DB13-T1778-2013鱼类链球菌病诊断技术规范

ICS67.120.30B50

DB13河 北 省 地 方 标 准DB13/T1778—2013鱼类链球菌病诊断技术规范Thenormofdiagnosistechniquestreptococcicosisinfish20132013090520130930河北省质量技术监督局发布DB13/T1778—2013DB13/T1778—2013前 言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由河北省质量技术监督局提出。本标准起草单位：河北省水产养殖病害防治监测总站。薛政。IIDB13/T1778—2013DB13/T1778—2013DB13/T1778—20135培养基和试剂DB13/T1778—20135培养基和试剂鱼类链球菌病诊断技术规范范围本标准规定了鱼类链球菌病的诊断方法。本标准适用于鱼类链球菌病病原菌的鉴定及本病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。（）GB/T4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.13.1病原菌链球菌（Streptococcus）（Streptococcus（Streptococcusagalactiae）（Streptococcusmillieri）（Streptococcusparauberis）（Streptococcusdysgalactiae）乳链球菌是引起鱼类链球菌病的主要病原菌。4设备和材料a)b)显微镜：10×～100×。灭菌乳钵。0.1g。PCR电泳仪。1培养基和试剂包括：GB/T6682Todd-HewittTHB)。GB/T4789.2875％酒精。GB/T4789.283％H2O2（）。TaqDNAh)酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）。琼脂糖。溴化乙锭（EB）。dNTP：dATP、dCTP、dGTPdTTP10mmol/L。PCR639bp10μmol/LDNA（Marker）。DNA（Marker）。-20℃。6诊断步骤外部检查l解剖检查涂片检查用75%（GB/T4789.282脂平板。25g225mLTHB24±2h28℃24h2h，48hβ0.2μm～1.0μm按GB/T4789.28（见附录A.2）于10℃培养（PCR）本方法与6.4的方法可任选其一。取样1.0g5.0mLTEA.3DNA90μL1.5mL10μL(10mg/mL),37℃水浴1hK5μL(20mg/mL),371h，加入RNA10μL(10mg/mL),3730min,150μL25∶24∶1)312000r/minmin，100μLTEPCRDNA，4也可以使用能够达到同种效果的商业化细菌DNA提取试剂盒。PCRPCR50μL，10×PCRbuffer5μL，MgCl2（25mmol/L）4μL，dNTPs（μL，E1、E2（10μmol／L）1μL，TaqDNA（5Ｕ/μL）0.5μL，模板DNA2μL，35.5μL。PCR：945min；94℃1min，58℃退火45s，72℃1min，共35循环；72℃延伸10min，最后4℃保温。每次反应应设立阳性对照、阴性对照和空白对照。将海豚链球菌或无乳链球菌标准菌株分别接种于THB增菌液中，28℃培养18h～24h，摇匀后取1mL，用无菌生理盐水稀释至106～108CUF/mL（约麦氏比浊度0.4），按6.5.2的方法提取细菌DNA做为PCR反应的阳性模板。以DNA提取液代替阴性对照模板。以水替代空白对照模板。3DB13/T1778—2013DB13/T1778—2013DB13/T1778—2013DB13/T1778—2013PCR扩增反应试剂也可以使用能够达到同种效果的商业化PCR扩增试剂盒。（A.4）1.50.5μg/mLEB6μL2μL6）DNA（Marker）。5V/cm45min用紫外分析仪或紫外观察灯观察琼脂糖凝胶；Marker639bp639bp如在639bp位置无条带，或条带不在此位置，则判定为链球菌阴性。7综合判定具有6.1、6.2、6.3全部或部分症状，并且病原菌经6.4或6.5鉴定为链球菌，判定为鱼类链球菌病。44附录A（规范性附录）试剂配制标准中所用试剂，除特别注明外，均采用分析纯试剂。Todd-Hewitt肉汤（THB)牛肉膏5.0g胰蛋白胨20.0g葡葡糖2.0g碳酸钠2.5g氯化钠2.0g磷酸氢二钠(Na2HPO4)0.4g蒸馏水1000ml将以上各成份混合煮沸，完全溶化，冷却至室温后，调pH，于115℃灭菌10min，最终pH为7.8。营养肉汤蛋白陈蛋白陈10g3g5g1000mLH至7.4225，121℃高压灭菌15i。A.31×TE1MTris-HCl（PH=8.0）0.5MEDTA（PH=8.0）5ml1ml500l40L00l后，高温高压灭菌；室温保存。A.45×TBE电泳缓冲液Tris硼酸（HBO3EDTA水54g27.5g2.922g1000mL5mol/L（HCl）pH8.3，5EB(ethidiumbromide用水配制成10mg/mL的浓缩液，用时每10mL电泳液或琼脂糖中加1μL。上样缓冲液每100mL水溶液中含溴酚蓝0.25g，蔗糖40g。66附录B（资料性附录）链球菌（EF-Tu）tuf基因序列（EF-Tu）tuf1ggaccaatgccacaaactcgtgagcacatccttctttcacgtcaagttggtgttaaacac61cttatcgtattcatgaacaaagttgaccttgttgatgatgaagaattgcttgaattggtt121gaaatggaaattcgtgaccttctttcagaatacgacttcccaggtgatga181atccaaggttcagctcttaaagcacttgaaggcgacgaaaaatacgaaga241gaattgatgagcactgttgatgagtacattccagaaccagaacgtgatac301ttacttcttccagttgaagatgtattctcaatcactggacgtggtacagt361cgtatcgaccgtggtactgttcgtgtcaacgacgaagttgaaatcgttgg421gatatccaaaaagcagttgttactggtgttgaaatgttccgtaaacaact481cttgcaggggacaacgttggtgttcttcttcgtggtgttcaacgtgatga541ggtcaagttcttgctaaaccaggttcaatcaacccacacactaaatttaa601tacatcctttctaaagaagaaggtggacgtcatactccattcttcaacaactaccgtcca661caattctacttccgtacaactgacgtaacaggttcaatcgaacttccagcaggaacagaa721atggttatgcctggtgataacgttactatcgaagttgaatt//（EF-Tu）tuf1ggaccaatgccacaaactcgtgagcacatccttctttcacgtcaagttggtgttaaacac61cttatcgttttcatgaacaaaattgaccttgttgatgatgaagaattgcttgaattagtt121gaaatggaaatccgtgatcttctttcagaatacgatttcccaggtgatgaccttccagtt181atccaaggttcagctcttaaagctcttgaaggcgatgaaaaatacgaagacatcgttatg241gaattgatggctactgttgattcatacattccagaaccagaacgtgatactgacaaacca301ttgcttcttccagttgaggatgtattctcaatcactggacgtggtactgttgcttcagga361cgtatcgaccgtggtactgttcgtgtcaacgacgaaatcgaaatcgttggtattaaagaa7421gaaactcaaaaagctatcgttactggtgttgaaatgttccgtaaacaacttgacgaaggt481cttgcaggagacaacgtaggtatccttcttcgtggtgttcaacgtgacgaaatcgaacgt541ggacaagttattgctaaaccaggttcaatcaacccacatactaaatttaaagg