(3.2)-第2章 细胞生物学研究方法

第二章细胞生物学研究方法第一节、细胞形态结构的观察方法第二节、细胞组分的分析方法第三节、细胞培养与细胞工程第四节、细胞及生物大分子的动态变化第五节、模式生物与功能基因组的研究第一节细胞形态结构的观察方法

一、光学显微镜技术（lightmicroscopy）二、电子显微镜技术(Electromicroscopy)三、扫描遂道显微镜(scanningtunnelingmicroscope)一、光学显微镜技术（lightmicroscopy）1、普通复式光学显微镜技术2、相差显微镜和微分干涉显微镜3、荧光显微镜技术4、激光共焦扫描显微镜技术5、暗视野显微镜（一）普通复式光学显微镜技术

分辨率是指区分开两个质点间的最小距离最大分辨率：0.2µm光学显微镜可以直接用于观察单细胞生物或体外培养细胞苏木精：核酸伊红：细胞质苏丹：脂肪相差显微镜和微分干涉显微镜相差显微镜,将光程差或相位差转换成振幅差。用途：适用于观察活细胞和活组织，是体外细胞和组织培养不可或缺的工具。相差显微镜和微分干涉显微镜微分干涉显微镜:

以平面偏振光为光源。偏振光经合成后，使样品中厚度上的微小区别转化成明暗区别，增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器。利用不同的显微镜所观察到的神经细胞暗视野显微镜相差显微镜微分干涉显微镜荧光：细胞中的某些物质在紫外线照射下能够发出可见光，称为荧光。可分为自发荧光和诱发荧光。用途：在光镜水平上，对细胞内特异的蛋白质、核酸、糖类、脂质以及某些离子等组分进行定位研究的有力工具。有两个特殊的滤光片：激发滤光片、阻断滤光片。A.荧光显微镜的工作原理与光路示意图。B.不同荧光素所需激发光波长与所产生的荧光波长的比较。C.荧光显微镜显示出在有丝分裂中期细胞中，纺锤体微管（绿色）、中期染色体（蓝色）和原纤维状蛋白（红色）等结构成分荧光显微镜技术网络视频/video/BV1st4y1e72X?spm_id_from=333.337.search-card.all.click温馨提示：此视频框在点击“上传手机课件”时会进行转换，用手机进行观看时则会变为可点击的视频。此视频框可被拖动移位和修改大小GFP—绿色荧光蛋白激光共焦扫描显微镜技术用途：排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率，可重构样品的三维结构。可用于研究亚细胞结构与组分的定位及动态变化A.荧光显微镜。B.激光共焦扫描显微镜。图中显示小鼠肾小球的厚切片中，用不同的标记方法和不同的荧光染料，分别显示其凝集素（绿色）、微丝（红色）和细胞核（蓝色）的分布。Figure3-14.Comparisonofconventionalandconfocalfluorescencemicroscopy.Thesetwomicrographsareofthesameintactgastrula-stageDrosophilaembryothathasbeenstainedwithafluorescentprobeforactinfilaments.Theconventional,unprocessedimage(A)isblurredbythepresenceoffluorescentstructuresaboveandbelowtheplaneoffocus.Intheconfocalimage(B),thisout-of-focusinformationisremoved,whichresultsinacrispopticalsectionofthecellintheembryo.

光学显微镜最容易观察到的细胞器或细胞结构是()。[中科院2006年研]

线粒体内质网细胞核微管ABCD提交可为此题添加文本、图片、公式等解析，且需将内容全部放在本区域内。光学显微镜下只能看到较大的细胞结构，如细胞核、叶绿体等，线粒体需要染色后可观察到。内质网、微管等在电子显微镜下可观察到。答案解析单选题1分二、电子显微镜1932年，Ruska生产出第一台电子显微镜1935年，法国的卡诺尔提出扫描电镜的设计思想和工作原理1942年，剑桥大学的马伦首次制成世界上第一台扫描电镜主要电镜制样技术超薄切片技术

用于电镜观察的样本制备过程负染色技术（Negativestaining）冷冻蚀刻技术（Freezeetching）主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。石蜡切片:3-10um;超薄切片:40-50nm超微切片技术环氧树脂染色剂：醋酸铀，枸橼酸铅固定剂：锇酸，戊二醛骨骼肌细胞放大4500倍。左图切片厚度为1μm；右图切片厚度为0.025μm。重金属离子能在核蛋白体四周沉淀下来，形成一个黑暗的背景，在核蛋白体内部不能沉积而形成一个清晰的亮区，利用深色背景衬托出样品的精细结构，是观察病毒等颗粒性样品的常用技术。上图为烟草病毒的负染色下图为肌动蛋白纤维冷冻蚀刻技术冰冻断裂蚀刻复型Freeze-fractureelectronmicrographofthethylakoidmembranesfromthechloroplastofaplantcell.Thesemembranes,whichcarryoutphotosynthesis,arestackedupinmultiplelayers.ThelargestparticlesseeninthemembranearethecompletephotosystemII-acomplexofmultipleproteins.

Freeze-FractureandFreeze-EtchElectronMicroscopy

叶绿体的类囊体膜冷冻蚀刻技术主要用于()。[南开大学2011年研]

电子显微镜光学显微镜原子力显微镜激光共聚焦显微镜ABCD提交可为此题添加文本、图片、公式等解析，且需将内容全部放在本区域内。主要电镜制样技术包括：①超薄切片技术；②负染色技术；③冷冻蚀刻技术④电镜三维重构技术；⑤扫描电镜技术等。答案解析单选题1分电镜三维重构技术电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。

网络视频/video/av28730741/?p=2温馨提示：此视频框在点击“上传手机课件”时会进行转换，用手机进行观看时则会变为可点击的视频。此视频框可被拖动移位和修改大小电镜三维重构技术

扫描电镜的原理：电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。

CO2临界点干燥法，防止引起样品变形的表面张力问题扫描电子显微镜上皮细胞基底层微绒毛电子显微镜下的蚊子

鼠成纤维细胞第二节细胞及其组分的分析方法一、用超离心技术分离细胞组分二、细胞成分的细胞化学显示方法三、特异蛋白抗原的定位与定性四、细胞内特异核酸的定位与定性五、定量细胞化学分析与细胞分选技术一、用超离心技术分离细胞组分

用途：分离细胞器与生物大分子及其复合物

差速离心：分离密度不同的细胞组分

密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离均浆

1,000timesgravityfor10minutes

20,000timesgravityfor20minutes80,000timesgravityfor1hour

150,000timesgravityfor3hours

速率区带离心：是指当不同的颗粒间存在沉降速度差时，在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法。密度梯度离心：用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。二、特异蛋白抗原的定位与定性利用免疫学方法进行细胞内蛋白质定位的原理免疫荧光技术：快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。免疫电镜技术：应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等。细胞外蛋白质的分析蛋白电泳(SDS)

免疫印迹反应(Western-Blot)网络视频/video/BV12r4y1J7HP?spm_id_from=333.337.search-card.all.click温馨提示：此视频框在点击“上传手机课件”时会进行转换，用手机进行观看时则会变为可点击的视频。此视频框可被拖动移位和修改大小蛋白电泳网络视频/video/BV1s3411P72f?spm_id_from=333.337.search-card.all.click温馨提示：此视频框在点击“上传手机课件”时会进行转换，用手机进行观看时则会变为可点击的视频。此视频框可被拖动移位和修改大小免疫印迹反应

用核酸探针确立特殊核苷酸序列在染色体上或在特殊类型细胞中的位置的方法称为原位杂交技术(insituhybridization)。把凝胶电泳分离开的DNA片段，通过扩散或电泳转移到硝酸纤维素膜上，做成一个凝胶的复制品，这个过程叫做印迹。利用标记的DNA探针检测某一特定的DNA序列的方法称为Southernblot，检测特定RNA序列的方法称为Northernblot。

三、细胞内特异核酸的定位与定性人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片

利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。

四、细胞成分的分析与细胞分选技术DNA特异性的显示方法多糖的显示方法脂类物质的显示流式细胞术DNA特异性的显示方法Feulgen反应：

利用酸水解去除细胞中的RNA，仅保留DNA，并且除去DNA嘌呤脱氧核糖核酸的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露，所暴露出的自由醛基与希夫试剂中的无色品红反应呈紫红色。蚕豆根尖细胞Feulgen反应细胞核（紫红色）核仁（无色）多糖的显示方法PAS（过碘酸希夫氏）反应利用过碘酸的强氧化作用破坏糖分子的C—C键，使糖分子氧化产生双醛基，自由的醛基与希夫试剂作用形成紫红色产物。PAS反应淀粉颗粒脂类物质的显示方法对脂类物质的染色应用的是物理的扩散原理。苏丹类染料是脂溶性染剂，它溶于酒精但更易溶于脂肪，所以当含有脂肪的标本与苏丹染料接触时，它会脱离酒精而溶于脂类结构中从而深红色。 流式细胞仪（FlowCytometry）

主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体。网络视频/video/BV17P41157fD?spm_id_from=333.337.search-card.all.click温馨提示：此视频框在点击“上传手机课件”时会进行转换，用手机进行观看时则会变为可点击的视频。此视频框可被拖动移位和修改大小流式细胞仪(多选)以下哪些技术一般不用于分离活细胞？()[厦门大学2011年研]流式细胞术细胞电泳超速离心差速离心ABCD提交可为此题添加文本、图片、公式等解析，且需将内容全部放在本区域内。C项，超速离心机用于分离或分析鉴定病毒颗粒、细胞器或大分子生物样品等。D项，差速离心是利用不同的离心速率产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分离，适于分离沉降速率差别较大的亚显微结构颗粒。答案解析多选题1分第三节细胞培养与细胞工程一、细胞培养

二、细胞工程

一、细胞培养细胞培养的意义动物细胞培养

原代培养细胞（primaryculturecell）传代培养细胞（sub-culturecell）

细胞系（cellline）

细胞株（cellstrain）：有特殊遗传标记的细胞系植物细胞培养

类型：单倍体细胞培养（花药培养）

原生质体培养（体细胞培养）

细胞培养：将动、植物细胞或组织从机体内取出分散成单细胞悬液，给予必要的生长条件，让其在培养基上继续生长繁殖的过程。细胞培养的意义可以在离体条件下观察研究细胞生命活动的规律；观察细胞对于各种生物活性物质的反应；通过细胞培养可以获得大量性状相同的细胞，是一种良好的实验材料。动物细胞培养所需的一般条件：适宜的培养皿，小牛血清成分，37℃，PH等。动物细胞培养的基本过程：取材分离细胞选择相同类型的细胞贴壁培养传代动物细胞培养原代培养：从机体取出后立即进行的细胞培养。传代培养：原代培养的细胞在生长一定时间以后，就会由于营养成分的消耗、代谢产物的积累以及接触抑制等因素而停止生长，因此必需将细胞传到新的培养瓶中去使其继续生长。细胞系：原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞生长出现停滞，但有极少数细胞可能渡过危机而传下去，这些细胞一般又可顺利传代40-50代，并且保持染色体的二倍体数量及接触抑制的行为。这种传代细胞称为细胞系。永生细胞系（传代细胞系）：由细胞株传至50代后又出现危机不能再传下去，但是如果有部分细胞发生了遗传突变就有可能在体外培养的条件下无限制地传下去。这些细胞具有癌细胞的特点，这种传代细胞称为细胞系。细胞系的特点是染色体发生明显变化，失去接触抑制的特性。实验室中常用的细胞系虽然龟的最高寿命是175岁，而小鼠的寿命只有几年，但它们的细胞在体外培养时分裂的极限基本相同。()[浙江师范大学2010年研]

对错AB提交可为此题添加文本、图片、公式等解析，且需将内容全部放在本区域内。任何动物细胞的培养均需从原代细胞培养做起。原代培养的细胞一般传10代左右就不易传下去了，大部分细胞生长停滞、衰老死亡，有极少数细胞可存活，并能顺利地传40-50代次，仍保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制的行为，一般情况下，传至50代以后细胞就不能再传下去了。答案解析单选题1分名称类型来源3T3成纤维细胞小鼠Hela宫颈癌上皮细胞HenrittalLacksBHK21成纤维细胞叙利亚仓鼠PtK1上皮细胞袋鼠L6成肌细胞大鼠PCI2嗜铬细胞大鼠SP2浆细胞小鼠SP2/0骨髓瘤浆细胞小鼠CHO卵巢细胞中国仓鼠实验室中几种常用的细胞系

二、细胞工程

细胞工程是一种在细胞水平上运用细胞生物学和分子生物学的方法改变生物遗传性状的生物工程。细胞融合（cellfusion）技术单克隆抗体（monocloneantibody）技术显微操作技术质粒介导的转基因技术其它技术遗传分析（mutant,knockout,knockin）正向遗传学；反向遗传学显微操作仪转基因显微操作过程

第四节细胞及生物大分子的动态变化慕课视频片段视频名称：[2.4]细胞及生物大分子的动态变化.mp4温馨提示：此视频框在点击“上传手机课件”时会进行转换，用手机进行观看时则会变为可点击的视频。此视频框可被拖动移位和修改大小1）其生理特征能够代表生物界的某一大类群；4）容易进行实验操作，特别是遗传学分析。2）容易获得并易于在实验室内饲养、繁殖；3）世代短、子代多、遗传背景清楚；一种模式生物应具备的特点第五节模式生物与功能基因组的研究最常见的模式生物病毒(virus)大肠杆菌(Escherichiacoli)酵母(yeast)秀丽线虫(Caenorhabditiselegans)果蝇(Drosophilamelanogaster)斑马鱼(zebrafish)小鼠(mouse)拟南芥(Arabidopsis)水稻(Rice,OryzasativaL.)酵母的基因组于1996年测序完成，

其基因组含1.2×108个碱基对，约有6200个基因。

线虫的基因组于1998年测序完成，是人类得到的第一个动物物种的基因组，共有109个碱基对，约含18400个基因。果蝇的基因组于2000年测序完成，

共有1.2×105

kb碱基，约含13601个基因。

在20世纪生命科学发展的历史长河中，果蝇扮演了十分重要的角色，是十分活跃的模型生物。1摩尔根利用果蝇证实了孟德尔定律，而且发现了果蝇白眼突变的性连锁遗传，提出了基因在染色体上直线排列以及连锁交换定律1933年因此被授予诺贝尔奖。21946年，摩尔根的学生，被誉为“果蝇的突变大师”的米勒，证明Ｘ射线能使果蝇的突变率提高150倍，因而成为诺贝尔奖获得者。31995年，诺贝尔奖再次授予三位在果蝇研究中刘易斯、尼尔森沃哈德和维斯郝斯。果蝇为进一步阐明基因—神经（脑）—行为之间关系的研究提供了理想的动物模型斑马鱼透明斑马鱼荧光斑马鱼小鼠的基因组测序工作2002年完成，其基因组共有3.0×109个碱基对，约含30000个基因。

拟南芥的基因组于2000年测序完成，是人类搞清的第一个植物物种的基因组，共有1.25×109个碱基对，约有25000个基因。2002年12月宣布，利用克隆连克隆（逐步克隆）测定法，完成了水稻12条染色体的碱基测序工作。估计水稻基因组中