生物工程导论及生物工程概论复习题

PAGEPAGE44第一章绪论生物工程是生命科学和工程科学的交叉科学。生物工程学科的任务是促进和实现生命科学的实验室研究成果向应用领域的转化。1.1生物工程的学科基础以生物科学和生物技术为基础，结合化学工程、机械工程、控制工程、环境工程等工程学科，研究和发展利用生物体系或其中的一部分生产有益于社会的产品或达到一定社会目标的过程工程科学。生物工程的研究对象包括活的生物体或它们的一部分。生物工程的任务就是为细胞的生长和目标产物积累创造最好的条件，研究开发最适合的工艺路线和设备，实现工业化生产以满足社会需要。1.2生物工程的研究领域生物工程的研究领域包括：基因工程、细胞工程、酶工程、微生物工程（发酵工程）及生物分离工程。1.2.1基因工程DNA是遗传的物质基础，1967年第一个基因工程产品——人胰岛素通过定位突变的方法使所表达的蛋白质产物的结构和功能发生变化，根据需要设计新的蛋白质氨基酸序列，已经发展成为一门新的交叉学科——蛋白质工程。1.2.2细胞工程细胞是构成包括人类、动物、植物和微生物在内的几乎所有生物的基本单元。哺乳动物的干细胞（即未分化的细胞）也具有全能性和无限繁殖的能力。发酵工程和生物分离技术的进步则是提高细胞培养工程和目标产物回收过程效率的可靠保障。1.2.3酶工程几乎所有的酶都是蛋白质，酶又具有催化剂的功能，即能够降低化学反应的活化能、加快反应速率，在反应中不消耗，反应结束时恢复到原来的状态。酶工程是研究酶的分离、提纯及利用酶作为生物催化剂，实现化学转化，合成各种产物或达到人类所需社会目标的工程科学。酶催化反应的特点是很高的效率和专一性1.2.4发酵工程发酵工程已经泛指所有细胞（动物、植物、微生物及基因工程细胞）的大规模培养并获得目标产物的过程。1.2.5生物分离工程与其他分离过程类似，生物技术产品的分离方法也是根据被分离对象及主要杂质的物理化学性质设计分离提纯流程，但是生物技术产品的分离也具有其特殊性，主要表现：(1)目标产物的浓度低（2）目标产物和杂质的物理和化学性质十分接近，而且成分非常复杂（3）目标产物往往具有生物活性（4）在许多应用领域，生物技术产品有很高的纯度和安全性要求。第二章基因工程2.1概述2.1.1基因工程的诞生基因工程的诞生于1973年2.1.1.1理论上的三大发现（1）20世纪40年代发现了生物的遗传物质是DNA1934年Avery（2）20世纪50年代提出了DNA的双螺旋结构1953年Watson和Crick提出了DNA的双螺旋结构（3）20世纪60年代确定了遗传信息的传递方式1961年，Monod和Jacob提出每三个核苷酸组成一个密码子，代表一种氨基酸，1966年全部破译了64个密码，叙述了中心法则，提出遗传信息流，即DNA→RNA→蛋白质2.1.1.2技术上的三大发明(1)工具酶限制性核酸内切酶称为“剪刀”,把DNA连接酶比喻成“缝纫针线”(2)载体(3)逆转录酶1970年,Baltimore等人和Temin等人同时在各自的实验室发现了逆转录酶，打破了中心法则，使真核基因的制备成为可能。在完成以上三大理论发现和三大技术发明后，基因工程诞生的条件已经成熟。1973年，斯坦福大学的Cohen等人进行了另一个体外重组DNA实验并成功地发现了细菌间性状的转移。这是人类历史上第一次有目的地进行基因重组实验，是第一个实现重组体转化的成功例子，1973年被许多科学家称为基因工程元年。体外快速扩增技术即聚合酶链式反应（PCR）2.1.2基因工程的内容2.1.2.1基因工程的定义将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体内复制、转录、翻译表达的操作过程称为基因工程。基因工程的实施至少有四个必要条件：①工具酶②基因③载体④受体细胞基因工程也称为基因克隆或DNA分子克隆2.2基因工程的理论基础2.2.1DNA的结构与功能基因工程的核心是重组DNA2.2.1.1DNA的组成核苷酸分子中有四种不同的碱基，即腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）2.2.1.2DNA结构1953年Watson和Crick提出了DNA的双螺旋结构，阐明了DNA分子的二级结构决定DNA的双螺旋结构的因素有：氢键的形成、碱基的堆积力、磷酸基之间的静电斥力、碱基分子内能的作用等DNA复制有如下特点：①DNA的复制从特定的位点开始，这个位点称为复制起始点，在复制起始点双链DNA解旋，形成复制叉②半保留复制，每一双链体都是由一条亲链和一条新合成的子链组成③DNA的复制具有高度的忠实性④虽然DNA聚合酶是DNA复制的主酶。然而DNA复制是多种酶和蛋白因子协同有序工作的结果。DNA解旋酶的功能是在复制叉处使双螺旋DNA解旋2.2.2DNA的变性、复性与杂交在加热或某些试剂的作用下，DNA配对碱基之间的氢键结构受到破坏，双链DNA的多核苷酸链能完全分离，分离过程称为变性或熔解。当复性的DNA分子由不同的两条单链分子形成时，称为杂交。2.2.3遗传信息的传递方向——中心法则DNA（基因）→RNA→蛋白质（性状）2.2.3.1RNA的转录转录是基因表达的关键一步，DNA分子中所储存的遗传信息，必须转录成信使RNA才能通过蛋白质生物合成的过程转变成具有生物活性的蛋白质。2.2.3.2逆转录和逆转录酶以DNA为模板，在RNA聚合酶（依赖于DNA的RNA聚合酶）的催化下合成RNA的过程称为转录，而将以RNA为模板，在逆转录酶（依赖于DNA的RNA聚合酶）催化下合成DNA的过程称为逆转录。2.2.3.3翻译——蛋白质的生物合成翻译就是将以核苷酸形式编码在mRNA中的信息转变成多肽链中特定的氨基酸顺序。翻译过程是非常复杂的生物反应过程，需要大约200多种以上的生物大分子参与，包括核糖体、mRNA、tRNA、氨酰tRNA合成酶、各种可溶性的蛋白因子（起始因子、延伸因子、释放因子）等参加并协同作用，从而完成蛋白质的生物合成，体现了生物体的功能基因性状。2.2.4基因的表达与调控基因根据功能不同分为结构基因、调节基因和操纵基因。2.3基因工程工具酶基因工程的操作，是分子水平上的操纵，它依赖于一些重要的酶作为工具来对基因进行人工切割和拼接等操作。一般把这些切割DNA分子、进行DNA片段修饰和DNA片段连接等所需的酶称为工具酶。按用途分：①限制性内切酶②连接酶③修饰酶识别和切割双链DNA分子内特殊核苷酸顺序的酶统称为限制性内切酶，简称限制酶。其他基因工程的工具酶：DNA聚合酶、逆转录酶、T4多核苷酸酶和碱性磷酸酶等。2.4基因工程载体2.4.1基因工程载体的定义外源基因必须先同某种传递者结合后才能进入细菌和动植物受体细胞，这种能承载外源DNA片段（基因）并带入受体细胞的传递者称为基因工程载体。2.4.2用于原核生物宿主的载体2.4.2.1质粒载体质粒是能自主复制的双链闭合环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体外的方式存在。某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒。2.4.2.3柯斯质粒柯斯质粒是将λ噬菌体的粘性末端和大肠菌质粒的抗氨苄西林素基因相连而获得的人工载体,含一个复制起点,一个或多个限制酶切位点、一个cos片段和抗药基因，能加入40~50kb的外源DNA，常用于构建真核生物基因组文库。2.4.4.1Ti质粒2.4.5用于动物宿主的载体2.4.5.1用于昆虫细胞的载体杆状病毒2.4.5.2用于哺乳动物细胞的载体猿猴空泡病毒40（SV40）作为载体2.4.6基因工程载体的必备条件和简单分类必备条件能够进入宿主细胞载体可以在宿主细胞中独立复制要有筛选标记对多种限制酶有单一或较少的切点,最好是一个切点DNA重组使用的载体分类①克隆载体②穿梭载体③表达载体2.5目的基因的获得基因是具有遗传功能的DNA分子上的片段,平均长度约1000bp。1975年Sanger等人发明了加减法，能够直接分析100~500个核苷酸的DNA片段，取得了DNA测序的重大突破。基因库也叫基因组文库，是指用克隆的方法将一种生物的全部基因组长期以重组体方式保持在适当的宿主中。基因文库，也叫cDNA文库，经克隆后形成文库，cDNA文库和基因库的不同在于，cDNA文库在mRNA拼接过程中已经除去了内含子等成分，便于DNA重组是直接使用。2.5.1.2基因组文库的筛选有三种通用的鉴定方法：一是用标记的DNA探针进行DNA杂交；二是用抗体对蛋白质进行免疫杂交：三是对蛋白质的活性进行鉴定。DNA杂交法双链DNA分子可以分子可以通过热处理或碱变性的方法变性成单链DNA分子。退火后有的DNA的两条链分别来自不同的DNA分子，即形成了杂合DNA分子。免疫反应法若一个目的基因DNA序列可以转录和翻译成蛋白质，那么只要出现这种蛋白质，甚至只需要该蛋白质的一部分，就可以用免疫的方法检测。酶活性法如果目的基因编码一种酶，而这种酶又是宿主细胞所不能编码的，那么就可以通过检查酶活性来筛选目的基因的重组子。2.5.2真核生物目的基因的获得（cDNA方法、DNA的化学合成法、PCR法）2.5.2.1cDNA方法cDNA文库的组建步骤：①分离表达目的基因的组织或细胞②从组织或细胞中制备总体RNA和mRNA③合成第一条cDNA链，合成第一条cDNA链需要mRNA作为模板、预先设计的cDNA合成引物、逆转录酶及4种脱氧核苷三磷酸和相应的缓冲液等④第二条cDNA链合成⑤cDNA的甲基化和接头的加入⑥双链cDNA与载体的连接2.7目的基因导入受体细胞目前用做基因克隆受体的原核生物主要是大肠杆菌和枯草杆菌。最早应用于基因工程，至今仍最广泛使用的受体细胞是大肠杆菌。大肠杆菌表达产物常常在细胞内形成不溶性包涵体，以不正常的蛋白质折叠形式存在，产物无生物活性。枯草杆菌主要用于分泌型表达，缺点是表达产物容易被枯草杆菌分泌的蛋白酶水解，而且重组质粒在枯草杆菌中的稳定性较差。将外源重组子分子导入受体细胞的方法很多，其中转化（转染）和转导主要适用于原核的细菌细胞和低等的真核细胞（酵母），而显微注射和电穿孔则主要应用于高等动植物的真核细胞。原核细胞的转化过程就是一个携带基因的外源DNA分子通过与膜结合进入受体细胞、并在胞内复制和表达的过程。转化过程包括制备感受态细胞和转化处理。感受态细胞是指处于摄取外界DNA分子的生理状态的细胞。转导是指通过噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径将外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。聚乙二醇（PFG）和多聚赖氨酸等是协助DNA转移的常用多聚物，可在原生质体表面形成颗粒沉淀，使DNA进入细胞内。哺乳动物细胞能捕获粘性附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀物，并能将DNA转入细胞中，从而实现外源基因的导入。脂质体是人工构建的由磷脂双分子层组成的膜状结构。粒子轰击法普遍应用于转基因植物，无论植物器官或组织都能应用。2.8重组体的筛选重组体筛选的方法很多，归纳起来可分为两种：在核算水平或蛋白质水平上筛选。从核算水平筛选克隆子可以通过核酸杂交的方法。这类方法根据DNA-DNA、DNA-RNA碱基配对的原理，以使用基因探针技术为核心。从蛋白质水平上筛选克隆子的方法主要有：检测抗生素抗性及营养缺陷型、观测噬菌斑的形成、检测目标酶的活性、目标蛋白的免疫特性和生物活性等。2.8.1利用抗生素抗性基因2.8.2营养缺陷互补法若宿主细胞属于某一营养缺陷型，则在培养这种细胞时的培养基中必须加入该营养物质后，细胞才能生长；如果重组后进入这种细胞的外源DNA中除了含有目的基因外再插入一个能表达该营养物质的基因，就实现了营养缺陷互补，使得重组细胞具有完整的系列代谢能力，培养基中即使不加营养物质也能生长2.8.3核酸杂交法2.8.4通过免疫反应筛选2.8.5通过酶活性筛选2.9目的基因的高效表达大肠杆菌的许多优点确保了它在基因工程中的地位，是一个最常用的基因高效表达系统。枯草杆菌是另一种常用的原核表达系统。酵母菌是常用的真核生物表达系统2.9.2影响目的基因表达的基本因素影响外源DNA转录的主要因素是启动子的强弱。启动子时宿主细胞的RNA聚合酶专一结合并其实转录合成mRNA聚合酶识别，因此必须将外源基因置于大肠杆菌启动子控制下。Lac、lacUV5、tac等都是常用的强启动子。转录终止信号也会影响转录，人工合成的基因后面一定要装配合适的终止子，以减少能来那个消耗及保持转录的准确性。强启动子往往需要强终止子予以匹配。翻译水平影响外源基因表达的重要因素是翻译起始区。翻译是在核糖体上进行的，因此mRNA上必须有核核糖体的结合部位（称SD序列）。对于人工合成的基因来说，密码子的优化亦很重要，应该采用宿主菌的偏爱密码子、保持嘌呤和嘧啶碱基配对反应的能量平衡。翻译后的加工修饰也将影响表达水平。包括切除新生肽键N端甲酰蛋氨酸、形成二硫键、糖基化和肽键本身的后加工等。2.9.3目的基因的不溶性高效表达采用高密度培养及工程菌生长和诱导表达相分离的两段培养技术，包涵体的产量可以达到很高的水平，对于不需要翻译后修饰的蛋白质产物，利用生长速度快、培养基简单的大肠杆菌为宿主细胞，采用不溶性融合蛋白表达策略仍是一种提高目的基因表达效率的很好选择。2.9.4目的基因的高效可溶性表达对于不少目的蛋白，可通过降低启动子强度和减少培养温度的手段成功地实现高水平的可溶性表达。2.9.5目的建议你的高效分泌型表达目的基因的分泌型表达有两种情形：目的蛋白分泌到细胞周质中和目的蛋白转运到细胞周质后再分泌到细胞外。2.9.6基因工程宿主菌的改造目前基因工程常用宿主是大肠杆菌K12系列和B系列已经发现在一种细菌（透明菌）内含有起输送氧作用的血红蛋白基因，通过将血红蛋白基因整合到大肠杆菌宿主中后，大肠杆菌就能在贫氧条件下培养生长，从而提高了菌体生长密度和外源蛋白的表达产率。2.9.7利用细胞培养工程手段提高基因表达水平2.9.7.1提高工程菌的质粒稳定性提高工程菌的质粒稳定性需要从质粒构建和培养方法改进两条途径进行研究。在质粒构建时，一般都插入抗生素抗性基因，另外，在质粒构建时应该加入称为par和cer的位点，par位点能够在细胞分裂工程中使质粒分布更均匀，cer位点则能够防止多聚体质粒的形成，从而能从源头上提高质粒稳定性。采用细胞生长期和诱导表达时期分开的分段培养策略。采用固定化细胞培养也有利于提高质粒的稳定性大肠杆菌的培养可分为合成培养基、半合成培养基和复合培养基。高密度培养采用半合成培养基减少乙酸等抑制性副产物的形成（1）降低比生长速率（2）降低培养温度（3）限制性流加葡萄糖（4）基因工程菌培养和乙酸分离耦合过程2.10.1基因工程制药1982年第一个基因工程药物人胰岛素就在美国的EliLilly公司研究成功并投放市场。基因工程药物常分为四类：激素和多肽类、酶、重组疫苗及单克隆抗体。第一类基因工程药物主要针对因缺乏天然内源性蛋白所引起的疾病，这类蛋白质主要以激素类为代表，如人胰岛素、人生长激素、降钙素等。第二类基因工程药物属于酶类，如tPA、尿激酶及链激酶等。第三类属于疫苗，分为基因工程亚单位疫苗、载体疫苗、核酸疫苗、基因缺少疫苗及蛋白质工程疫苗等。第四类产物单克隆抗体2.10.1.21989年我国第一个基因工程药物干扰素-αlb上市，标志着我国基因工程制药实现了零的突破。第三章细胞是构成生物体的基本单元，细胞工程就是通过大规模的细胞或组织培养，获得所需要的产品。细胞可以分为动物细胞，植物细胞和微生物细胞三大类。1999年12月，美国科学杂志公布了当年世界科学进展的评定结果，肝细胞的研究陈果排名在举世瞩目耗资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展的首位，那是因为肝细胞的发现否定了动物细胞不具有全能型的传统观念，为人类健康提供了新希望，干细胞是一类极特殊的来自胚胎或成体的未分化细胞，同时具有不断增长繁殖的功能以及想多种功能细胞分化的潜能。由于具备不断增值与定向分化的双重功能，肝细胞具有可用于组织器官生产或新药删选的巨大潜力。离体培养环境可分为铁臂和复生长两种方式。动物细胞的培养主要有间接培养，流加培养和关注培养。非致死和致死两大类。少数属于非致死的细胞，如癌细胞，表皮细胞及成纤维细胞等。一般，将从特定功能组织器官中分离后无法增值或处于未稳定传代培养前的动物细胞称为原代或初代细胞，而将能温度稳定传代培养并能连续生长繁殖的细胞称为连续化细胞。原代细胞是直接从组织器官中分离得到的，原代细胞培养一般由组织器官解剖分离，解聚和离体细胞培养三个步骤组成，解聚分机械分离和酶解两种方法。酶法分离是目前应用最广的动物细胞分离法，最常使用的酶有胰蛋白酶，胶原酶，弹性蛋白酶等。它们可以单独或混合使用。原代培养为一系列细胞培养的第一步，原代细胞的生理就带些特性差异非常大，属于不稳定细胞系。一旦原代细胞进行了传代培养（亦称转种），便称为细胞系。细胞系中往往存在有若干表型，相似或相异的细胞世界系，若其中一世系，经过选殖克隆、物理性细胞分离，或其他选择技术，而在培养的细胞群体中辨识出其特殊表型性质，该细胞便称为细胞株。动物细胞呈圆形，如线粒体是进行呼吸的地方，高尔基体是进行蛋白质糖基化和折叠等后加工的场所，粗内质网膜则是合成蛋白质的场所等。动物细胞的离体培养最初采用天然体液培养基，如小鸡胚胎萃取液、血清、淋巴液等。化学成为明确的培养基配方。旋转瓶和中空纤维反应器是比较常见的动物细胞大规模贴壁培养的反应器。微载体是一种能悬浮于溶液中，直径为100-200um的球状颗粒。聚苯乙烯、葡聚糖和胶原等都是通用的为载体材料，通过加工而成为球状颗粒。悬浮培养反应器大多在微生物反应器基础上发展形成，以通气搅拌罐最常见细胞悬浮培养操作方式有间歇培养，补料-分批培养和灌流培养等。植物细胞培养具有全能型即单一的离体细胞在一定环境下分化成不同的细胞组织乃至整个植株。植物体受到切割等伤害后会产生愈伤组织，愈伤组织的形成实际上是一种创伤反应，是植物脱分化的结果，产生愈伤组织的植物器官可以是种子，根、茎、叶等。进行植物细胞大估摸培养的基本步骤是，1建立细胞株，2，将愈伤组织转移到液体培养集中，3.扩大培养，现已建立了针对植物细胞的而不培养法，及使用生长培养及使细胞大量增殖，达到一定的细胞密度，然后再改用适合细胞产物积累得到培养基，促进细胞启动次级代谢途径并提高产物的产量。培养条件的优化物理因素，1光对光的需要与否，2温度25.左右3PH值，5-6之间。化学因素1溶氧，2植物细胞悬浮培养的培养基。植物细胞培养的细胞生理特性1植物细胞尺寸较大，2植物细胞对剪切力非常敏感，3易沉降。4植物细胞生长缓慢，5植物细胞生长与次级代谢产物的合成无显著关联，6易染菌。从鞘蕊花属细胞培养得到的迷迭香酸，以细胞干重计含量高达27%。自1996年美国大面积推广种植转基因作物以后，转基因食品以惊人的速度向全球扩散。常见的建立转基因动物方法有显微注射法，逆转录病毒法与干细胞法等方法，1显微注射法2逆转录病毒感染法3胚胎干细胞4精子载体法5体细胞核移植法从转基因动物的乳汁中获取对人类有益的基因工程产物，不但具有产量高，容易提纯的优点，而且表达的蛋白经过了充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。因此被称为动物乳腺生物反应器。干细胞即未分化的细胞，是一类具有自我更新和分化发育潜能的原始细胞。干细胞分胚胎干细胞和组织肝细胞两类，肝细胞研究最早是从胚胎干细胞开始的，经过6个月的增殖，这些胚胎干细胞，胚胎肝细胞具有形成所有组织和器官的能力，具有全能型，只能发育分化成一个系统中的几种细胞，但不能生成其他系统的细胞，因此这些干细胞称为“多能”干细胞，“多能”干细胞继续分化发育，将生成更加专门化的细胞，即“专能”干细胞。它们只能再增殖分化为一种类型的“终端”细胞。多能及专能干细胞统称为组织干细胞。由于干细胞的数目很少，因此需要在体外对干细胞进行非分化性增殖，这需要许多生长因子和间质细胞的共培养，纤维细胞生长因子得到培养集中培养，上皮生长因子，胚胎干细胞人体发育起始于卵子的受精，产生一个能发育为完整有机体潜能的单细胞，及全能型的受精卵造血干细胞造血干细胞分布于骨髓，外周血和脐血中，尤其脐血含有丰富的造血干细胞。造血干细胞是造血细胞的种子，体内所有血细胞，包括红细胞、白细胞、血小板等，都是由它分化发育而来，也是人们认识最早的干细胞之一。间充质干细胞是分化发展为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌肉细胞和骨髓基质细胞的干细胞，在成年后主要存在于骨膜下和骨髓腔中，也分布于肌肉，胸腺和皮肤中神经及其他干细胞存在于成体神经组织中，具有再生神经元，星形胶质细胞和少突状细胞的潜在能力，组织工程的研究几乎遍及人体所有的器官或组织，20世纪90年代，美国FDA已批准组织皮肤工程及自体软骨细胞移植修复关键软骨部分缺损益用于临床，并开始产业化进程组织工程按组织器官的构筑方式可分为两个部分：组织再生工程和组织替代工程组织工程的三种基本要素是细胞、支架材料与调节因子人工支架的作用包括人工细胞外基质、空间确保膜、生长因子控制释放、组织生长的支撑体、免疫隔离膜和生物反应器等。酶是一类生物催化剂，其化学本质为蛋白质，同时又具有催化剂的功能。第四章酶工程酶是一类生物催化剂，其化学本质是蛋白质，同时又具有催化剂的功能。酶工程是蛋白质化学与工程学相互交叉渗透、相互结合并发展而形成的一门新的技术科学。酶工程是研究和开发酶的生产、酶的分离纯化、酶的固定化、酶及固定化酶的反应器、酶与固定化酶的应用等的工程科学酶的命名1酶是依据酶作用的反应物2酶所催化的反应性质来命名3酶的来源或酶的其他特点来取名酶分为6类，1氧化还原酶类，2，转移酶类3，水解酶类4.裂合酶类5异构酶类，6，合成酶或链接酶类。酶的活力是指酶催化特定底物转化成产物的速率。酶的活力还常常是制定酶制剂价格的最重要的参考指标。酶活力的单位是：单位时间、单位质量酶蛋白所催化的底物反应或产物生成的物质的量酶的三级结构是在二级结构的基础上，借助于各种次级键盘绕城具有特定肽链走向的紧密球状构象，寡聚酶是有2个或2个以上亚基组成的酶，分子质量一般高于30KD，具有四级结构酶催化的特点，1，反应条件温和，2，极高的催化效率，3，高度专一性，（底物专一性、反应专一性、立体化专一性）4，辅酶和辅因子，许多酶只有在某些非蛋白质成分存在时才表现出催化作用，人们将这些非蛋白质成分称为辅助因子，其中能通过透析出去的称为辅酶，不能通过透析除去的就叫做辅基因子，5.酶催化活性的调控机制酶反应速率与底物浓度的关系P103E代表游离酶，ES为酶与底物的复合物，S为底物，P为产物，k+1、k-1、k+2为相应各步反应速率常数。固定酶具有的优点：①可以重复多次使用，而且在大多数情况下，酶的稳定性也有明显改善②催化反应后，酶与底物以及产物容易分开，产物中没有残留酶，易于分离纯化，使产品的质量有大的提高③反应条件易于控制，可实现生物催化反应的连续化和自动控制④酶的利用效率高，单位酶量催化的底物量增加，而用酶量则大为减少⑤比水溶性酶更合适于多酶催化反应。固定化方法按所用载体和操作方法的差异分为：载体结合法、包埋法和交联法等三类，载体结合法包括物理吸附法、离子结合法、螯合法和共价结合法等，包埋法包括聚合物包埋法、疏水相互作用法、微胶囊包埋法、脂质体包埋法等只有L型氨基酸才具有生理活性，外消旋氨基酸必须转化为L型氨基酸，主要的拆分方法有物理化学法、化学法和酶法等三种，其中以酶法最为有效，能够生产纯度较高的L氨基酸。生物传感器的发展非常迅速，生物传感器是用生物活性物质做敏感器件，配以适当的换能器所构成的分析工具，大致可以分为酶传感器、微生物敏感器、免疫传感器和场效应晶体传感器等四大类。其中利用酶的催化作用制成的酶传感器是问世最早、成熟度最高的一类生物传感器。P116蛋白质侧链基团修饰可以改变蛋白质表面电荷和疏水性，从而影响其催化活性和稳定性。酶蛋白中个别氨基酸的置换可以采用点突变的方法很容易就可以完成，点突变是研究蛋白质结构与功能关系的重要工具。一般地说，经过修饰的酶可显著提高酶活力、增加稳定性或降低抗原性、显著提高酶的使用范围和应用价值。酶的新用途——靶酶及酶标药物每一种酶都有一些特定的抑制剂，通常将这种酶称为该抑制剂的靶酶。靶酶的意义传统上，人们只有根据某些化合物对特定疾病有一定治疗作用作为设计药物的线索，大量合成出其类似物，从中进行筛选，并获得某种疗效最好的药物。根据统计，每种统计，每种新药的上市需要从大约10万种化合物中筛选得到，可以想象新药研究和开发所需的巨大人力、物力和资金投入!随着人类基因组计划完成对疾病引发机理的深入研究，人们发现许多疾病的发生都是由于基因突变引起的酶蛋白表达水平的变化引起的。这样一来，只要对这些酶蛋白的活性水平进行调节，就可能治愈疾病。这种对疾病具有关键作用的酶就是靶酶，筛选得到的能影响和调节靶酶活性并能治疗疾病的药物就成为酶标药物。非水系统中的酶催化的特点①绝大多数有机化合物在非水系统中的溶解度高于水溶液②根据热力学原理，一些在水中不可能进行的反应，有可能在非水系统中进行③与水相比，酶在非水系统中的稳定性比较高④从非水系统中回收反应产物比从水相中容易⑤在非水系统中酶很容易回收和反复使用。根据酶的作用原理，用人工方法合成的具有活性和催化作用的非蛋白质结构的化合物称为人工合成酶或人工模拟酶。P120分子印记技术自20世纪80年代初Cech和Altman各自独立地发现了RNA具有生物催化功能后，人们发现除蛋白质才能有酶的催化功能以外，某些RNA和DNA分子也具有催化功能。目前已知的核酸酶大致上可以分为剪切型核酸酶和剪接型核酸酶。抗体酶是指通过一系列化学与生物方法制备的具有催化活性的抗体。第五章微生物工程按细胞生长是否需要氧气，发酵过程可以分为两类：好氧和厌氧发酵。好氧发酵过程以氧作为电子受体。典型的如动植物细胞培养，利用微生物发酵生产抗生素、有机酸、氨基酸、酶制剂、单细胞蛋白等需要向反应器中通入无菌空气，有时甚至纯氧以满足微生物生长和代谢对氧的需求。由于氧在水中的溶解度很低。微生物工程的发展史大约在9000年前就已经开始了原始的啤酒生产。公元前6000年左右，在黑海与里海的外高加索地区，就已经开始种植葡萄和酿制葡萄酒。在公元前2400年左右，在埃及第五王朝的墓葬壁画上，就有烤制面包和酿酒的大幅浮雕。从19世纪末-20世纪30年代，相继出现了乳酸、乙醇、丙酮/丁醇、甘油、面包酵母等工业化生产的发酵产品。近30年来，随着人类在基因水平上改造微生物的技术——基因工程、代谢工程、组合生物合成等技术的突飞猛进，发酵工业的应用领域迅速扩展，发酵工程的研究内容也日益丰富。荷兰的业余显微镜制造者列文虎克利用自己制造的显微镜首先发现了肉眼看不见的微生物，并描绘了它们的细节，为人类打开了认识微观世界生命活动的大门。最早确定发酵与微生物关系的是著名的微生物学家巴斯德。微生物纯种培养技术在自然环境中，一种微生物常常和其他微生物互相混杂在一起生活。不同微生物的发酵或引起的疾病是不同的。所以，要研究某种疾病或某种发酵过程，必须把混杂在一起生活的微生物按种类分开，并分别进行培养，即纯种培养。我们今天的所有基础和应用微生物学研究，都离不开培养基、无菌操作、分离和纯种培养技术。德国医生和微生物学家科赫发明了固体培养基。采用科赫的划线分离方法，很容易就能把一个个单独的菌落挑出来，得到纯种微生物。常见的工业微生物它们的个体虽然微小，但由于其群体数量惊人地庞大，因而具有极强的代谢能力。物体的表面积与体积之比称为比表面积。个体越小，则比表面积越大，也就是说单位体积物体与环境的接触面积越大。比表面积非常有利于微生物通过它们的身体表面积吸收营养和排泄废物，这就使它们的代谢能力特别强。由于微生物个体小、繁殖快、数量多，使微生物具有分布广、种类多、容易变异、适应能力强等特点。微生物代谢能力强、生长繁殖快的特点使其非常适合于工业和其他领域。细菌细菌是单细胞原核生物，个体极小，没有成型的细胞核，一般以典型的“一分为二”的裂殖方式繁殖。细菌根据外形可以分为球菌、杆菌和螺旋菌三个大类。球菌按其细胞排列方式又可以进一步分为单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌和链球菌等。有些细胞除了具有一般的细胞结构和细胞质内含物外，还具有一些特殊的结构，如荚膜、芽孢、鞭毛、绒毛等。芽孢是细菌的休眠体。有些杆菌和弧菌还能长出细长的丝状物称为鞭毛，主要成分是蛋白质。鞭毛是细菌的运动器官，鞭毛的旋转可以推进细菌迅速运动。球菌通常没有鞭毛，杆菌中有的有，有的没有，有的则在生长过程中的某一阶段才有。弧菌和螺旋菌一般都有鞭毛。除了染色体DNA外，很多细菌细胞内还存在染色体外的遗传物质，称为质粒。放线菌目前已经发现的约6000种抗生素，有4000多种是由放线菌产生的。放线菌有许多交织在一起的纤细菌体，叫菌丝。在固体营养物质上生长时，部分菌丝生长在培养基内负责吸收营养，因而称为营养菌丝或基内菌丝。长到一定阶段便开始繁殖，形成各种各样形态各异的孢子。酵母酵母菌是一类最简单的真核微生物（真菌），它的细胞中有结构完整的细胞核。生长特性绝大多数酵母都是单细胞，但是体积比细菌要大得多，一般呈球形、卵形或柠檬形。第二章《基因工程》复习题一、选择题1.限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是（D）A修复自身的遗传缺陷 B促进自身的基因重组C强化自身的核酸代谢 D提高自身的防御能力2.生物工程的上游技术是（D）A基因工程及分离工程 B基因工程及发酵工程C基因工程及细胞工程 D基因工程及蛋白质工程3.基因工程操作的三大基本元件是:(I供体II受体III载体IV抗体V配体)（A）A.I+II+IIIB.I+III+IVC.II+III+IVD.II+IV+V4.多聚接头（Polylinker）指的是（A）A.含有多种限制性内切酶识别及切割顺序的人工DNA片段B.含有多种复制起始区的人工DNA片段C.含有多种SD顺序的人工DNA片段D.含有多种启动基因的人工DNA片段5.下列五个DNA片段中含有回文结构的是（D）A.GAAACTGCTTTGAC B.GAAACTGGAAACTGC.GAAACTGGTCAAAG D.GAAACTGCAGTTTC6.若将含有5'末端4碱基突出的外源DNA片段插入到含有3'末端4碱基突出的载体质粒上，又必须保证连接区域的碱基对数目既不增加也不减少，则需用的工具酶是（D）IT4-DNA聚合酶IIKlenowIIIT4-DNA连接酶IV碱性磷酸单酯酶A.IIIB.I+IIIC.II+IIID.I+II+III7.下列有关连接反应的叙述，错误的是（A）A.连接反应的最佳温度为37℃B.连接反应缓冲体系的甘油浓度应低于10%C.连接反应缓冲体系的ATP浓度不能高于1mMD.连接酶通常应过量2-5倍8.T4-DNA连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段DNA片段连接在一起，其底物的关键基团是（D）A.2'-OH和5'–P B.2'-OH和3'-PC.3'-OH和5'–P D.5'-OH和3'-P9.载体的功能是(I运送外源基因高效进入受体细胞II为外源基因提供复制能力III为外源基因提供整合能力)（D）A.I B.I+III C.II+III D.I+II+III10.克隆菌扩增的目的是(I增殖外源基因拷贝II表达标记基因III表达外源基因)（D）A.I+II B.I+III C.II+III D.I+II+III11.下列各组用于外源基因表达的受体细胞及其特点的对应关系中，错误的是（C）A.大肠杆菌－繁殖迅速 B.枯草杆菌－分泌机制健全C.链霉菌－遗传稳定 D.酵母菌－表达产物具有真核性12.考斯质粒（cosmid）是一种（B）A.天然质粒载体B.由λ-DNA的cos区与一质粒重组而成的载体C.具有溶原性质的载体D.能在受体细胞内复制并包装的载体13.某一重组DNA（6.2kb）的载体部分有两个SmaI酶切位点。用SmaI酶切后凝胶电泳上出现四条长度不同的带子，其长度总和与已知数据吻合，该重组分子插入片段上的SmaI酶切位点共有（D）A.4个 B.3个 C.2个 D.至少2个14.外源基因在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达的优点是(I融合基因能稳定扩增II融合蛋白能抗蛋白酶的降解III表达产物易于亲和层析分离)（D）A.III B.I+II C.I+III D.II+III15.提高重组率的方法包括(I加大外源DNA与载体的分子之比II载体分子除磷III连接酶过量IV延长连接反应时间)（A）A.I+II B.I+II+III C.I+III+IV D.II+III+IV16.识别基因序列不同，但酶切后产生的粘性末端相同的一类酶为（B）A.同工酶B.同尾酶C.同裂酶D.同位酶17.pBR322质粒作为基因克隆载体应有下列何种调控元件（ABD）A.AmPr和TetrB.ori复制子C.LacZ标记D.多克隆位点18.λ噬菌体外包装目的基因片段的大小应为（D）A.小于λ噬菌体DNA的50%B.小于噬菌体DNA的75%C.大于λ噬菌体DNA的105%D.为λ噬菌体DNA的75%～105%19.DNA连接酶的功能是(AB)A.恢复3’-OH与5’-P之间的磷酸二酯键B.恢复缺口C.恢复裂口D.可使平末端与粘性末端连接20.PUC质粒作为基因克隆载体应有下列何种调控元件(ABCD)A.AmPrB.ori复制子C.LacZ标记D.多克隆位点21.下列属于获取目的基因的方法的是(D)①利用mRNA反转录形成②从基因组文库中提取③从受体细胞中提取④利用PCR技术⑤利用DNA转录 ⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥22.的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是BA．提高受体细胞在自然环境中的耐药性B．有利于对目的基因是否导入进行检测C．增加质粒分子的分子量D．便于与外源基因连接23.有关基因工程的叙述正确的是DA．限制酶只在获得目的基因时才用B．重组质粒的形成是在细胞内完成的C．质粒都可作为运载体D．蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料24.哪项不是基因表达载体的组成部分(B)A.启动子B.终止密码C.标记基因D.目的基因25.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法(B)A．基因枪法B．显微注射法 C.农杆菌转化法D．花粉管通道法26.以下说法正确的是（C）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D、基因控制的性状都能在后代表现出来27.不属于质粒被选为基因运载体的理由是（D）A、能复制B、有多个限制酶切点C、具有标记基因D、它是环状DNA28.有关基因工程的叙述中，错误的是（A）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B、限制性内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、人工合成目的基因不用限制性内切酶29.有关基因工程的叙述正确的是（D）A、限制酶只在获得目的基因时才用B、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都可作为运载体D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料30.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（C）A、人工合成目的基因B、目的基因与运载体结合C、将目的基因导入受体细胞D、目的基因的检测和表达31.下列获取目的基因的方法中需要模板链是（B）A.从基因文库中获取目的基因B.利用PCR技术扩增目的基因C.反转录法D.通过DNA合成仪利用化学方法人工合成32.下列有关基因工程的叙述中，错误的是ACA、DNA连接酶将粘性末端的碱基对连接起来B、基因探针是指用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子C、基因治疗主要是对有缺陷的进行修复D、蛋白质中氨基酸序列可为合成目的基因提供资料二、是非判断题1.DNA连接酶是一种能催化二条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，因此该酶既可修复基因序列中的缺口，也可修复裂口。（×）2.质粒提取后，在琼脂糖电泳出现一条带时说明质粒提取纯度高，当为三条带时为纯度不高。（×）3、入噬菌体的插入型载体只有一个单一限制酶切点，替换型载体有2个成对的限制性酶切点。（√）4、原核细胞和真核细胞转录的mRNA均具有与rRNA结合的SD序列，以利于进行有效的转录。（×）5、cDNA文库是包含有细胞中所有mRNA，因此该文库能包含细胞所有的遗传信息。（X）1．基因工程可改变生物或其分子的遗传物质（√）2．通过限制性核酸内切酶和DNA连接酶等作用，在体外将不同来源的DNA片断重新组合成新的DNA分子(重组DNA)。（√）3．基因的“剪刀”是限制性内切酶（√）4．基因的“针线”是DNA连接酶（√）5．基因的“运输工具”是载体（√）6．基因的“剪刀”是DNA连接酶（×）7．基因的“针线”是限制性内切酶（×）8．将目的基因与载体连接过程是由限制性内切酶来完成。（×）9.将目的基因与载体连接过程是由DNA连接酶来完成。（√）10.通过基因工程菌可生产胰岛素、人生长激素、干扰素等蛋白质药物。（√）三、填空题1、在LacI标记基因插入外源基因，经IPTG诱导，在X-gal培养基中显白色，为阳性克隆，未插入基因的克隆显蓝色，为阴性克隆。2、理想的质粒克隆载体应具备以下基本条件，如能自主复制、一种或多种限制酶的酶切位点、筛选标记、分子量小易拷贝。3、点突变的基因系列在碱基替换中，若为一个嘌呤换成另一个嘌呤或一个嘧啶换成另一个嘧啶者称转换，若一个嘌呤换成一个嘧啶或一个嘧啶换成一个嘌呤者称颠换。4、基因表达的四大表达系统分别为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞。5、基因与载体的平末端连接方法有哪些T4连接酶连接法。末端核苷酸转移酶加同聚物尾巴后，再用DNA连接酶进行连接；化学合成衔接物后连接DNA分子。5、目的基因与载体连接方式有哪些1)粘性末端连接；2）平头末端连接；3）人工接头法；4）同源多聚尾连接法6、如何利用抗性标记基因筛选阳性克隆？抗性标记筛选；抗性基因插入失活筛选；LacZ基因失活筛选。7、核酸操作的基本技术有哪些①核酸提取与纯化②核酸的检测与保存③核酸的凝胶电泳④核酸分子杂交8、基因工程所需的基本条件1、用于核酸操作的工具酶；2、用于基因克隆的载体；3、用于基因转移的受体菌或细胞。9、Klenow酶在有dNTP情况下，呈现DNA聚合酶活性，在没有dNTP情况下呈现外切酶活性。10、利用PCR技术扩增目的基因①概念：PCR全称为_____聚合酶链式反应__________，是一项在生物__体外__复制____特定DNA片段___的核酸合成技术②原理：__DNA复制________③条件：_____已知基因的核苷酸序列______四种脱氧核苷酸______一对引物______、_____DNA聚合酶____________________.前提条件：④方式：以_指数____方式扩增，即__2n__（n为扩增循环的次数）⑤结果使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增11．PCR技术扩增过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成____单链DNAb、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部__双链______。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的__DNA链______。DNA的四种核酸的碱基分别是:胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤。25．在基因工程中应用的酶类统称为工具酶。名词解释1.同尾酶某些限制性内切酶识别的碱基顺序不同，但酶切后产生同样粘性末端的两种酶2.柯斯（C0S）质粒带有λ噬菌体的COS位点和整个pBR322的DNA顺序的大肠杆菌质粒。3.SD序列为mRNA能在细菌核糖体上产生有效结合和转译的特殊序列。4.质粒不亲和性：在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能够在同一宿主细胞系中稳定地共存的现象。5.cDNA文库：是指某生物某一发育时期所转录形成的cDNA片段与某种载体连接而成的克隆的集合。6.穿梭质粒载体：指一类由人工构建的具有两种不同复制起点的选择标记，因而可在两种不同宿主细胞中存活和复制的质粒载体。7.基因(gene)具有特定功能的DNA片段，这些片段有的编码蛋白质，有的编码rRNA、tRNA，有的则是与复制、转录调控有关的DNA序列。8.基因重组:由于不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程。9.基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的新的生物类型和生物产品10.目的基因(objectivegene)：又叫靶基因(targetgene)，是指根据基因工程的目的,设计的所需要的某些DNA分子片段，它含有一种或几种遗传信息的全套密码(code)11.基因表达

基因表达(geneexpression)是指细胞在生命过程中,把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子.生物体内的各种功能蛋白质和酶都是同相应的结构基因编码的.12.双功能抗体

将识别效应细胞的抗体和识别靶细胞的抗体联结在一起,制成双功能性抗体,称为双特异性抗体.如由识别肿瘤抗原的抗体和识别细胞毒性免疫效应细胞(CTL细胞,NK细胞,LAK细胞)表面分子的抗体(CD3抗体或CD16抗体)制成的双特异性抗体,有利于免疫效应细胞发挥抗肿瘤作用.五问答题1.真核细胞基因组中的基因常有内含子存在，能否在原核细胞中表达？能，为什么？不能，为什么？不能，因为原核细胞缺乏对真核基因中内含子的剪接功能和转录后加工系统。原核生物必须有相应的原核RNA聚合酶可识别原核细胞的启动子,以催化RNA的合成。基因表达是以操纵子为单位，操纵子由数个相关的结构基因和调控功能的部位组成的。因此在构建原核表达载体时必须有1个强的原核启动子及其两侧的调控序列。2.质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？目的基因片断与载体由相同的单一限制性核酸内切酶（如EcoRI）消化酶切后,两者的两端均具有相同的粘性末端,称为单酶切点的粘性末端,又称全同源性粘性末端⑴高背景载体经单一限制性核酸内切酶切割后,载体分子易于自我环化,既不利于目的基因的重组连接,大大降低阳性克隆效率,又可使非重组性载体造成高背景。为了防止载体的自我环化，通常用碱性磷酸酶去除载体粘性末端的5’-P以抑制DNA的自我环化。在连接反应中,具有5’-P，的目的基因DNA片断可有效地与去磷酸化质粒DNA载体通过粘性末端发生互补连接,尽管产生的重组DNA分子于连接点含有两个缺口的开环分子,尽管在转化时其转化效率高于线性低于闭和环,但转化大肠杆菌后,在菌体内其缺口可获得修复。⑵双向插入经单一限制核酸内切酶（如EcoRI）切割的目的基因和载体,因二者的粘性末端是相同的,因此在连接反应中,目的基因可发生双向插入,载体对目的基因表达是有方向的,而目的基因可双向与之相连,这种连接若以克隆目的基因片段为目的没有影响,若以表达为目的,我们就要对插入的片段进行方向鉴定,因目的基因由起始密码子向终止密码子方向表达是定向转录的,一旦启动子与目的基因编码顺序方向相反就不能正确转录目的基因的mRNA。若构建表达DNA重组体选用双酶切切割目的基因和载体，可使目的基因与载体的连接发生定向连接重组,以便定向克隆。3.将外源性DNA克隆到-LacZ区段的插入型噬菌体上后，如何筛选重组噬菌体？β-半乳糖苷酶失活的插入型载体，在其基因组中含有一个大肠杆菌的lacZ区段，此区段编码有β-半乳糖苷酶基因lacZ，在诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）存在下，β-半乳糖苷酶能作用X-gal(5-溴-4-氯3-吲哚-β-D-半乳糖苷)形成蓝色化合物（5-溴-4-氯靛蓝）。这样由这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌（lac基因缺陷菌），涂布在补加有IPTG和X-gal的培养基平板上，会形成蓝色的噬斑，但若在lacZ区段上插入外源DNA片段，就会阻断β-半乳糖苷酶基因lacZ的编码序列，这种λ重组体感染的lac-指示菌由于不能合成β-半乳糖苷酶，只能形成无色的噬菌斑，相反未发生外源基因插入则出现蓝色噬菌斑，以利筛选。4.基因与载体的平末端连接方法有哪些？简要或图示说明均可。T4DNA连接酶法连接平末端DNA分子的方法有2种，一种是直接用T4连接酶连接，另一种是先用末端核苷酸转移酶给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接。T4DNA连接酶同一般的大肠杆菌DNA连接酶不同。T4DNA连接酶除了能够封闭具有3’-OH和5’-P末端的双链DNA的缺口之外,在存在ATP和加入高浓度酶的条件下,它还能够连接具有完全配对碱基的平末端DNA分子,但其连接效率比粘性端要低的多。（2）同聚物加尾法运用末端核苷酰转移酶，能够将核苷酸（通过脱氧核苷三磷酸前体）加到DNA分子单链延伸末端的3’-OH基因上,它并不需要模板链的存在,它一个一个加上核苷酸,构成由核苷酸组成的尾巴,长度可达100个核苷酸。5.如何从所克隆到基因重组体中鉴定目的基因的存在和正确性？根据插入基因的遗传性状进行筛选只有当已知需克隆基因所编码蛋白质的功能,且该蛋白质又为细菌的生命活动所必需时,即可用该方法筛选。如：已知蛋白质中的亮氨酸（Leu）为Leu营养缺陷菌所必需,当外源目的基因可表达亮氨酸,将该基因的重组子转入Leu缺陷菌中,在不含亮氨酸的基本培养基平板中,只有重组子表达的亮氨酸才能被Leu缺陷菌所利用而能生长繁殖,形成菌落。因而能生长的细菌集落，均为阳性的重组子克隆，而无该重组子的Leu缺陷菌在不含亮氨酸的平板上则不能生长，不能形成菌落。根据重组子的结构特征筛选(1).重组子大小鉴别筛选重组子中因装有一段较大分子量的外源基因DNA,因此其分子量明显比原载体大得多,因此可从平板上挑取菌落分别提取重组载体（如质粒重组子）和原载体（质粒），无需用限制性内切酶消化，直接进行凝胶电泳，携带外源性目的基因的重组子质粒因分子量大，电泳迁移率较小，其电泳条带在后，而原载体质粒因分子量较小，电泳迁移率较大，其电泳条带在前。通过比较可初步判断重组子中是否插入外源基因片段。本方法适用于插入片段较大的重组子的初步筛选。(2).酶切鉴定对于筛选出的具有重组子的菌株，应经小量培养后，再分别提取原载体或重组体载体（重组质粒或重组噬菌体DNA），根据已知重组时外源基因两端的酶切位点，分别用相应的两种内切酶进行酶解，经琼脂糖电泳后，原载体因无外源性目的基因，切开后变成线性，电泳呈一条带，若载体上有外源性目的基因插入，切开后电泳出现两条带：一条为载体质粒线性条带，一条为释放出的插入基因片断的小分子条带，这样就可以看出载体中是否有插入的目的基因片断，以及由DNAmarker条带对比分析可得知插入基因片段的大小(3).目的基因序列测定6.基因工程诞生的理论基础是什么？是现代分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明。理论上的三大发现：①证实了DNA是遗传物质②揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理③遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定技术上的三大发明：①限制核酸内切酶的发现与DNA切割②DNA连接酶的发现与DNA片段的连接③基因工程载体的研究与应用7.如何有效地提高外源基因的表达效率？⑴提高启动子强度⑵缩短启动子同克隆基因间距离⑶高效的翻译起始序列⑷高效的转录终止区⑸提高质粒拷贝数及稳定性⑹用以下方法提高翻译水平：①调整SD序列与AUG间的距离②用点突变的方法改变某些碱基③增加mRNA的稳定性的⑺减轻细胞的代谢负荷：①诱导表达②表达载体的诱导复制⑻提高表达蛋白的稳定性，防止其降解：①克隆一段原核序列，表达融合蛋白②采用某种突变菌株③表达分泌蛋白质8.大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么？优点：大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，基础生物学、分子遗传学等方面的背景知识清楚，对其基因表达调控的分子机理也比较了解，而且历经二十年的基因工程实践，大肠杆菌已发展成为一种安全的基因工程实验体系，有多种适用的寄主菌株和载体系列，大肠杆菌易于进行工业化批量生产。缺点：在通常情况下，细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；许多真核基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰，如正确的折叠和组装，而细菌中通常并没有这样的修饰机制，从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白；外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别，并被当做“异已分子”降解掉。9.什么是α-互补筛选？质粒载体具有β-半乳糖苷酶基因（lacZ），当外源DNA插入到它的lacZ，可造成表达后的β-半乳糖苷酶失活，利用这一点就可以通过大肠杆菌转化子菌落在添加有X-gal-IPTG培养基中的颜色变化鉴别出重组子和非重组子。有些大肠杆菌上带有lacZ基因的部分编码序列，质粒载体中含有别一部分编码序列，当质粒转入载体后，可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失了一部分编码序列的突变体与带有这一部分编码序列的突变体之间实现互补的现象叫α互补。10.真核细胞基因结构和原核细胞的有何相同点和不同点？1）相同点：都是由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成。2）不同点：原核细胞基因的编码区是连续的，真核细胞基因的编码区是间隔的，不连续的。11.基因克隆常用的载体必须具备的基本条件？⒈具有独立复制能力⒉具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点)⒊具有遗传表型或筛选标记⒋有足够的容量以容纳外源DNA片段⒌可导入受体细胞。复习题2

基因重组与基因工程一、A型题

1.实验室内常用的连接外源性DNA和载体DNA的酶是：（A）

A．DNA连接酶

B．DNA聚合酶Ⅰ

C．DNA聚合酶Ⅱ

D．DNA聚合酶Ⅲ

E．反转录酶

2.用来鉴定DNA的技术是：（B）

A．Northern印迹

B．Southern印迹

C．Western印迹

D．亲和层析

E．离子交换层析

3.下列那项不是重组DNA技术中常用的工具酶：（D）

A．限制性核酸内切酶

B．DNA连接酶

C．DNA聚合酶Ⅰ

D．RNA聚合酶

E．反转录酶

4.关于限制性核酸内切酶的叙述，下列哪项是错误的？

（E）

A．限制性核酸内切酶分为三类，用于基因工程的为Ⅱ酶

B．限制性核酸内切酶切割后可产生粘性末端或平端

C．识别的核苷酸序列个数可以是6个或8个D.识别的序列一般具有回文结构

E．识别的DNA为单链

5.关于基因工程的叙述，下列哪项是错误的？

（B）

A．基因工程也称基因克隆

B．只有质粒DNA可作为载体

C．重组体DNA转化或转染宿主细胞

D．需获得目的基因

E．需对重组DNA进行纯化、筛选

6.有关质粒的叙述，下列哪项是错误的？（E）

A．小型环状双链DNA分子

B．可小到2～3Kb大到数百个Kb

C．能在宿主细胞中独立自主地进行复制

D．常含有耐药基因

E．只有一种限制性核酸内切酶切口

7．下列哪项不是重组DNA的连接方式？（C）

A．粘性末端与粘性末端的连接

B．平端与平端的连接

C.粘性末端与平端的连接

D．人工接头连接

E．同聚物加尾连接

8．DNA克隆不包括下列哪项步骤？（E）

A．选择一个适合的载体

B．限制性核酸内切酶在特异位点裂解质粒和目的基因

C．用连接酶连接载体DNA和目的DNA，形成重组体

D．用载体的相应抗生素抗性筛选含重组体的细菌

E．重组体用融合法导入细胞

9．基因重组是指DNA分子的：（A）

A．共价连接

B．氢键连接

C．离子键连接

D．交换

E．退火

10．在分子生物学中，重组DNA又称为：（D）

A.酶工程

B.蛋白质工程

C.细胞工程

D.基因工程

E.DNA工程11．基因工程中，不常用到的酶是（E）

A．限制性核酸内切酶

B．DNA聚合酶

C．DNA连接酶

D．逆转录酶

E．DNA解酶

12．能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类酶称为：（B）A.DNA内切酶

B．限制性内切核酸酶

C．非限制性内切核酸酶

D．限制性外切核酸酶

E．非限制性外切核酸酶

13．cDNA是指：（A）A．在体外经反转录合成的与RNA互补的DNA

B．在体外经反转录合成的与DNA互补的DNA

C．在体外经反转录合成的与RNA互补的RNA

D．在体内经反转录合成的与RNA互补的RNA

E．在体内经反转录合成的与RNA互补的DNA

14．质粒的分子结构是：（A）

A．环状双链DNA

B．环状单链DNA

C．环状单链RNA

D．线状双链DNA

E．线状单链DNA

15．聚合酶链式反应常常缩写为：（E）

A．PRC

B．PER

C．PDR

D．BCR

E．PCR

16．用于PCR反应的酶是：（E）

A．DNA连接酶

B．碱性磷酸酶

C．逆转录酶

D．限制性内切核酸

E．TaqDNA聚合酶

17．基因工程中使目的基因与载体拼接的酶是：（C）

A．DNA聚合酶

B．RNA聚合酶

C．DNA连接酶

D．RNA连接酶

E．限制性核酸内切酶

18．α互补筛选属于：（C）

A．抗药性标志筛选

B．酶联免疫筛选

C．标志补救筛选

D．原位杂交筛选

E．免疫化学筛选

19．确切地讲，cDNA文库包含：（E）

A．一个物种的全部基因信息

B．一个物种的全部RNA信息

C．一个生物体组织或细胞的全部基因信息

D．一个生物体组织或细胞的全部RNA信息

E．一个生物体组织或细胞所表达mRNA信息

20．下烈描述最能确切表达质粒DNA作为克隆载体特性的是：

（D）

A．小型环状双链DNA分子

B．携带有某些耐药基因

C．在细胞分裂时恒定地传递给子代细胞

D．具有自我复制能力

E．获得目的基因

21.基因工程中常用限制性内切酶Ⅱ的识别序列，正确的说法是：（E）A.聚胞苷酸B.聚腺苷酸C.6或8个任意核苷酸D.4或6个任意核苷酸E具有回文结构22．基因工程的基本过程不包含：（E）A.DNA重组体的形成及转化B.限制酶的切割C.载体及目的基因的分离D.重组体的筛选与鉴定E.重组体的序列分析23.有关理想质粒载体的特征，正确的是：（B）A.其复制受宿主控制B.含有多种限制性内切酶的单一切点C．含有同一限制酶的多个切点D．为线性单链DNAE．不含耐药基因24.下列那个物质一般不用作基因工程的载体：（C）A．噬菌体B．质粒C．大肠杆菌基因组D．反转录病毒DNAE．人工酵母染色体25.基因工程的操作程序可简单的概括为：（E）A．将重组体导入宿主细胞并筛选B．限制酶的应用C．将载体和目的基因接合成重组体D．目的基因和载体的分离提纯与鉴定E．分、切、接、转、筛26.基因表达的多级调控不包括：（A）A．DNA复制B．转录起始C．转录后加工D.翻译起始E.翻译后加工27.下列基因工程中的目的基因的来源，最不常用的是：（C）A.人工合成DNAB．从mRNA合成cDNAC.从真核生物染色体DNA中直接分离D．从基因文库中获取E．从细菌基因组DNA中直接分离28.Ⅱ型限制性内切酶是：（B）A．有内切酶和甲基化酶活性B.仅有内切酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供C．有外切酶和甲基化酶活性D．限制性识别非甲基化的核苷酸序列E．仅有外切酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供29.基因工程操作应用的许多载体质粒都有抗生素的抗性基因，这是为了便于：（D）

A．外源基因插入质粒

B.宿主菌的生物繁殖

C．质粒的转化

D．带有目的基因的宿主菌的筛选

E．目的基因的表达30.有关目的基因与载体连接的叙述错误的是：（E）A.可以同一限制酶切割产生粘性末端连接B.平末端切口可采用“尾接法”C．平末端切口可直接连接D．均需DNA连接酶参与E．不同限制型内切酶切割不能连接1．基因工程的单元操作顺序是（

A

）Ａ．酶切，连接，转化，筛选，验证

Ｂ．酶切，转化，连接，筛选，验证Ｃ．连接，转化，筛选，验证，酶切

Ｄ．验证，酶切，连接，筛选，转化Ｅ．酶切，连接，筛选，转化，验证2．下列五个DNA片段中含有回文结构的是（

D、E

）

Ａ．GAAACTGCTTTGAC

Ｂ．GAAACTGGAAACTG

Ｃ．GAAACTGGTCAAAG

Ｄ．GAAACTGCAGTTTC

Ｅ．GAAACTGCAGAAAG3．T4-DNA连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段DNA片段连接在一起，其底物的关键基团是（

D

）

Ａ．2'-OH和5'-P

Ｂ．2'-OH和3'-P

Ｃ．3'-OH和2'-P

Ｄ．3'-OH和5'-P

Ｅ．5'-OH和3'-P4．噬菌体l-DNA体外包装的上下限是天然l-DNA长度的（D

）

Ａ．25-50%

Ｂ．50-100%

Ｃ．75-100%

Ｄ．75-105%

Ｅ．100-125%8．分子杂交的化学原理是形成（E

）

Ａ．共价键

Ｂ．离子键

Ｃ．疏水键

Ｄ．配位键

Ｅ．氢键9．促红细胞生长素（EPO）基因能在大肠杆菌中表达，但却不能用大肠杆菌的基因工程菌生产人的促红细胞生长素，这是因为（

E

）

Ａ．人的促红细胞生长素对大肠杆菌有毒性作用

Ｂ．人的促红细胞生长素基因在大肠杆菌中极不稳定

Ｃ．大肠杆菌内毒素与人的促红细胞生长素特异性结合并使其灭活

Ｄ．人的促红细胞生长素对大肠杆菌蛋白水解酶极为敏感

Ｅ．大肠杆菌不能使人的促红细胞生长素糖基化10．鸟枪法克隆目的基因的战略适用于（

A

）

Ａ．原核细菌

Ｂ．酵母菌

Ｃ．丝状真菌

Ｄ．植物

Ｅ．人类11．cDNA第一链合成所需的引物是（D）

Ａ．PolyA