实验3-微生物接种技术及实验4 血液凝固和影响血液凝固的因素

实验三微生物接种技术

一、实验目的1、掌握无菌操作在微生物接种过程中的重要性。2、掌握几种常用的微生物接种方法。3、掌握微生物微生物扩大繁殖的基本方法。4、认识微生物接种工具二、实验原理微生物接种技术是生物科学研究中最基本的操作技术。由于实验目的、培养基种类及容器等不同，所用接种方法不同，如斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种等，以获得生长良好的纯种微生物。为此，接种必须在一个无杂菌污染的环境中进行严格的无菌操作；同时，因接种方法的不同，常采用不同的接种工具，如接种针、接种环、移液管和玻璃刮铲等。三、实验器材主要仪器及设备无菌室、超净工作台、培养箱、振荡器、接种针、接种环、接种钩、接种铲，试管固体斜面培养基、培养基平板、三角瓶液体培养基，PDA平板及斜面，牛肉膏-蛋白胨-琼脂平板、斜面培养基、牛肉膏-蛋白胨液体培养基、试管半固体培养基。菌种大肠杆菌（Escherichiacoli)、青霉(Penicilliumsp．)、酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaeHansen)、细黄链霉菌(Streptomycesmicroflavus)放线菌等。四、操作步骤(一)斜面接种技术具体操作如下：1、贴标签接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口径2-3厘米的位置。2、点燃酒精灯。3、接种用接种环将菌种移接到贴好标签的试管斜面上。无菌操作程序简述如下：⑴手持试管将菌种和用于接种的斜面两支试管用大拇指和其他四指握在左手中、使中指位于两试管之间。斜面向上，并使它们位于水平位置(图a)。⑵旋松棉塞先用右手将棉塞旋松，以便接种时易于拔出。⑶取接种环右手拿接种环在火焰将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌。⑷拔棉塞用右手的无名指、小指和手掌边先后拔出试管的棉塞，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)，如图b、c所示。⑸环冷却将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。⑹取菌种待环冷却后轻轻沾取少量菌或孢子，然后将接种环移出接种管，如图d所示，注意不要使环的部分碰到管壁，取出后不可使环通过火焰。⑺接种在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的底部向上部作“之”字形来回划线，方向是从下部开始，一直划至上部，勿划破培养基(图e)。有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央划一条线作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。⑻塞棉塞取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上。塞棉塞时，不要用试管迎棉塞，以免试管在移动时带入不洁空气，如图f、g所示。⑼环灭菌将接种环烧红灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧，如图所示。斜面接种时的无菌操作斜面接种时的无菌操作（二）穿刺接种

（1）取两支新鲜半固体牛肉膏蛋白胨柱状培养基，做好标记（写上菌名）、接种日期，接种人等）。（2）接种的方法是，用接种针沾取少量待接菌种，然后从柱状培养基的中心穿入其底部（但不要穿透），然后沿原刺入路线抽出接种针，注意接种针不要移动。（3）接种后30℃恒温培养，24h后观察，比较两种菌的生长结果。

穿刺接种示意图

穿刺接种示意图

（三）液体接种1、用斜面菌种接种液体培养基，分为两种情况：（1）如接种量小，可用接种环（铲、针等）取不量菌体移入培养基容器中，将环在液体表面处的器壁上轻轻摩擦，使菌苔碾散；抽出接种环再摇动液体培养基使菌体均匀分布在液体中。（2）如接种量大，可先在斜面菌种管中倒入一定量的无菌水，用接种环将菌苔刮下，再将菌悬液倒入液体培养基中，倒前需将管口在火焰上灼烧灭菌。（四）平板接种以中指、无名指及小指托住培养皿下盖底部，用虎口及食指扶住上盖，再将斜面菌种管放于培养皿上之上，以拇指压住。然后以移菌环挑菌苔的菌体移入平板的中央，也可在平板上划线3-5条。五、接种后的培养将接种后的试管、平板放适宜的条件下培养，分别于48h、72h后进行观察。六、报告1、观察记述所有接种培养的微生物的形态特征、生长情况等，结果填入表内：观察项目菌名(细菌)菌名(放线菌)菌名(霉母)菌名(酵母菌)形状突起色素大小透明程度气味干湿度2、思考题：1）接种前后为什么要灼烧接种环？2）为什么要待接种环冷却后才能与菌种接触？是否可以将接种环放在台子上冷却？如何如何知道接种环是否已经冷却？3）微生物接种为什么要在无菌条件下进行？4）接种应注意哪些环节才能避免杂菌污染？实验4血液凝固和影响血液凝固的因素【摘要】目的研究影响血液凝固的内源性物质。通过测定某些条件下的血液凝固时间，加深理解影响血液凝固的因素。方法实验动物的血液采集，对照法。结果纤维蛋白，取出后血液不再凝固；少量生理盐水、肺组织浸液、少量棉花能促进凝血过程，减短凝血时间；肝素、草酸钾、液体石蜡涂壁、冰水能够减缓凝血过程，延长凝血时间。结论内源性影响血液凝固的因素—纤维蛋白，取出后血液不再凝固；外源性因素通过影响血液的酶促反应来影响凝血。关键词：凝血因子酶促反应组织因子内源性外源性目录【摘要】 1关键词 11. 实验材料和方法 21.1. 实验材料 21.2. 实验方法： 22. 实验结果： 33. 实验讨论（见附页） 34. 实验结论 35. 参考文献： 3附页 4实验材料和方法实验材料实验动物：兔子（浙江中医药大学动物实验中心）实验材料和器械：手术剪、手术镊、试管、动脉夹、动脉插管、恒温水浴、秒表。实验药品：石蜡油，冰块，草酸钾，肝素，氯化钙，氨基甲酸乙酯实验方法：用200g/L氨基甲酸乙酯（乌拉坦）按5ml/kg体重剂量给家兔耳缘静脉注射麻醉，将兔子仰卧固定在兔手术台上。切开颈部皮肤后（先去除颈部兔毛），分离颈外静脉，采血10ml，制备血浆和血清。分离一侧的经总动脉，头部用线结扎，向心端夹上动脉夹。用眼科剪在近结扎线处的血管壁剪一个“V”字的小口，向心方向插入动脉插管，用线结扎固定。以备取血之用。取8支试管，编号1-10。按照下图准备实验条件。组别实验试剂剂量1空白对照2棉花少许3石蜡油润滑整个表面4浸在盛碎冰块的烧杯中5氯化钠 1ml6肝素8单位（加血后摇匀）1ml7草酸钾（加血后摇匀）0.1ml8肺组织浸液0.1ml9放血10ml，用竹签不断搅动，2-10min后冲净竹签后观察。1-8号试管各加入血液2ml。9、10号小烧杯放血10ml，9号小烧杯放血时用竹签不断搅动。立即用秒表记时间，每隔15s将试管倾斜一次，观察血液是否凝固，至血液成为凝胶状记下时间。记录时间。取竹签一只，将烧杯内的血液不停搅拌，取出粘附在竹签上的纤维，观察其形态，再静置，并观察血液凝集的情况。实验结果：实验讨论（见附页）实验结论（1）内源性影响血液凝固的因素—纤维蛋白，取出后血液不再凝固，内源性因素指参与凝血的因子全部存在于血浆中