DB1509T 0008-2024马铃薯脱毒苗繁育技术规程

ICS65.020.20CCSB05DB1509Codeofpracticefortheproductionin-vitro乌兰察布市市场监督管理局发布I本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起本文件由乌兰察布市农牧局提出并归口。本文件起草单位：乌兰察布市种业工作站、内蒙古农业大学职业技术学院、乌兰察布市科学事业发展中心、乌兰察布市产品质量计量检验检测中心、乌兰察布市财政预算绩效评价中心、乌兰察布市科技创新中心、内蒙古自治区人工影响天气中心。本文件主要起草人：赵玉平、牛俊美、刘智慧、崔健、郝帅、戎素平、于国林、何瑞兵、辛悦、郭岩峰、董其冰、姚国宇、朵岚、黄修梅、王静、李海青、刘伟、武振亚、王碧春、彭淑渊、闫秀丽。1马铃薯脱毒苗繁育技术规程本文件规定了马铃薯茎尖脱毒与组织培养、脱毒苗繁育技术要求和操作规程。本文件适用于乌兰察布地区的马铃薯种薯茎尖脱毒和组培苗的生产。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T29375-2012马铃薯脱毒试管苗繁育技术规程GB/T29378马铃薯脱毒种薯生产技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1叶原基ieafprimordium在茎尖生长点的基部形成的突起。3.2茎尖stemtip茎顶端部分（0.1mm～0.3mm），其中包括分生组织及芽原基和正在发育的叶原基。3.3茎尖分生组织meristem茎部位具有持续或周期性分裂能力的细胞群。3.4组培苗plantlet马铃薯优良品种的块茎，利用茎尖脱毒技术、脱毒苗扩繁技术获得的，经质量检测后不带有马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒（PLRV）、马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯M病毒（PVM）和马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd），用于生产原原种的再生苗。4脱毒流程4.1培养基制备4.1.1培养基的配方2茎尖培养基配方符合GB/T29375-2012中附录B，MS培养基配方符合GB/T29375-2012中附录C。4.1.2培养基分装培养基分装于容器中，用封口膜封口。4.1.3灭菌将盛有培养基的容器置于高压灭菌锅121℃灭菌20min，冷却后在无菌贮存室放置3d～5d,无污染的培养基放到超净工作台备用。4.2材料的选择和处理4.2.1筛选无马铃薯纺锤块茎类病毒的材料。4.2.2在生长季节选择具有原品种典型特征的单株材料，收获并通过休眠后，将薯块在温室或培养箱内进行催芽处理。4.2.3对待脱毒材料进行高温钝化处理。温度37℃,处理时间15d。或者将剥离好的茎尖放入生长箱中培养，放入生长箱在25℃下处理20h～21h，之后在40℃下处理4h～5h，其间1500Lx～2000Lx光照12h，黑暗12h，钝化时间在4w～6w。4.3茎尖脱毒4.3.1茎尖消毒待芽萌发至2cm～3cm时，选取粗壮的芽，用解剖刀切下，芽段用无菌水冲洗30min，再用75%的酒精浸泡30s，放入无菌杯内用10%的次氯酸钠浸泡15min，用无菌水冲洗2～3次后放入灭菌后的超净工作台中。4.3.2茎尖剥离及接种将经消毒后的茎尖放在无菌滤纸上吸干水分，在40倍解剖镜下用灭菌的解剖刀、解剖针剥取带一个叶原基的茎尖（0.1mm～0.3mm），将生长点迅速接种于盛有茎尖培养基的容器中，进行离体培养。4.4茎尖组织培养4.4.1温度15℃~25℃,光照强度2000Lx～3000Lx，光照时间16h/d，培养120d～140d。4.4.2当看到明显生长的小茎，叶原基形成可见的小叶，转入无生长调节剂的培养基中。4.4.3小苗继续生长并形成根系并发育成3～4个叶片的试管苗。4.5病毒检测以单株为系进行扩繁，苗数达150～200株时，随机抽取3～4个样本，每个样本10～15株，进行病毒检测，采用酶联免疫吸附试验法检测确认不带有PVX、PVY、PVS、PLRV、PVA、PVM和往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测确认不带有马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）。4.6性状检验经检验不带病毒的组培苗进行扩繁试种观察。将每个组培苗取出一部分，将根部培养基清洗干净后移栽到防虫网棚，结出的小薯种植到田间试种观察，检验其是否发生变异，符合原品种特性的典型性状的脱毒苗即为核心苗。35基础苗培养器皿表面用75%的酒精擦试消毒，用镊子取出核心苗，按单茎切段，每个段至少带一片小叶，腋芽朝上插入MS培养基培养。温度15℃~25℃,相对湿度70%，光照强度2000Lx～3000Lx，光照时间16h/d。6组培苗的快速扩繁6.1扩繁前采用酶联免疫吸附试验法检测基础苗是否带病毒（PVX、PVY、PVS、PLRV、PVA、PVM），往复双向聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测基础苗是否带马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）。6.2检测合格的基础苗在超净工作台上切断扩繁。将培养容器置于超净工作台上，瓶口用75%乙醇擦拭消毒，用灭菌的长镊子取出基础苗，按单茎节切段，每个切段至少带一个叶片，腋芽朝上插入MS培养基，用酒精灯烘烤瓶口，用封口膜封好，注明编号、品种名称、接种时间。6.3培养条件为：白天23℃~25℃,夜间16℃~20℃,光照强度2000Lx～3000Lx，光照时间14h/d～16h/d，培