JIP3基因敲除对NAFLD小鼠肝损伤的作用及机制研究

JIP3基因敲除对NAFLD小鼠肝损伤的作用及机制研究背景肥胖相关代谢性疾病,包括非酒精性脂肪肝病（NAFLD）,糖尿病和冠心病等患病率逐年上升,目前的治疗措施主要针对疾病的后果而不是代谢紊乱的原因。因此,探讨肥胖相关疾病的发病机制对于临床预防和治疗肥胖及相关代谢性疾病有很重要的指导意义。NAFLD是指除酒精及其他明确肝损害因素所致的肝脂肪变性及脂代谢紊乱。NAFLD发病的始动因素与肥胖和胰岛素抵抗密切相关,脂肪堆积在肝脏易引发氧化应激和脂质过氧化,从而诱发肝细胞损伤、炎症及纤维化,促进NAFLD进展。JNK相互作用蛋白3（JIP3）是JIP家族的一员,最初被认为是c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路支架蛋白。JIP3具有较强的形成异二聚体的能力,多面JIP3支架蛋白可以和Toll样受体（TLR）相关联,TLR识别病原体特异性分子基序进而参与NF-κB和MAPK信号途径（包括ERK1/2和JNK等）的传导,参与细胞增殖、凋亡、神经元发育、递质运输等生理活动。目前关于JIP3的研究主要集中在中枢神经系统,其是否可通过调控NF-κB和MAPK信号通路影响NAFLD肝损伤和脂代谢目前尚不清楚。目的本研究的目的是以JIP3基因敲除小鼠(JIP3^-/-小鼠)为研究对象,通过高脂饮食建立NAFLD模型,探讨JIP3对NAFLD小鼠肝损伤的作用及分子机制。方法将6-8周龄重18-20g的雄性小鼠(野生型和JIP3^-/-型)适应性喂养1周后,随机分成4组（n=12/组）:（1）正常饮食野生型组（WT/Con）;（2）正常饮食JIP3^-/-组(JIP3^-/-/Con);（3）高脂饮食野生型组（WT/HFD）;（4）高脂饮食JIP3^-/-组(JIP3^-/-/HFD)。总饲养时间为16周,饲养期间每周测量小鼠体重和血糖。12周时,各组均随机取出4只进行血脂测定和HE染色,评估NAFLD模型建立是否成功。16周末,禁食12h后进行IPGTT和IPITT。次日,小鼠麻醉状态下通过双能X射线吸收测定法评估体脂含量,取肝组织保存在液氮中。培养AML-12细胞,将JIP3siRNA转染至AML-12细胞,将细胞分为四组:（1）正常对照组（con）;（2）高果糖组（HFr）;（3）高果糖JIP3沉默组（siJIP3）;（4）siRNA对照组（siNC）。取静脉血行生化、激素检测;WesternBlot检测肝脏组织或细胞p-NF-κB、p-JNK等蛋白的表达;实时荧光定量PCR检测IL-1β,TNF-α,IL-6,IL-18和COX2表达;DCF分析ROS生成及定量测量H₂O₂、MDA、XO、SOD及TAC;小鼠肝脏组织甲醛固定后行HE染色观察形态学变化;免疫组化、免疫荧光检测p-NF-κB、p-JNK蛋白的表达及定位。结果1.JIP3基因敲除改善高脂饮食小鼠的代谢紊乱和肝损伤与正常饮食组相比,HFD组小鼠体重、体脂含量显著增加,空腹血糖及胰岛素水平明显升高,IPGTT及IPITT结果提示,小鼠糖耐量受损,胰岛素抵抗明显;JIP3基因敲除后,小鼠体重及脂肪含量降低,空腹血糖及胰岛素敏感性改善。HFD组小鼠肝脏脂肪变性、血清ALT、AST及血脂水平明显升高,肝脏组织中TC和TG含量明显增加,而JIP3基因敲除小鼠上述肝损伤及脂肪变性指标均有所改善。2.JIP3基因敲除改善高脂饮食诱导小鼠的氧化应激和炎症反应与正常饮食组相比,HFD组小鼠血清及肝脏组织中炎症因子（IL-1β,TNF-α,IL-6,IL-18和COX2）表达均上调,氧化应激损伤指标（ROS,H₂O₂,O₂^-,MDA,XO,iNOS）表达水平增加,抗氧化因子（SOD,TAC）水平下降。JIP3基因敲除后,小鼠炎症因子水平降低,抗氧化应激因子水平升高,氧化应激损伤指标下调。3.JIP3敲除影响脂代谢、氧化应激及炎症反应的分子机制JIP3基因敲除下调脂质生成相关基因的表达,包括SREBP1c,FAS,SCD1,ADFP和ChREBPα。Westernblot显示HFD诱导氧化应激相关基因TXNIP,NLRP3,ASC和Caspase-1表达上调,而JIP3敲除小鼠中上述基因表达降低。与WT/Con小鼠相比,JIP3^-/-/HFD小鼠肝脏组织抗氧化因子HO-1和Nrf-2表达显著上调,同时,TLR4/MyD88/NF-κB信号通路转录活性下降。4.JIP3下调可改善高果糖诱导的AML-12细胞的脂质合成、氧化应激损伤和炎症反应脂质代谢相关基因（SREBP1c,FAS,SCD1,FDAP和ChREBPα）在HFr培养的AML-12细胞中高表达,JIP3沉默后上述基因表达下调。HFr组TXNIP,NLRP3,ASC和Caspase-1表达增加,JIP3沉默组显著降低。与HFr组相比,JIP3沉默组细胞氧化应激损伤因子ROS,H₂O₂,O₂^-,MDA,XO,iNOS水平显著降低,相反,抗氧化因子SOD和TAC