几种布鲁菌抗原的免疫学特性研究

几种布鲁菌抗原的免疫学特性研究布鲁菌(Brucella)是布鲁菌病(Brucellosis)的病原体。现已发现布鲁菌有7个生物种:羊布鲁菌(B.melitensis)、牛布鲁菌(B.abortus)、猪布鲁菌(B.suis)、犬布鲁菌(B.canis)、绵羊布鲁菌(B.ovis)、鼠布鲁菌(B.neotomae)和海洋哺乳动物布鲁菌(B.maris)。各种间具有高度的同源性,但在毒力、生物学性状以及感染人类或畜类后的临床表现和流行特征等方面存在差异。其中既可以感染畜类也可以感染人类的生物种有羊、牛、猪和犬布鲁菌。在我国流行的主要有羊、牛和猪布鲁菌三种,且以羊布鲁菌最为常见,其致病力也最强。布鲁菌是一种细胞内寄生的革兰阴性菌,感染后可以诱导机体产生保护性体液免疫和细胞免疫反应。细胞免疫可清除细胞内布鲁菌,在抗布鲁菌感染免疫中占主要地位。现有的布鲁菌疫苗为灭活疫苗和减毒活疫苗,在一定程度上对于疫情的预防和控制起到积极作用,但是也存在一些问题:(1)灭活疫苗虽然可以起到一定的保护作用,但是免疫效果比较有限,不能引起足够的细胞免疫应答;(2)减毒活疫苗由于毒力恢复反弹而感染动物或人类,其应用受到限制;(3)在疫区筛查检测时,常用的血清学方法如试管凝集试验等无法区分传统疫苗免疫的动物和受到布鲁菌感染的动物,这对于隔离病畜,进而防治疫情扩散起到制约作用。因此,国内外均在进行布鲁菌新型疫苗包括DNA疫苗的研究。目前,已经发现了一些具有保护作用的布鲁菌抗原基因,如编码L7/L12、BCSP31和OMP31等抗原的基因。单独的保护抗原基因虽然可以诱导一定的免疫反应,起到一定的保护作用,但是存在保护效果较差,保护时间较短等缺陷。因此,研制联合多个保护性抗原基因的DNA疫苗是布鲁菌疫苗研究的热点之一。本课题在前期研究的基础上,对布鲁菌rp1L、omp31、bcsp31、omp22、omp2b等基因进行免疫学分析研究:制备了相应的单克隆抗体(monoclonalantibody,mAb);对多个抗原基因的各种组合进行了免疫学分析,以期筛选出最佳的组合方式。1、几种布鲁菌外膜蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备构建了几种布鲁菌外膜蛋白基因的原核表达载体,并将其分别命名为pGEX-4T-1-omp31、pGEX-4T-1-omp22、pGEX-4T-1-omp25d、pGEX-4T-1-omp2b。将这些质粒分别转化至大肠埃希菌并诱导表达,采用GST亲和层析纯化的方法,分别获得纯化的布鲁菌OMP31、OMP22、OMP25d和OMP2b蛋白。用纯化的蛋白检测布鲁菌全菌免疫的BALB/c小鼠血清,取高效价的小鼠脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞融合,ELISA间接法筛选阳性克隆,3次克隆化后建立杂交瘤细胞系。采用小鼠腹腔接种杂交瘤细胞制备腹水,正辛酸-硫酸铵法纯化mAb。采用Westernblot和ELISA等方法鉴定mAb特性。结果获得了2株抗布鲁菌OMP22蛋白的mAb,2株抗布鲁菌OMP25d蛋白的mAb,2株抗布鲁菌OMP31蛋白的mAb以及1株抗布鲁菌OMP2b蛋白的mAb。这7株单克隆抗体特异性强、敏感性较好,与大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、结核分枝杆菌和绿脓假单胞菌等无交叉反应。2、重组DNA的制备和动物免疫分别构建了pcDNA3.1-rp1L、pcDNA3.1-omp31、pcDNA3.1-bcsp31、pcDNA3.1-omp22和pcDNA3.1-omp2b真核表达载体。分别用这些质粒转染CHO细胞,其所表达的蛋白可被兔抗布鲁菌血清识别。再将上述质粒大量提取和纯化,并按照如下方式进行组合后分别免疫C57BL/6小鼠,并检测各项免疫学指标,以减毒活疫苗M5株和生理盐水为对照。(1)将pcDNA3.1-rp1L、pcDNA3.1-omp31和pcDNA3.1-bcsp31三组重组DNA等量混合免疫C57BL/6小鼠,并将这种组合命名为ROB。(2)将pcDNA3.1-omp22和pcDNA3.1-omp2b分别免疫C57BL/6小鼠。(3)将ROB和pcDNA3.1-omp22(命名为Ⅰ4);ROB和pcDNA3.1-omp2b(Ⅱ4);ROB和pcDNA3.1-omp22、pcDNA3.1-omp2b(Ⅲ5)三组分别免疫C57BL/6小鼠。3、重组DNA免疫效果的评价ROB组重组DNA免疫小鼠在末次免疫后4周的抗体水平最高,平均抗体滴度为1:1280(P<0.01);所产生的Th1型细胞因子如TNF-α和IFN-γ等均比M5株对照组高出2倍以上(P<0.05);所诱导的脾淋巴细胞增殖能力明显强于M5株对照组(P<0.05);并具有更强的细胞杀伤能力(P<0.05),提示获得的ROB重组DNA在细胞免疫水平方面要强于M5疫苗株。布鲁菌omp22组和omp2b组均刺激了较高的体液免疫水平(均大于1:1000,P<0.05);在检测IgG2a/IgG1比值方面,omp22组和omp2b组均优于M5组(P<0.05);omp2b组诱导的TNF-α和IFN-γ水平高于M5组(P<0.05);pcDNA3.1-omp2b免疫动物的脾细胞经特异性抗原刺激后,所产生的IFN-γ的细胞数目约是M5组的4倍(P<0.05);CTL杀伤实验表明,在效靶比为100时,omp2b组的杀伤能力明显强于M5组(P<0.05)。omp22组的各项指标也明显好于M5组,且具有统计学意义(P<0.05)。Ⅱ4组所诱导的特异性IgG为1:1280(P<0.05);IgG2a/IgG1比值是2.8(P<0.05)。在细胞免疫方面,Ⅱ4组诱导的TNF-α和IFN-γ高于M5组(P<0.05);Ⅱ4组免疫小鼠的脾细胞经特异性抗原刺激后能产生IFN-γ的细胞数目为64±3.4,高于M5组(P<0.05);CTL杀伤实验表明,在效靶比为100时,Ⅱ4组的杀伤效果优于M5组(P<0.0