几丁糖影响后纵韧带成纤维细胞骨化进程的相关研究

几丁糖影响后纵韧带成纤维细胞骨化进程的相关研究目的颈椎后纵韧带骨化症（ossificationoftheposteriorlongitudinalligament，OPLL）是一种常见的脊柱疾病，可引起严重的神经压迫症状，即使在轻微外伤后也可能导致患者出现不全瘫，甚至全瘫，对患者生活影响较大。自上世纪70年代以来，国内外对颈椎OPLL进行了大量深入的基础和临床研究，明确了该疾病的发生和发展是在一定的遗传基础及多种致病因素共同作用下，后纵韧带成纤维细胞发生骨向分化并最终在韧带组织内出现异位骨化的一种病理过程。对于症状严重的颈椎OPLL，目前仍以手术治疗为主，手术方式可分为后路、前路及前后联合入路。后路手术主要是扩大椎管容积，间接为受压脊髓、神经根减压，但无法去除前方致压的骨化物，更不能中断骨化的进展。前路手术虽可切除骨化物，但出现硬膜囊破裂，脊髓损伤的风险较大，多数学者采用保留骨化的韧带的“漂浮”方法，但残留的骨化物可呈持续性生长，影响临床减压效果。临床上，我们常可见到有患者因颈椎后纵韧带骨化的持续进展，症状渐进性加重，或手术后一度症状缓解，而随着残留骨化灶e的继续d生长，症状复发，甚至需要再手术。目前应力刺激被认为可能是加速后纵韧带骨化进展的重要因素。有必要探索一种能抑制颈椎OPLL患者骨化灶持续生长，或者延缓其进展的方法。几丁聚糖为几丁质脱去乙酰基后产物，又称几丁糖，生物相容性良好，目前在临床主要用于防止或减轻手术后粘连及疤痕增生，已取得了确切的疗效。已有实验证明几丁糖可抑制人皮肤成纤维细胞自分泌转化生长因子β1（TGF-β1），并反馈性地减轻细胞外基质的沉积，减少胶原纤维来源，抑制成纤维细胞的增殖及分化。而细胞外基质的沉积以及胶原合成的增加正是成纤维细胞骨化过程中的表现，同时，已有实验发现高浓度葡萄糖可促进小鼠后纵韧带细胞表达TGF-β1，TGF-β1的高表达可促进其骨化。因此我们推测U几丁糖n可能R对来源e于颈g椎后i纵s韧带t的e成纤r维细胞的TGF-β1分泌亦有所影响，并可抑制或延缓其骨向分化。本实验拟证实机械牵张应力可促使颈椎OPLL患者后纵韧带成纤维细胞TGF-β1表达升高，并藉此加速其骨化进程，继而在诱导成纤维细胞骨化的过程中将几丁聚糖加入培养液中，研究几丁糖对其骨化进程的影响作用。方法收集在2011年6月至2012年1月之间接受颈前路手术治疗的14例颈椎OPLL患者的后纵韧带标本，其中12例患者行椎体次全切除钛网植骨融合术，另2例行椎间盘切除椎间植骨融合术。术中获取韧带组织后即刻置入无菌的含培养液的标本管内，37℃条件下送往细胞培养室。所有标本均采取组织块培养法进行体外细胞培养，并通过免疫染色及细胞化学技术进行组织和细胞鉴定。取第三代后纵韧带成纤维细胞接种于特制的Flexercell6孔培养板，同步化后通过Flexercell4000细胞机械应力加载系统对其加载牵张应力刺激，分别在加载应力12h及24h后提取细胞总RNA，采用实时荧光定量逆转录PCR（RT-PCR）技术检测细胞的I型胶原（COLI）、碱性磷酸酶（ALP）两项骨化指标以及TGF-β1的mRNA表达量，分析与静置相同时间的对照组的差异，验证机械牵张应力对后纵韧带成纤维细胞骨化的诱导作用。在静置培养的成纤维细胞中加入浓度分别为0.1ng/ml,1ng/ml，10ng/ml的外源性TGF-β1，24h后分别检测各组细胞的COLI和ALP的mRNA表达量，同时在加载牵张应力刺激的成纤维细胞中加入浓度为2ug/ml的TGF-β1抗体，24h后检测细胞COLI和ALP的mRNA表达量，分别与对照组相比，研究TGF-β1在机械牵张应力诱导后纵韧带成纤维细胞骨化进程中的作用。采用实时荧光定量RT-PCR检测在浓度分别为0mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml的几丁糖作用下，后纵韧带成纤维细胞经牵张应力刺激12h和24h后，细胞COLI、ALP和TGF-β1的mRNA表达量升高幅度的e差异d，并保留细胞上清液，通过酶联免疫分析（ELISA）以及生化检测法技术分别检测上清液中I型胶原C端肽（CTX-1）的含量和ALP的活性单位含量，比较与静置相同时间的对照组的差异，研究不同浓度的几丁糖对颈椎OPLL患者后纵韧带来源的成纤维细胞的TGF-β1表达及其骨化进程的影响作用。结果术中获取的OPLL患者的后纵韧带标本经Masson三色染色和VonkossaH&E染色，清晰可见韧带组织周围有成骨化现象，全部14例后纵韧带标本均采用组织块培养法，其中12例体外细胞培养成功，HE及免疫荧光染色后在显微镜下观察到细胞呈梭形、纺锤形及多角的星形，细胞核大，卵圆形，细胞边界不清，呈典型的成纤维细胞形态学特点。在加载牵张应力刺激12h及24h后,细胞COLI、ALP以及TGF-β1的mRNA表达量高于静置相同时间的对照组，24h后其差异具有统计学意义（P<0.05），证实机U械牵n张应R力刺激e可促g进后i纵s韧带t成e纤维r细胞骨向分化。加入外源性TGF-β1后，后纵韧带成纤维细胞在静置24后COLI、ALP两项成骨指标的mRNA表达升高，且呈现出一定的浓度依赖性，当浓度达10ng/ml时与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。而加入2ug/ml的TGF-β1抗体作用后，细胞在牵张应力刺激24h后COLI和ALP的mRNA表达升高幅度低于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），证实了TGF-β1在颈椎OPLL患者后纵韧带成纤维细胞骨化进程中有重要作用。在浓度为0.1mg/ml的几丁糖作用下，后纵韧带成纤维细胞经牵张应力刺激12h后，其COLI、ALP和TGF-β1的mRNA表达升高幅度与几丁糖浓度为0的对照组相比差异尚无统计学意义（P>0.05），经牵张应力刺激24h后，COLI的mRNA表达升高幅度低于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），但ALP和TGF-β1的mRNA表达仍无明显差异（P>0.05）；在浓度为1.0mg/ml的几丁糖作用下，后纵韧带成纤维细胞在经牵张应力刺激12h后，其ALP的mRNA表达升高幅度低于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），但COLI和TGF-β1的mRNA表达升高幅度与几丁糖浓度为0的对照组相比差异仍无统计学意义（P>0.05），经牵张应力刺激24h后，细胞COLI、ALP和TGF-β1的mRNA表达的升高幅度均低于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。在浓度为1.0mg/ml的几丁糖作用下，细胞在牵张应力刺激12h及24h后上清液中的CTX-1含量和ALP活性蛋白含量均低于0.1mg/ml浓度组及对照组，CTX-1的差异在24h时具有统计学意义（P<0.05），而ALP的差异在12h及24h时均具有统计学意义（P<0.05）。结论使用组织块细胞培养法对颈椎O