反应活化能反应总能量变化酶促反应活化能非催化反应活化能初态终态能量改变活化过程酶促反应活化能的改变过渡态第6页,共114页，2024年2月25日，星期天

活化能(activationenergy)

指在一定温度下，1mol底物全部进入活化态所需要的自由能单位：KJ/mol酶催化反应的实质：降低反应的活化能第7页,共114页，2024年2月25日，星期天1.高效性且无副反应反应速度是无酶催化/普通人造催化剂催化反应速度的105——1017倍。（二）生物催化剂的特点第8页,共114页，2024年2月25日，星期天铁屑 肝糜 肝糜(煮)2H2O22

H2O+O2例：双氧水裂解第9页,共114页，2024年2月25日，星期天2.专一性Specificity:酶对催化的反应和反应物有 严格的选择性。底物（substrate):

酶作用的物质。第10页,共114页，2024年2月25日，星期天

（1）酶浓度的可调性（2）通过激素调节酶活性（3）反馈抑制调节酶活性（4）抑制剂和激活剂（5）别构调控、共价修饰、同工酶等3.可调节性

为P所抑制

A―‖→B→C→D→P（终产物）

↑……↑图通过终产物可逆的结合对途径中的第1个酶反馈抑制

第11页,共114页，2024年2月25日，星期天4.反应条件温和（易失活）常温、常压、中性5.催化活性与结构有关

生物固氮：工业氨合成：N2+3H2

500℃,300大气压Fe2NH3第12页,共114页，2024年2月25日，星期天二、酶的化学本质及组成①经酸碱水解终产物是AA②能被蛋白酶水解而失活③酶可变性失活④酶是两性电解质⑤具有不能通过半透膜等胶体性质⑥具有蛋白质的化学呈色反应化学本质是蛋白质（一）酶的化学本质第13页,共114页，2024年2月25日，星期天1982年T.Cech发现了第1个有催化活性的天然RNA——ribozyme（核酶），以后又陆续发现了真正的RNA催化剂。1995年，JackW.Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性的DNA片段，称之为脱氧核酶(deoxyribozyme)，为生物催化剂的发展作出了新的贡献。第14页,共114页，2024年2月25日，星期天单纯酶：只有蛋白质缀合酶（结合酶）：脱辅酶+辅助因子辅助因子辅基（prostheticgroup）

辅酶（coenzyme）

{与酶结合紧与酶结合松全酶（二）酶的化学组成根据酶的组成成份：

第15页,共114页，2024年2月25日，星期天羧肽酶第16页,共114页，2024年2月25日，星期天NADPH—脱氢酶的辅酶过氧化氢酶第17页,共114页，2024年2月25日，星期天缀合酶中：单独酶蛋白或辅助因子没有催化活性一种酶蛋白一般只与一种辅助因子结合同种辅助因子可与不同的酶蛋白结合

第18页,共114页，2024年2月25日，星期天酶蛋白：决定反应的专一性辅助因子：传递电子、原子或某些 化学基团的作用第19页,共114页，2024年2月25日，星期天第20页,共114页，2024年2月25日，星期天monomericenzyme：一般由一条肽链组成oligomericenzyme：为寡聚蛋白，≥2个亚基multienzymecomplex：几种酶靠非共价键彼此嵌合而成。－－酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应,有利于提高酶的催化效率并便于对酶的调控。

（如糖代谢、脂代谢）（三）单体酶、寡聚酶、多酶复合体根据酶蛋白分子的特点：第21页,共114页，2024年2月25日，星期天第22页,共114页，2024年2月25日，星期天三、酶的命名和分类（一）习惯命名法根据其催化底物来命名；根据所催化反应的性质来命名；结合上述两个原则来命名，有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点。（略讲）第23页,共114页，2024年2月25日，星期天优点

命名简单应用历史较长，使用方便缺点

一名数酶、一酶数名为了适应酶学发展的新情况，国际酶学会议于1961年提出一个新的系统命名法及分类原则，已被国际生化协会采用。第24页,共114页，2024年2月25日，星期天（二）国际系统命名法：系统名称包括底物名称、反应性质，最后加一个酶字。第25页,共114页，2024年2月25日，星期天

底物1：底物2+反应性质+酶

乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+乳酸：NAD+氧化还原酶当底物为水时，可省略第26页,共114页，2024年2月25日，星期天

系统名：包括所有底物的名称和反应类型。乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+乳酸：NAD+氧化还原酶

惯用名：只取较重要的底物名称和反应类型。乳酸：NAD+氧化还原酶乳酸脱氢酶对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。第27页,共114页，2024年2月25日，星期天（三）国际系统分类编号1961年国际酶学委员会（EnzymeCommittee,EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：第28页,共114页，2024年2月25日，星期天第29页,共114页，2024年2月25日，星期天第30页,共114页，2024年2月25日，星期天氧化-还原酶催化氧化-还原反应，催化氢的转移或电子传递。主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。1、氧化还原酶

OxidoreductaseAH2+B（O2）A+BH2（H2O2，H2O）（四）六大类酶的特征第31页,共114页，2024年2月25日，星期天（1）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应AH2+BA+BH2（需辅酶Ⅰ或辅酶Ⅱ）（2）氧化酶类①催化底物脱氢，氧化生成H2O2：AH2+O2A+H2O2（需FAD或FMN）②催化底物脱氢，氧化生成H2O：2AH2+O22A+2H2O（3）过氧化物酶ROO+H2O2RO+H2O+O2第32页,共114页，2024年2月25日，星期天（4）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）O2+OHOHC=OC=OOHOH（顺，顺-已二烯二酸）RH+O2+还原型辅助因子ROH+H2O+氧化型辅助因子（又称羟化酶）第33页,共114页，2024年2月25日，星期天转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。根据X分类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。2、转移酶

TransferaseA·X+BA+B·X第34页,共114页，2024年2月25日，星期天水解酶催化底物的加水分解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：3、水解酶

hydrolaseAB+H2OAOH+BH第35页,共114页，2024年2月25日，星期天裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如，延胡索酸水合酶催化的反应。4、裂合酶

Lyase第36页,共114页，2024年2月25日，星期天异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。

例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应5、异构酶

IsomeraseABPP第37页,共114页，2024年2月25日，星期天合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸+CO2

草酰乙酸6、合成酶

LigaseorSynthetaseA+B+ATPA·B+ADP+Pi第38页,共114页，2024年2月25日，星期天酶的系统编号：4位数字第一位：代表六大类反应类型第二位：亚类（作用的基团或键的特点）第三位：亚亚类（精确表示底物/产物的性质）第四位：在亚亚类中的序号乳酸脱氢酶

EC1.1.1.27第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的编号第39页,共114页，2024年2月25日，星期天——指酶对底物的选择性，也称特异性。结构专一性立体专一性绝对专一性相对专一性基团专一性键专一性旋光异构专一性（D-、L-）几何异构专一性(顺、反异构)四、酶的专一性（一）酶的专一性第40页,共114页，2024年2月25日，星期天基团专一性胰蛋白酶第41页,共114页，2024年2月25日，星期天（1）锁钥学说——刚性构象（2）诱导契合学说（3）三点附着学说

——立体异构专一性的酶（二）与酶专一性有关的学说第42页,共114页，2024年2月25日，星期天锁钥学说认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样第43页,共114页，2024年2月25日，星期天“三点结合”的催化理论酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情况是完全结合的形式。只有这种情况下，不对称催化作用才能实现。第44页,共114页，2024年2月25日，星期天第45页,共114页，2024年2月25日，星期天诱导契合学说酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状.

（Koshland，1958）：当底物和酶接触时，可诱导酶分子的构象变化，使酶活性中心的各种基团处于和底物互补契合的正确空间位置，有利于催化。第46页,共114页，2024年2月25日，星期天第47页,共114页，2024年2月25日，星期天（三）研究酶的专一性的意义

理论上，专一性－－弱键和结构互补成为理解生物大分子之间相互作用的基石。

实践上也有重要意义。例如，某药物具有某一种构型才有生理效用，而有机合成的是消旋混合物,若用酶可以进行不对称合成或不对称拆分,即得到单一构型的药物。第48页,共114页，2024年2月25日，星期天

五、酶的活力测定和分离纯化（一）酶活力与酶促反应速度1、酶活力（enzymeactivity）

酶活力就是酶催化某一化学反应的能力。可以用它催化某一化学反应的速度来表示。酶活力的大小代表酶的量第49页,共114页，2024年2月25日，星期天2.活力单位(U)

酶单位（U）：在一定条件下、一定时间内、将一定量的底物转化为产物所需的酶量。如：每小时催化1克底物每小时催化1ml某浓度溶液每分钟催化1ug底物一定时间一定量底物一定条件下第50页,共114页，2024年2月25日，星期天

在标准条件下（25℃，最适pH和最适底物浓度）一分钟内催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量。

1IU=1mol/min——酶活力单位标准化（1）国际单位（IU）第51页,共114页，2024年2月25日，星期天

在标准条件下（25℃，最适pH和最适底物浓度）每秒钟催化1摩尔底物转化为产物所需的酶量。

1Kat=1mol/s=60×106IU=6×107IU1IU=（1/60）μKat=16.7nKat——酶活力单位标准化（2）Kat第52页,共114页，2024年2月25日，星期天每mg酶蛋白所含的酶活力单位数。

U/mg酶蛋白、U/ml酶蛋白酶产品质量评价中常使用，一定程度上代表酶的纯度。（3）比活力

(specificactivity)比活力越大，酶的纯度越高第53页,共114页，2024年2月25日，星期天一定条件下：每秒钟、每个酶分子转换的底物分子数或每微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数一秒内1摩尔的酶可催化几摩尔的底物（4）转换数（turnovernumber，TN）——反应酶的催化活性中心的活性

第54页,共114页，2024年2月25日，星期天用哪一个速度来表示酶促反应的速度特征呢？反应初速度Vo逐渐降低酶反应进程曲线在酶促反应开始无任何干扰因素出现时,短时间内酶的反应速度。一般指反应底物消耗5%以内时的反应速率。3.酶促反应速度单位时间内底物(S)的减少量或产物(P)的增加量Why?第55页,共114页，2024年2月25日，星期天反应速度逐渐降低的原因：①底物浓度的降低；②产物的生成逐渐增大了逆反应；③酶在反应中失活；④产物对酶的抑制

102030405060（min）产物生成量酶反应进程曲线反应初速度表示酶活力第56页,共114页，2024年2月25日，星期天（二）酶活力的测定——酶反应速度的测量测量单位时间内底物的消耗量。测量单位时间内产物的生成量。浓度时间产物P反应物S第57页,共114页，2024年2月25日，星期天（1）应测反应初速度（initialvelocity）底物浓度变化在起始浓度5%以内。（2）酶的反应速度一般用单位时间内产物的增加量来表示。（3）测酶活力时应使反应温度、pH、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。（4）测定酶反应速度时，应使[S]>>[E]。1、测定酶活力的注意事项

第58页,共114页，2024年2月25日，星期天2、酶活力的测定方法（1）分光光度法（spectrophotometry）

该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部分光吸收不同。优点：简便、迅速、准确；一个样品可多次测定；可检测到10-9mol/L水平的变化。例:人血清乳酸脱氢酶活力的测定L-乳酸+NAD+

丙酮酸+NADH+H+

乳酸脱氢酶第59页,共114页，2024年2月25日，星期天第60页,共114页，2024年2月25日，星期天（2）荧光法（fluorometry）

该法要求酶反应的底物或产物有荧光变化。主要的优点：灵敏度很高，可测10-12mol/L的样品。酶蛋白分子中的Tyr、Trp、Phe残基以及一些辅酶、辅基，如NADHNADPH、FMN、FAD等都能发出荧光。例：乙醇+NAD+乙醛+NADH+H+

乙醇脱氢酶第61页,共114页，2024年2月25日，星期天（3）酶偶联分析法(enzymecouplingassay)

第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两个酶系统在一起反应。P1无光吸收或荧光变化，偶联后,P2有光吸收或荧光变化。例：测己糖激酶的活性葡萄糖+ATP葡糖-6-磷酸+ADP己糖激酶葡糖-6-磷酸+NADP葡糖酸-6-磷酸+NADPH+H+

G-6-P脱氢酶第62页,共114页，2024年2月25日，星期天（4）电化学法（electrochemicalmethod）

——有pH测定法、离子选择性电极法等。离子选择性电极法要求在酶反应中必须伴随有离子浓度的变化或气体的变化（如O2、CO2、NH3等）。例:葡萄糖氧化酶活性的测定葡萄糖+O2+H2O葡糖酸+H2O2

葡萄糖氧化酶（5）同位素法放射性同位素标记底物，经酶作用得到相应产物，经适当分离，测定产物脉冲数即可。第63页,共114页，2024年2月25日，星期天酶活力测定实例①确定反应条件

20℃、pH=7，底物浓度6g/l（过量），加入2mg固体脂肪酶②确定活力单位

每小时催化1克底物1u=1g/h③测反应初速度

作产物甘油随时间增加的曲线，量出反应初速度值，换算为脂肪的消耗速度。如8g/h④换算活力

8g/h

/

1g/h=8u⑤计算比活

8u/2mg酶蛋白=4u/mg酶蛋白脂肪脂肪酶甘油+脂肪酸第64页,共114页，2024年2月25日，星期天分离纯化方法同蛋白质纯化类似：1.选材：酶含量丰富的新鲜生物材料2.细胞破碎：因材料而异3.抽提：低温下以水或低盐缓冲液抽提4.分离及纯化：粗分级，细分级分离5.结晶6.保存：低温下酶粉可长期保存注意低浓度酶溶液易变性（三）酶的分离和纯化第65页,共114页，2024年2月25日，星期天酶的分离纯化溶解度的差异盐析法PEG沉淀法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法热稳定性的差异热处理沉淀法第66页,共114页，2024年2月25日，星期天电荷性质的差异离子交换层析法电泳法分子大小和形状的差异凝胶过滤法超滤法透析法离心法亲和力的差异亲和层析法疏水作用的差异疏水层析法分配系数的差异双水相系统萃取法第67页,共114页，2024年2月25日，星期天由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意:1．全部操作在低温0～4℃。2．在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。3．在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量β-巯基乙醇及蛋白酶抑制剂。4．在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力和回收率（得率）。第68页,共114页，2024年2月25日，星期天酶的纯度：总活力=活力单位数/mL酶液×总体积（mL）比活力

=活力单位数/毫克蛋白纯化倍数

=——————每次比活力第一次比活力产率%（回收率）=——————×100每次总活力第一次总活力酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、分子筛层析等。第69页,共114页，2024年2月25日，星期天衡量分离提纯效果的两个指标①总活力的回收——得率（回收率）

——是表示提纯过程中酶的损失情况②比活力提高的倍数

——是表示提纯方法的有效程度第70页,共114页，2024年2月25日，星期天酶的分离纯化过程中一定要随时追踪酶的活性第71页,共114页，2024年2月25日，星期天六、非蛋白质生物催化剂——核酶（ribozyme)

1982年美国科学家Altman和Cech研究Tetrahymenathermophiea（嗜热四膜虫）rRNA前体加工成熟时，发现具有催化活性（自我剪切功能）的天然RNA。1983年美国S.Altman等研究E.coliRNaseP（由23%蛋白质和77%的RNA组成），发现RNaseP中的RNA可催化E.colitRNA的前体加工。

（一）核酶的发现第72页,共114页，2024年2月25日，星期天1986年，T.Cech又发现L19RNA在一定的条件下能以高度专一性方式催化寡核苷酸底物的切割与连接。

基于Cech和Altman的创造性工作，将这类具有酶一样的催化功能，本质上不是蛋白质而是RNA的生物大分子定义为Ribozymes。该发现曾被认为是生化领域内最令人鼓舞的发现之一，为此Cech和Altman共同荣获1989年度诺贝尔化学奖。第73页,共114页，2024年2月25日，星期天随后的研究表明：

L19RNA具备酶促催化的几个特征：高度的底物专一性遵循Michaelis-Menten动力学对竞争性抑制剂的敏感性第74页,共114页，2024年2月25日，星期天(2)1992年，Piccirilli等发现L19RNA具有氨酰酯酶的活性，催化氨酰酯水解。

(3)L19RNA还有限制性内切酶作用：

-CpUpCpUpN-+G-CpUpCpU+GpN第75页,共114页，2024年2月25日，星期天(4)1997年，Zhang和Cech用人造的RNA分子催化合成了肽链，表明RNA具有肽基转移酶活性。

(5)原核生物RNaseP和兔肌1，4--葡聚糖分枝酶均包括RNA+蛋白组分，起催化作用的都是RNA。第76页,共114页，2024年2月25日，星期天（二）核酶的种类

自我剪切:是转录后加工方式之一（self-cleavage）

自我剪接:

（self-splicing）

I型内含子：需要鸟苷和Mg2+参与II型内含子：不需要鸟苷的参与剪切与连接催化分子内反应催化分子间反应：按作用底物

如RNaseP、L19RNA第77页,共114页，2024年2月25日，星期天自我剪切核酶包括：发夹结构核酶、锤头结构核酶、丁型肝炎病毒（HDV）核酶等。（1）发夹结构核酶由4个螺旋区和数个环状区组成切割活性所需最小长度为50个核苷酸螺旋Ⅰ、Ⅱ决定核酶切割部位的特异性，螺旋Ⅲ配对碱基及其3′端的未配对碱基均为切割活性所必需

结构特点第78页,共114页，2024年2月25日，星期天结构特点三个螺旋13个保守碱基剪切点：GUN（2）锤头结构核酶（3）HDV核酶和VSRNA第79页,共114页，2024年2月25日，星期天（三）核酶的研究意义与应用前景1、研究意义突破了生物体内所有的“生物催化剂都是蛋白质”的传统观念；对生命起源这一问题有了新的认识；从生物进化角度来看，生物催化剂从核酶到蛋白质的转变，伴随着生物代谢高效率和生命现象的更趋复杂。

第80页,共114页，2024年2月25日，星期天2、应用前景可以设计出自然界不存在的各种核酶。

核酶基因研究前景诱人，在基因治疗领域中倍受青睐，其研究进展也相当迅速。

第81页,共114页，2024年2月25日，星期天酶工程就是利用酶的特异催化功能，对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术。包括：化学酶工程：(酶学+化学工程技术)利用化学工程手段，改善酶的性能，提高催化效率,降低成本。包括：天然酶、化学修饰酶、固定化酶、人工酶生物酶工程：(酶学+现代分子生物学技术)以DNA重组技术为核心。包括：克隆酶、突变酶等。七、酶工程第82页,共114页，2024年2月25日，星期天化学酶工程

——酶分子表面的修饰，酶分子内部的修饰，化学合成人工酶。1、微生物发酵得到粗酶2、对天然酶进行化学修饰、固定化处理，利用化学合成等手段来改善酶性能。——天然酶

第83页,共114页，2024年2月25日，星期天

利用化学的手段对酶分子上的氨基酸侧链基团进行修饰，改善酶的性能，以适用于工业的应用及研究工作的要求。1、酶化学修饰的基本方法

（1）酶分子侧链基团的化学修饰

修饰酶的功能基团：-NH3、-SH、-COOH、咪唑基、酚羟基、吲哚基、胍基、甲硫基等。修饰反应：酰化反应、烷基化反应、氧化和还原反应、芳香环取代反应等类型。（一）化学修饰酶第84页,共114页，2024年2月25日，星期天

其中水溶性的碳二亚胺类特定修饰已成为最普遍的标准方法。可以在较温和的条件下进行，但一定条件下，Ser、Cys和Tyr也可反应。羧基的修饰OENZCOCN+HRN+HR＇ENZOCO—N+NCRR—HOENZCXOCN+HRN+HR＇++H+pH5HX（卤素）H++R,R’为烷基，HX为卤素、一级或二级胺；ENZ为酶第85页,共114页，2024年2月25日，星期天

Lys的ε-NH2可采用烷基化反应来修饰。修饰剂包括有乙酸酐、卤代乙酸、芳基卤和芳香族磺酸。其中，三硝基苯磺酸（TNBS）是种非常有效的氨基修饰剂。反应后在420nm和367nm能够产生特定的光吸收。氨基的修饰O2NO2NNO2HO3SENZNH2+pH>7O2NO2NNO2NHENZ第86页,共114页，2024年2月25日，星期天

此外，磷酸吡哆醛（PLP）、氰酸盐、及蛋白质测序中用的DNS（丹磺酰氯）、苯异硫氰酸酯（PITC）都可作为修饰剂。ENZ—NH2+SO2ClN(CH3)2ENZ—NHSO2N(CH3)2++Cl-H+丹磺酰氯第87页,共114页，2024年2月25日，星期天具有两个邻位羟基的化合物。如丁二酮、1，2-环己二酮、苯异二醛，都是重要的修饰剂。胍基的修饰：ENZNCNH2NH2OO+NCENZNHNHOHOH硼酸盐NCENZNHNH

OOB—OHOH第88页,共114页，2024年2月25日，星期天

烷基化试剂是一种酶修饰剂，如碘乙酸。修饰产物相当稳定，易于分析。此外，马来酸酐、马来酰亚胺等修饰剂与巯基形成对酸稳定的衍生物。

2-硝基苯甲酸（DTNB），与-SH反应形成S-S，释放出一个2-硝基-5-硫苯甲酸阴离子。在412nm处有最大吸收。因而能通过光吸收的变化跟踪反应程度。巯基的修饰5,5‘-二硫代-（2-硝基苯甲酸（DTNB）ENZNO2COO-—S—S—ENZ—SH+++-OOCO2NS—S—NO2COO-NO2COO--SpH＞6.8有机汞试剂（如对氯汞苯甲酸）对巯基专一性强，反应物在250nm处有吸收第89页,共114页，2024年2月25日，星期天

常用的修饰剂有，焦碳酸二乙酯（DPC）、碘代乙酸，能修饰咪唑基的两个N原子。NNHENZENZNNCH2COO++CH3CH2OH+CO2His咪唑基的修饰ONNHENZCOCOOCH2CH3OCH2CH3NNENZOCOCH2CH3+pH4-7ICH2COO-pH>5.5第90页,共114页，2024年2月25日，星期天

Trp残基一般位于E分子内部，而且比-SH、-NH2等一些亲核基团的反应性差。所以一般不与常用的一些试剂反应。

N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）可以修饰，并通过280nm处光吸收的减少跟踪反应。色氨酸吲哚基的修饰第91页,共114页，2024年2月25日，星期天

Tyr的修饰包括-OH和芳环上的取代修饰，Thr和Ser残基的-OH都可被酚羟基的修饰剂修饰，但反应条件严格些，生成的产物也更稳定。四硝基甲烷（TNM）在温和条件下可高度专一性地硝化酚羟基生成可电离的发色基团3-硝基酪氨酸，在酸水解条件下稳定，可用于氨基酸定量分析。酪氨酸残基和脂肪族羟基的修饰第92页,共114页，2024年2月25日，星期天甲硫氨酸甲硫基的修饰ENZ—S—CH3+H2O2ENZ—S—CH3H2O+OpH＜5ENZ—S—CH3+2HCOOHOENZ—S—CH3+OH2HCOHOO约-10℃过甲酸ENZ—S—CH3+ICH2CNH2OENZ—S++OpH<4CH3CH2CNH2I-甲硫基的化学修饰碘乙酰胺甲硫氨酸残基极性较弱，在温和条件下很难选择性修饰。但是由于硫醚的硫原子具有亲和性，可以用过氧化氢、过甲酸等氧化成甲硫氨酸亚砜。第93页,共114页，2024年2月25日，星期天（2）酶的化学交联

交联剂是具有两个反应活性部位的双功能基团可以在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或酶与其他分子之间发生交联反应。同型双功能交联剂:两端具有相同的活性反应基团。可与氨基反应的双亚氨酸酯是一个典型的同型双功能交联剂。此外，N－羟琥珀酰亚氨酯、二硝基氟苯等。异型双功能交联剂：一端与氨基作用，另一端一般与巯基作用。但是用碳二亚胺时，第二个反应基团是羧基。可被光活化的高交联剂：一端与酶反应后，经光照，另一端产生一个活性反应基团（自由基）如碳烯或氮烯，它们具有高反应性，没有专一性。第94页,共114页，2024年2月25日，星期天使用双功能试剂如戊二醛、PEG等可将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内不同肽链之间进行共价交联，使酶分子活性结构得以加固，提高其稳定性。交联酶晶体技术可以大幅度提高酶的生物活性和热稳定性。并且发现交联晶体在有机溶剂中的催化活性和稳定性提高。例如，糖基化作用于交联技术联合使用应用于青霉素G酰化酶，利用葡聚糖二乙醛将青霉素G酰化酶交联，55℃下半衰期提高9倍，Vmax不变。此外，丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶等亦可通过交联修饰由常温酶变为嗜热酶，温度从45℃提高到76℃第95页,共114页，2024年2月25日，星期天

对修饰剂的要求：修饰剂具有较大的相对分子质量，良好的生物相容性；分子表面有较多地反应活性基团及修饰后酶活的半衰期较长。（3）大分子结合修饰常用的化学修饰剂A、糖及糖的衍生物主要有右旋糖酐、右旋糖酐硫酸酯、糖肽、葡聚糖等；B、高分子聚物聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVA）、聚N－乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸（PAA）等；C、生物大分子常用的有肝素、血浆蛋白、聚氨基酸类等；蛋白质或其他大分子物质等第96页,共114页，2024年2月25日，星期天大分子多聚物与具有生物活性的大分子物质通过共价键将大分子连接到酶分子表面，使之在酶的表面形成覆盖层，从而使酶的性质产生改变。大分子在使用前要进行活化，方法有：溴化氢法、高碘酸氧化法、叠氮法、三氯均三嗪法等NH2+酶NH2COOHCOOHRN=C=NR’C—NH—OC—NH—酶OO白蛋白与酶之间以羰二亚胺作为交联剂的修饰反应（修饰酶）C—NH—酶酶第97页,共114页，2024年2月25日，星期天分子量在500-20000聚乙二醇类修饰剂应用最广，其生物相容性通过FDA认证。其分子末端有两个能被活化的羟基。分子修饰时多采用单甲氧基聚乙二醇（MPEG）MPEG—均三嗪衍生物MPEG—琥珀酰亚胺类衍生物MPEG—氨基酸类衍生物肝素——含硫酸酯的粘多糖及适用于用来修饰溶解血栓酶类，增加酶的疗效。第98页,共114页，2024年2月25日，星期天

酶经修饰后会产生各种各样的变化，概括起来有：

(1)热稳定性提高

①修饰剂共价连接于酶分子使其天然构象产生一定的“刚性”，并形成分子内部基团的热振动，增加稳定性；②修饰剂本身增加了酶分子表面的亲水性。

(2)抗各类失活因子的能力提高①修饰剂所产生的空间屏蔽有效的阻挡了各类失活因子；②酶分子中对蛋白质水解酶失活因子敏感基团被修饰。

(3)抗原性消除；(4)体内半衰期延长；

(5)最适pH改变；(6)酶学性质变化；

(7)对组织分布能力改变2、修饰酶的特性第99页,共114页，2024年2月25日，星期天3、化学修饰的局限性(1)某种修饰剂对某一氨基酸的化学修饰专一性是相对的。(2)化学修饰后酶的构象或多或少都有一些改变，因此这种构象变化将妨碍对修饰结果的解释。(3)只能在具有极性的氨基酸残基侧链上进行，对于维持酶的空间构象的其它氨基酸侧链，目前还不能用化学修饰方法研究这些氨基酸残基酶的结构与功能中的作用。(4)酶的化学修饰所提供的信息还得用X射线和其他方法来确定。第100页,共114页，2024年2月25日，星期天4、酶化学修饰的应用医药理论研究生物技术领域第101页,共114页，2024年2月25日，星期天1、固定化酶的特点:

①对温度机械强度的稳定性高；②可以反复使用③更适合多酶体系2、酶的固定化方法:（1）载体结合法:将酶结合于水不溶性载体的一种固定化方法。根据结合的方式不同，又可分为物理吸附、离子结合和共价结合三种。

*物理吸附：借助非共价键把酶吸附到载体上，如活性碳。*离子结合：通过离子键结合于具有离子交换基团的水不溶性载体的固定化方法。载体为阴阳离子交换剂、树脂等。特点：易制备利用效率高，但酶易流失。*共价结合法：通过共价键把与酶活性无关的氨基酸功能基团连接在不溶于水的载体上。特点：结合牢固，但得率低。(二)固定化酶(immobilizedenzyme)EEEEE第102页,共114页，2024年2月25日，星期天（2）包埋法

网格型：将酶包埋于高分子化合物形成的网格中微囊型：将酶包埋在半透膜中缺点：孔径大小影响底物或产物进出（3）交联法

通过双功能试剂或多功能试剂（如戊二醛等）将酶蛋白与酶蛋白中的氨基酸残基作用，使酶与酶之间交联成网，凝集成固定化酶.常用的是戊二醛彼此交联EEEEEEEEEEEEEEE第103页,共114页，2024年2月25日，星期天固定化酶法生产高果糖浆

也称果葡糖浆或异构糖浆，它是以酶法糖化淀粉所得的糖化液，经葡萄糖异构酶的异构作用，将其中一部分葡萄糖异构成果糖，由葡萄糖和果糖而组成的一种混合糖糖浆。第104页,共114页，2024年2月25日，星期天淀粉→液化、糖化→葡萄糖浆→膜过滤→浓缩→异构化→部分变成果糖（42%）→混合→浓缩、精制→55%高果糖浆参与的酶：α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡萄糖异构酶高果糖浆的生产流程

固定化葡萄糖异构酶

葡萄糖果糖42%高果糖玉米糖浆：215万吨/年55%高果糖玉米糖浆：145万吨/年第105页,共114页，