产黄曲霉毒素真菌PCR检测方法

产黄曲霉毒素真菌PCR检测方法本标准规定了食品、粮食和饲料中产黄曲霉毒素的黄曲霉和寄生曲霉的PCR检测方法。本标准适用于食品、粮食和饲料中产黄曲霉毒素的黄曲霉和寄生曲霉的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单》适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T4789.15食品卫生微生物学检验霉菌和酵母菌计数GB/T4789.16食品卫生微生物学检验常见产毒霉菌的鉴定GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1035出口食品中主要产毒真菌检验方法WS/T230临床诊断中聚合酶链式反应(PCR)技术的应用下列缩略语适用于本文件。aflRaflatoxinbiosynthesis产黄曲霉毒素调节基因。焦碳酸二乙酯。脱氧核苷酸三磷酸。ITSinternaltranscribedsp内部转录间隔区。omt-1sterigmatoeystino-methyltransfer柄曲霉素转甲氧基酶基因。PCRpolymerasechainre聚合酶链式反应。ver-1versicolorinAdehydr杂色曲霉素A脱氢酶基因。4生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。应按照GB19489的有关规定执行。5废弃物处理和防止污染的措施5.1检测过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30min后再弃置。5.2检测过程中防止交叉污染的措施见WS/T230中污染的预防和控制规定。目前已知产黄曲霉毒素真菌主要是黄曲霉和寄生曲霉。本方法选用黄曲霉毒素生化合成过程中的三个关键基因：调控基因aflR,柄曲霉素转甲氧基酶cmt-1和杂色曲霉素A脱氢酶ver1的有无来判断待检菌株是否能够产生黄曲霉毒素，按照黄曲霉毒素生化合成过程，只要缺少上述三个关键基因之一，均不能合成黄曲霉毒素。另外使用真菌共有的5.8SrDNA的ITS序列作为阳性参标可判断提取的DNA模板和PCR反应是否合适。7试剂和材料除特殊注明外，本法所用试剂均为分析纯或生化试剂，水为GB/T6682规定的一级水。7.1萨氏培养液；见附录A第A.1章。7.2DNA提取溶液：见附录A第A.2章。7.3引物：见表1。5*-TCCTCCGCTTATTGATAfIRF5*-CGAAAGCTCCGGGATAGCTGCGTCAGACAGOCACTGGACAOF*GTGGAGGACTAGTCOGACAT5'-GTCGGCCCCACGCACTGGGTTS'-GCCGCAGGCCGCGGAGAAAGGT5'CCGCAGTCAATGGCCATGC7.510×PCR缓冲液。7.7琼脂糖；电泳纯。7.8溴化乙锭。7.9分子量标记：100bpLadderDNAMarker。7.10电泳缓冲液；见附录A第A.3章。7.11加样缓冲液：见附录A第A.4章。7.1225mmol/L氯化镁。7.13酚-三氯甲烷-异戊醇混合液(体积比25:24:1)。7.14三氯甲烷-异戍醇混合液(体积比24:1)。7.15乙酸钠。7.16无水乙醇。7.19DEPC水：在1000ml.去离子水中加入100gl.DEPC,静置过夜后高压灭菌。7.20阳性质控菌株；用产黄曲霉毒素菌株(如：黄曲霉标准菌株Aspergillusflwcus3.4408,或者寄生曲霉Aspergillusparusiticus3.4407,或其他合格菌株)。阴性质控菌株；用不产黄曲霉毒素真菌(如；烟曲霉Aspergillusfumigatus3.0772,或其他合格菌林)。8主要仪器和设备8.2高速台式冷冻离心机；不小于10000g。8.3天平：感量0.1g。8.4冰箱：4℃~-20℃。8.5摇床；25℃±1℃,可调速。8.6均质器。8.7微量可调移液器和灭菌吸头：2.5μl,10pl20L100L,200pl,1mL。8.8灭菌PCR反应管12.0mL,0.2mL,8.9电泳仪。8.10紫外线观测仪或凝胶成像分析系统。8.11高压灭菌锅。8.12制冰机。9检测程序9.1样品制备参照GB/T4789.15进行。9.2产黄曲霉毒素真菌的培养与初步鉴定10×PCR缓冲液(不含氧化镌)氧化镁溶液(2,5mmal/L)dNTP溶液(各2.5mmol/L)TagDNA聚合酶(5U/μL)DNA模板(100ng/pL)59.3.5反应体系对照的设置9.3.5.1进行PCR检测时反应体系应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。9.3.5.2阳性对照；用黄曲霉标准菌株AS3.4408或者寄生曲霉AS3.4407或其他合格菌株提取的DNA作为模板。9.3.5.3刚性对照；用烟曲霉AS3.0772或其他合格菌株提取的DNA作为模板。9.3.5.4空白对照；用配置反应体系的实验室用水代替DNA模板。10结果分析与判定10.1结果判定10.1.1样品PCR扩增产物电泳后，出现600bp左右(ITS)基因片段，其他三个基因片段(nflR,omt-1和ver-1)只要有一个不出现；同时阳性对照扩增产物电泳后目的片段为979bp左右(aflR基因片段),600bp左右(ITS基因片段),797bp左右(omt-1基因片段)和452bp左右(ver-1基因片段)均出现；阴性对照只出现600bp左右(ITS基因片段)和空自对照扩增产物电泳后没有出现目的片段；判定结果为阴性。10.1.2样品的PCR扩增产物电泳后，979bp左右(aflR基因片段),600bp左右(ITS基因片段),797bp左右(omt-1基因片段)和452bp左右(ver-1基因片段)的扩增条带均出现，同时阳性对照扩增产物电泳后目的片段979bp左右(aflR基因片段),600bp左右(ITS基因片段),797bp左右(omt-1基因片段)和452bp左右(ver1基因片段)均出现，阴性对照只出现600bp左右(ITS基因片段)和空白对照扩增产物电泳后没有出现目的片段，判定结果为可疑阳性。10.1.3对于判定结果为可疑阳性样品，应进行产毒纯化培养后，按照SN/T1035和GB/T4789,16进行黄曲霉毒素测定，进行进一步确认，如确认结果为阳性，判定结果阳性；如确认结果为阴性，判定结果阴性。10.2结果表述如判定结果为阳性，则结果表述为“检出产黄曲需毒素的黄曲霉或寄生曲霉”;如判定结果为阴性，则结果表述为“未检出产黄曲霉毒素的黄曲毒和寄生曲毒”(规范性附录)培养基和试剂A.1萨氏培养液(SDB)胰酪蛋白胨(或胰蛋白胨)葡萄糖40.0g酵母粉10.0R蒸馏水1000ml.将上述各成分加热煮沸溶解，冷却后调pH至6.0±0.2,分装，121℃灭菌15min,备用。A.2DNA提取缓冲液0.2MTris-HCl(pH7.5),0.5mol/1.氯化钠，10mmol/LE