SN-T4155-2015化学品 用加标水或加标沉积物的沉积物-水摇蚊生命周期毒性试验

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准化学品用加标水或加标沉积物的沉积物-水摇蚊生命周期毒性试验usingspikedwaterorspikedsediment2015-02-09发布I本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准与联合国经济合作与发展组织(OECD)化学品测试方法No.233(2010)《沉积物-水摇蚊生命周期毒性试验-用加标水或加标沉积物》(英文版)有关技术内容一致。本标准做了下列结构和编辑性修改：——将简介改为引言；——将附录1改为术语和定义一章；——删除OECD的参考文献部分。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国宁波出入境检验检本标准是用来评估化学品对整个生命周期暴露的淡水双翅摇蚊属的影响，完全涵盖了第1代(P代)和第2代早期(F1代)。是现存的采用加标-水暴露或加标沉积物的OECD测试方法219或218的延伸。现有的Chironomusriparius和Chironomusdilutus(以前称为C.tentans)毒性测试方案在欧洲和北美发展迅速。还有其他有记载的摇蚊种类，如Chironomusyoshimatsui。C.riparius和C.yoshi-matsui完整的暴露周期是大约44天，C.dilutus是约100天。本标准给出了水和沉积物的暴露方案。合适的暴露方案取决于试验的预期应用。与水的接触情况下，水柱的加标，用于模拟杀虫剂喷雾和覆盖于地表水的初始峰浓度。加标水也用于其他类型的暴露(包括化学品溢出),但不能用于检测持续长于试验周期的沉积物中的蓄积过程。在这种情况下，当径流是农药进入水体的主要途径时，加标沉积物的设计可能是比较合适的。若对其他暴露方案感兴趣，试验设计是很容易调整的。例如，如果不考虑分布在水相和沉积物层之间的受试物，并且沉积物的吸收已经被最小化，那么可以考虑使用人工沉积物(例如石英砂)。试验所需的沉积物所在地的有机体物质可能在沉积物中存在很长时间。沉积物所在地有机体可能通过许多途径暴露。每个暴露途径和时间的相对重要性有助于整体毒性效应，这依赖于物质的物理-化学特性。对于强吸附剂或可与沉积物共价结合的物质来说，摄取被污染的食物也许是最主要的暴露途径。为了不低估高亲脂物质的毒性，可以考虑在给予受试物之前在沉积物中加入食物。所以，它可以包括所有的暴露途径和生命阶段。测试终点时羽化成虫的总数(包括第1代和第2代),发育速度(包括第1代和第2代),完全羽化并存活的成年个体的性别比率(包括第1代和第2代),每个雌性的卵串的数量(仅第1代)和卵串的生育力(仅第1代)。强烈建议配制沉积物。配制沉积物相与自然沉积物相比有很多优点：—减少试验差异性，因为它形成一个可重复的“标准化基质”,并且不需要寻找未被污染的清洁沉积物；——可以在任何时间开始试验，而且不会遇到季节性差异，并且不需要预处理沉积物；-比现场收集足够日常测试所需的数量降低了成本；-配制沉积物可以通过研究毒性数据，进行毒性分类。1化学品用加标水或加标沉积物的沉积物-水摇蚊生命周期毒性试验1范围本标准规定了化学品用加标水或加标沉积物的沉积物-水摇蚊生命周期毒性试验的术语和定义、试本标准适用于化学品检验用的沉积物-水摇蚊生命周期毒性试验。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T27858—2011化学品沉积物-水系统中摇蚊毒性试验加标于水法GB/T27859—2011化学品沉积物-水系统中摇蚊毒性试验加标于沉积物法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。配制沉积物formulatedsediment用来模拟天然沉积物物理组分的混合物，也可称作再生沉积物、人工沉积物或合成的沉积物。试验容器中处于于沉积物之上的水。沉积物和土壤颗粒间的水。加标水spikedwater已加入受试物的试验用水。4试验准则4.1试验原理4.1.1将一龄摇蚊幼虫放入沉积物-水系统中，暴露于一定的试验物质浓度范围内。4.1.2测试开始，通过将一龄幼虫(第一代)加入含有加标沉积物试验烧杯或在加入幼虫后交替将试验物质添加到水中。4.1.3摇蚊羽化，评估存活的摇蚊开始羽化的时间，全部羽化后的性别比例。24.1.4成虫转移到养殖网箱以方便分群、交配和产卵。评估产生的卵串的数量和它们的生育能力。从这些卵串获得一龄幼虫的第二代。将这些幼虫放入新鲜配制的测试烧杯(加标程序与第一代相同),通过评估第二代的羽化，羽化的时间和完全羽化后存活摇蚊性别比例(图A.4为生命周期试验的示意图)以确定第二代的生育能力。4.1.5对所有数据进行分析，通过回归模型评估导致X%减少的浓度的有关终点，或通过使用假设检验，以确定无可观察效应浓度(NOEC)。后者需要将处理组与对照组比较进行统计学检测。暴露于比一龄幼虫低的浓度水平。考虑到这个问题，每个生命阶段的暴露水平要相一致，以下是可能需要考虑的补充方法：——在两个测试阶段(第1和第2代).在测试系统内重复加标(或更新上覆水),加标(更新)间隔要根据受试物特性进行调节。这些方法仅适用于加标水，不适用于加标沉积物。受试物在水中的溶解度，其蒸汽压力和logK.测量或计算沉淀物的分配，和在水和沉积物中的稳定性。有效的受试物在上覆水、孔隙水和沉积物中定量的分析方法.且有已知和报告的准确度，以及检测限。有用的信息包括结构式和受试物的纯度：受试物的化学特性(例如分散、非生物和生物降解等)应周期性的检测对照物作为确保实验室检测敏感性没有变化的手段。可采用水蚤做48h急性检测。但是，只有得到有效的急性试验结果作为指导.才能考虑根据GB/T27858—2011进行慢性试验。4.4试验可靠性下列条件下试验是有效的：——暴露结束时，对照组两代羽化均值至少为70%;——对C.ripariusandC.voshimatsui来说.对照组一龄幼虫进入试验容器后12d～23d,两代应有85%的羽化成年摇蚊；C.dilutus为20d～65d:——完全对照组两代全羽化的性别比率和存活成虫(雌性或雄性)的均值应为至少0.4,不应超过0.6;——对照组每个配种笼的1代的卵串数量至少为每个加入配种笼雌性的0.6;——对照组每个配种笼1代的受精卵串分数至少为0.6;——两代暴露结束时，应检测每个容器的pH和溶解氧。氧浓度应为空气饱和值的至少60%,上覆水的pH值应为6～9;——水温变动不要超过±1.0℃。5试验方法5.1试验容器和饲养箱5.1.1幼虫暴露于600mL直径约8.5cm玻璃烧杯(参见附录A)。也可使用其他合适容器，但要有足够的深度容纳上覆水和沉积物。沉积物面积为每只幼虫2cm²~3cm²。沉积物层与上覆水深度比约3为1:4。5.1.2饲养箱(三维最小值为30cm),顶部和至少一侧有筛网(筛目为约1mm)。每个箱中放置一个2L的结晶皿，装有试验水和沉积物，用于产卵。结晶皿中重沉积物层与上覆水层的深度比为1:4。5.1.3收集卵串后放入12孔微孔板(一孔一串，含有至少从加标结晶皿中吸取的2.5mL水),然后盖上盖子以防蒸发。也可以用其他可以装卵串的适当容器。5.1.4除了微孔板，所有检测容器和其他接触检测系统的装置都要完全采用玻璃或其他化学惰性5.2种系选择优先采用Chironomusriparius。也可采用C.yoshimatsui:也可以使用C.dilutus,但操作比较困难，而且试验周期较长。C.ripariu的培养方法参见附录B。培养条件同样适合C.dilutus和C.yoshi-matsui。试验开始前需要鉴定种系，如来自于同一培养容器则不需要每次试验期都鉴定。为pH、有机碳含量，其他参数比如C/N比和粒度),且没有被污染、没有其他可能与摇蚊竞争或吃摇蚊的有机体。开始试验前，沉积物在试验条件下适应7天。推荐下列配制沉积物：b)20%(干重)高岭土(高岭石含量最好超过30%);的细砂应占至少50%);d)加入去离子水，最终混合物的水含量为30%～50%:e)加入化学纯碳酸钙(CaCO₃)调节pH值，沉积物最终混合物pH值为7.0+0.5;f)最终混合物有机碳含量为2%(±0,5%),通过泥炭和砂的含量来调节。泥炭、高岭土和砂的来源要清楚。要检查沉积物组分，不能被化学污染(例如重金属、有机氯化合物、有机磷酸酯化合物)。附录C为配制沉积物的例子，如果加入上覆水后，沉积物组分不会分离(例如泥炭颗粒漂浮),且泥炭和沉积物条件充分，可以将干的组分进行混合。附录C和附录D中列出了适合于做测试水的任何与稀释水的化学性质一致的水。如果摇蚊能在录D)或去除氯的自来水都可以作为培养基水和测试水。试验开始前，水的pH值应为6～9,总硬度以CaCO₃计不超过400mg/L。但是，如果硬度离子与受试物有可能相互作用，那么需要使用更低硬度的水(所以，Elendt培养基M4在这种情况下就不能使用)。整个试验过程中应使用同样的水。每年需至少2次，或怀疑这些特性明显改变时，检测附录C中列出的水质特性。测试浓度是以水柱浓度为基础计算的，例如沉积物上覆水。测试溶液一般是将储备液稀释制备的。储备液需事先将受试物溶于测试水中。有时会使用助溶剂或分散剂来活动合适浓度的储备液。例如丙基纤维素和HCO-40。最终测试溶液的助溶剂浓度应为最小值(例如≤0.1mL/L),且所有处理组相同。如使用助溶剂，应设立溶剂对照组，与阴性(水)对照组相比对存活率无显著影响。但是，应尽力避45.6储备液-加标沉积物通过将受试物溶液直接加入沉积物中制备加标沉积物。将溶于去离子水的受试物储备液与配置沉积物混合。如果不溶于水，可以将受试物尽可能小体积的溶于合适的有机溶剂(例如己烷、丙酮或氯仿)。然后每个容器加入10g石英砂混合。让溶剂蒸发，最终会从砂中全部去除；然后将砂与合适量的沉积物混合。只有易挥发的试剂才能用作助溶、分散或乳化受试物。在制备沉积物时要考虑受试物和砂的混合物中的砂量(例如制备沉积物时要少加入砂)。要确保加入沉积物的受试物充分且平均的分布效应浓度(ECx)和涵盖受试物效应的浓度范围十分重要，这样终点不会外推到生成数据的界限范围之外。应避免低于最低或高于最高浓度的外推。可以根据GB/T27859—2011或GB/T27858-2011进行浓度选择预实验。为达到EC,,至少应设5个浓度剂量，每个浓度应设8个平行样。每个浓度有两个配种笼(A和B),8个平行样分成两组，每组4个。但是，第2代也需要8个平行样，需从配种笼中的暴露种群中获得。浓度之间的因数不应大于2(当剂量反应曲线斜度很小的情况除外)。如果不同反应的试验浓度数量增加，每个处理组的平行样的数量可以减少到6个(每个配种笼3个)。增加平行样或减少试验浓度间隔会导致EC,的可信区间变窄。6.2NOEC评估的设计为得到NOEC,需设立5个浓度组，至少8个平行样(A和B配种笼各4个),浓度组之间的因数不应大于2。平行样的数量要确保足够的统计学意义来检测与对照相比20%的差异，即显著性为5%(α=0.05)。对于发育速度，可采用生殖力和生育力的变量分析(ANOVA),也可采用Dunnett's检验或Williams’检验。对于羽化率和性别比率，可采用Cochran-Armitage、Fisher's检验或Mantel-如预实验做到最大浓度仍没有观察到效应，可以做限度试验(1个试验浓度和对照)。限度试验的目的是证明大于限度浓度剂量可能有毒性反应。水为100mg/L,沉积物为1000mg/kg(干重)。一般每个处理组和对照设立至少8个平行样。要确保足够的统计学意义来检测与对照相比20%的差异，即显著性为5%(a=0.05)。可计量的反应(例如发育速度),如果能达到要求(正态性、齐性方差),可以采用t检验来进行统计学分析。如果不满足，可以采用方差不等t检验或非参数检验，例如Wilcoxon-Mann-Whitney检验。Fisher's检验可以用于羽化率分析。7试验步骤将配制沉积物(参见附录B)加入每个测试容器和结晶皿，形成至少1.5cm(因为结晶皿可能会稍微5低一点),最高3cm的沉积物层。加入水，沉积物层和水层的高度比不要超过1:4。准备好试验容器后，在加入第1代或第2代的1龄虫之前7天，将沉积物-水系统温和曝气(参见附录B)。结晶皿的沉积物-水系统不需要曝气，因为幼虫存活不需要(在孵化前已经收集了卵串)。为了避免在水柱中加水时沉积物组分的分离和再次悬浮，倒水之前可以在沉积物上盖上一个塑料平皿。然后立即移除平皿。也可以使用其他合适的器具。7.1.2水-沉积物系统制备(加标沉积物)将加标沉积物放入容器和结晶皿中，加入上覆水，沉积物-水体积比为1:4。沉积物层的高度在1.5～3cm之间(可能比结晶皿略微低)。为了避免在水柱中加水时沉积物组分的分离和再次悬浮，倒水之前可以在沉积物上盖上一个塑料平皿。然后立即移除平皿。也可以使用其他合适的器具。一旦带有上覆水的加标沉积物制备好，受试物应在沉积物层，与水相分隔。应在检测使用的温度和曝气条件下进行。合适的平衡时间应依据沉积物和化学品特性，可以是数小时到数天，很少能到5周。因为要给许多化学品留有降解时间，不需要等待平衡，但是一般推荐48h的平衡时间。但是，如果沉积物中混合物的降解半衰期较长，平衡时间可以延长。在延长的平衡时间结束时，要检测上覆水、孔隙水和沉积物中的受试物浓度，至少是最高和最低浓度。要盖上试验容器(例如玻璃板)。如有必要，试验期间要保持水的高度在最初的体积以补偿蒸发掉的水分。可用蒸馏水或去离子水来防止盐分蓄积。配种笼内的结晶皿不需要覆盖，不需要补偿水分流失，因为卵串仅与水接触大约1d,且试验中结晶皿使用时间很短。在一龄幼虫加入前4d～5d,从培养基中取出卵块，放入含有培养基的小容器中。可以使用从原种培养基中取出的或者新鲜配制的培养基。无论哪种情况，小量的饲料，例如从悬浮的鱼食过滤得到的几滴，加入培养基(参见附录D)。只能使用新鲜的卵块。一般幼虫在放置卵块后2d开始孵化(C.riparius在20℃时为2d～3d,C.dilutus在23℃时，C.yoshimatui在25℃时为1d～4d),幼虫在四龄时开始生长，持续4d～8d。幼虫的龄期阶段可以通过头壳宽度检测。加入一龄幼虫后24h,将受试物加入上覆水中，轻微曝气。用微量移液器在水面下加入小体积受试物储备液。小心混合上覆水，避免扰乱沉积物。加标水设计中，暴露开始于水加标(如加入幼虫1d后)。7.1.5.11代每天至少收集羽化成虫1次，最好是每天2次，用抽吸器、抽风机或类似装置(参见附录A)。特别小心不要伤害成虫。从一个处理组的4个容器中收集的成虫放入一个配种笼。羽化(雄性)第1天，将小体积的受试物储备液在水面下加入结晶皿(加标水设计)。小心混合上覆水，不要扰乱沉积物。结晶皿中的受试物浓度与处理组容器中相同。对于加标沉积物设计，在暴露后第11天准备结晶皿(如加入第1代幼虫),这样可以在第一次产卵前平衡48h。7.1.5.2用镊子或钝的吸管收集结晶皿中的卵串。将卵串放入含有从其收集的结晶皿中吸取培养基的容器，(例如12微孔板中的一孔，至少有2.5mL培养基)。将有卵串的容器用盖子盖住以防止蒸发。观察卵串至少6d,这样可以区分是否能够繁殖。7.1.5.3在第2代开始时，从每个配种笼中选择至少3个，最好是6个能够繁殖的卵串，加入饲料进行孵化。这些卵串应收集于产卵高峰期，即对照组开始试验大约第19天。理论上，所有处理组的第2代开始于同一天，但是由于受试物对幼虫发育的影响，这几乎不可能。所以，高浓度组可能开始的要晚于低浓度组和溶剂对照组。67.1.5.4在加标水设计中，第2代沉积物-水系统通过将受试物在加入一龄幼虫前1h加入上覆水中制7.1.5.5在加标沉积物设计中，制备第2代含有沉积物-水系统的暴露容器的方法与第1代相同。7.1.5.620只2代的一龄幼虫(孵化后最多48h)随机放入含有加标沉积物-水系统的检测容器。停止曝气并保持24h。根据试验设计，EC,需要每个浓度使用的幼虫数量最少为120只(每个浓度组6个平行样),NOEC为160只(每个浓度组8个平行样)。7.1.6.1最好每天或每周至少3次给幼虫喂料。发育的前10d,较小的幼虫应每天每只幼虫给予大幼虫给予稍多饲料：每只幼虫每天0.5mg～1.0mg。如观察到真菌生长或对照组发生死亡，减少所有处理组和对照组的饲料量。如不能阻止真菌生长，应重新做试验。物有这些特性，那么确保存活率和幼虫自然增长的饲料总量在稳定期前就要加入配制沉积物中。为防止水质变质，应采用植物代替鱼食，例如加入0.5%研磨细致的荨麻刺的叶子(Urticadioica)、桑葚(Morusalba),白色苜蓿(Trifoliumrepens),菠菜(Spinaciaoleracea)或其他植物(Cerophyl或a-cel-lulose)。在加标前加入完全有机食物来源对水质和生物性能的关联不小，也不是标准化的方法，但是最近有研究显示这种方法有效。配种笼中的成年摇蚊不需正规喂养，但是当放入浸满饱和蔗糖溶液的脱脂棉垫作为羽化成虫的食物来源时，生殖力和生育力都有所增加。加入一龄幼虫后，试验容器中上覆水温和曝气24h,并持续整个试验过程(注意溶解氧浓度不能低于60%ASV)。将玻璃巴斯德吸管的出口固定在沉积物层上方2cm～3cm处，给予一些气泡。如测试挥发性化学品，不要将沉积物-水系统曝气，要确保最低的60%ASV。采用C.riparius的检测，需恒温20℃(±2℃)。C.dilutus和C.yoshimatsui的推荐温度分别为23℃和25℃(±2℃)。16h光照周期，光照强度为500lx～1000lx。配种笼需额外的1h黎明和黄昏7.1.8.1加标水设计：1代的暴露阶段开始于上覆水加标(放人幼虫1天后)。2代幼虫从加入已加标的沉积物-水系统后立即开始。C.riparius和C.yoshimatsui1代最长暴露周期为27d,2代为28d(1代幼虫有1d无暴露)。考虑到时间重叠，完整的试验周期大约为44d。对于C.dilutus,1代和2代最长暴露周期分别为64d和65d。完整试验周期大约为100d。7.1.8.2加标沉积物设计：暴露从加入幼虫开始，C.riparius和C.yoshimatsui两代最长周期为28d,C.dilutus最长为65d。需观察两代的发育时间、完全羽化并存活的雄性和雌性成虫的总数。雄性可通过羽状触角和薄的身体姿态辨别。两代的试验容器要至少每周观察3次，与对照组相比肉眼鉴别幼虫行为异常(例如离开沉积物、不正常泳动)。在羽化期，C.riparius和C.yoshimatsui开始于放入幼虫后12d(C.dilutus为20d),每天7至少一次，最好是两次按性别计数(清晨和傍晚)。然后将1代成虫小心转移至配种笼。移出2代成虫在计数后处死。要各自收集1代的所有卵串并同时吸取至少2.5mL原容器中的水转移至12孔微孔板(或其他合适容器),盖盖防止蒸发。记录死亡幼虫和未能羽化的蛹的数量。配种笼、测试容器和抽风机的样例见附录A。8.2生殖生殖的影响通过1代成虫的卵串数量以及生育力评价。每天收集卵串并放入培育容器。收集卵串并同时吸取至少2.5mL原容器中的水转移至12孔微孔板(每个孔一个卵串)或其他合适容器，盖盖防(正常，螺旋形卵块香蕉状或异常，非螺旋形卵块)和生育力(能生育和不能生育)。产卵后通过6d的记录评价卵串的生育力。9分析方法9.1.1应至少分析最高和最低浓度组暴露开始(如是加标水，最好在使用后1小时)和试验结束时上覆水、孔隙水和沉积物的样本。两代的容器都是如此：交配笼的结晶皿仅需要分析上覆水，因为卵串与之接触(对于加标沉积物设计，要考虑沉积物浓度的分析确认),如认为有必要，需在试验过程中进一步检测沉积物、孔隙水和上覆水。这些受试物浓度的检测可以看出受试化学品在水-沉积物系统中的性能/分配。试验开始和过程中沉积物和孔隙水的取样需要额外的试验容器来进行分析测定。如受试物在水和沉积物中的分配能够确定(例如沉积物与水的比例、类型、沉积物有机碳含量)或上覆水浓度保持在初始浓度的80%到120%时，不需检测加标水设计中的沉积物。9.1.2当试验中(例如在第7天或第14天)检测以及分析需要大量样本时，无法在不扰乱试验系统的情况下采样，那么应在同样处理(包括试验动物的放置)的额外试验容器中采样，但不能用于生物学观察。9.1.3分离孔隙水，4℃,离心力1000g·离心30min:如果受试物不会吸附于滤网，也可以过滤。如果样本体积过小就无法分析孔隙水浓度。9.2理化参数试验水的pH值、溶解氧以及试验容器和结晶皿的水温应通过合适方式检测。试验开始和结束时检测对照组和最高剂量组的一个试验容器和结晶皿中的硬度和氨10数据和报告10.1结果处理本标准的目的是检测受试物对两代生殖力、发育速度和完全羽化的总数和存活的雌性和雄性成虫总数的影响。应集合雌性和雄性的羽化比例数据。如分性别的发育速度无统计学显著性差异，那么就集合雄性和雌性的结果进行统计学分析。浓度影响以上覆水(加标水)或沉积物(加标沉积物)浓度表达，以暴露开始时检测的浓度计算。所以，对于加标水，检测暴露开始时两代容器和结晶皿中上覆水的浓度，取每个处理组的平均值。对于加标沉积物，检测暴露开始时两代(任意结晶皿)容器中的浓度，取每个处理组的平均值。为了计算点估计值，例如EC,每个容器和每个交配笼的统计可以作为真实的平行样。在计算EC,8的可信区间时，要考虑容器之间的差异，或差异性很小可以忽略。如适合最小二乘法，应将每个容器的统计数字转化，以提高方差齐性。但是，ECx值应在转化为初始值后计算。如采用假设检验对NOEC进行统计学分析，要考虑容器间的差异性，可采用ANOVA法(例如Williams’和Dunnett's检验程序)。Williams'检验适合单调性假设不成立的情况。有更适合的检验适用于违背一般ANONA假设的情况。羽化率(ER)是量化的数据，如数据符合单调性剂量-反应，可以通过Cochran-Armitage检验。如果不符合，可采用Fisher's精确检验或Mantel-Haentzal检验，Bonferroni-Holm调整p值。如果同一浓度组的平行样与二项分布相比差异性较大(参考“额外二项式”变异),那应采用Cochran-Armitage检验或Fisher精确检验。羽化率(ER)按式(1)计算：每个容器中存活成虫(雄性加雌性),n。,除以幼虫数量，n:式中：ER-—羽化率；n。——每个容器中存活羽化成虫数量；n——每个容器中放入的幼虫数量(一般为20)。注：当n。大于n。(例如放入多余的幼虫),n。应与n。相等。对于大样本量，当存在额外二项式方差，将羽化率作为连续反应，采用与ER数据一致的程序。大样本量是指羽化数量，且每个平行样中未羽化数量超过5。值应首先经过反正弦平方根转化或Tukey-Freeman转化，得到正太分布和补齐方差。当使用频数时，可用Cochran-Armitage、Fisher'sexact(Bonferroni)或Mantel-Haentzal检验。反正弦平方根转化是求ER的平方根的反正弦(arcsin)。对于羽化率，EC,值的计算采用回归分析(例如概率、对数或Weibull模型)。如不能使用回归分析(例如当少于两个部分反应时),其他采用非参数方法例如移动平均数或简单插值。10.1.3发育速率平均发育时间代表放入幼虫(第0天)和成虫羽化之间(为计算真实发育时间，要考虑放入幼虫时的年龄)的平均时间。发育速度(单位：1/d)是发育时间的倒数，代表每天幼虫发育的比例。发育时间主要用于平均沉积物毒性研究，因为方差较小，且与发育时间相比更接近正态分布。因此，发育速度比发育时间更适用有效的参数检验。由于发育速度作为持续反应，EC,值可以通过回归分析评估。平均发育速度的NOEC可以通过ANOVA方法确定，例如Williams或Dunnett's检验。由于雄性羽化要早于雌性，发育速度较高，所以按性别计算发育速度较为合理。为进行统计学检验，假设在第x天观察到的成虫数量在第x天和第x-1(1=观察间隔长度，通常为1d)时间间隔的中间羽化。每个容器的发育速度均值(x)根据式(2)计算：x-—每个容器的发育速率均值；i——观察间隔指数；m——观察间隔最大值；9f;——观察间隔i羽化成虫的数量；n。——试验结束时羽化成虫总数(=2f;);x,——间隔i羽化成虫的发育速率。其中x;根据式(3)计算：d;——观察天数(从放入幼虫开始的天数);l;——观察间隔i的长度(天数，一般为1d)。10.1.4性别比例性别比例是量化数据，因此可以通过Fisher’s精确检验均值或其他合适方法进行评价。C.riparius自然界的性别比例为1,即雌性和雄性同样多。两代的性别比例数据应相同处理。因为每个容器成虫的最大数量对于有意义的统计学分析来说太低，所以将一个处理组所有容器的完全羽化的存活成虫分性别相加。这些未转化的数据与对照或相比通过2×2列联表进行比较。生殖，即产卵率，按每个雌性的卵串数量计算。一个交配笼里卵串总数除以加入笼中的存活雌性总数。生殖力的NOEC可以通过ANOVA方法确定，例如Williams或Dunnett's检验。卵串的生殖率通常按每个雌性的受精卵串数量进行量化表达。一个交配笼里的受精卵串总数除以加入笼中的存活雌性总数。生育率的NOEC可以通过ANOVA方法确定，例如Williams或Dunnett's检验。10.2试验报告a)物理结构和理化特性[水溶解度、蒸汽压、logK、土壤(或沉积物)中分配系数、水和沉积物中的稳定性等];b)化学品鉴别数据(通用名、化学名称、结构式、CAS号等)包括受试物的纯度和定量分析方法。10.2.2试验品系a)采用的试验生物：品系、学名。来源和饲养条件；b)卵块和幼虫如何处理的信息；c)用抽风机等处理1代的羽化成虫的信息；d)放入1代和2代时的生物年龄。10.2.3试验条件a)使用的沉积物，天然或配制(人工)沉积物；b)天然沉积物：沉积物取样地点的位置的描述，如可能，污染史，沉积物特性：pH、有机碳含量、C/N比和粒度测量；c)配制沉积物：制备、成分和特性(有机碳含量、pH、含水量等，应在试验开始时检测);d)试验容器和结晶皿中沉积物和上覆水的高度；e)上覆水和孔隙水的体积，试验容器和结晶皿中沉积物不含孔隙水的湿重；f)试验容器(材料和规格):g)结晶皿(材料和规格);h)交配笼(材料和规格);i)受试物储备液的制备方法；j)试验容器和结晶皿中检测项目：试验浓度、平行样和溶剂的数量；结果应包括以下信息：a)额定试验浓度、检测试验浓度和确定受试物浓度的所有分析结果；d)1代和2代每天每个容器中羽化的雌性和雄性数量；e)1代和2代每个处理组完全羽化且存活的成虫性别比例；f)1代和2代每个容器中未能羽化为成虫的幼虫数量；g)1代和2代检测浓度(雌性和雄性成虫合计)每个平行样羽化百分率/分数；h)1代和2代处理组(雄性和雌性成虫分别和合计)每个平行样完全羽化和存活成虫的发育速度i)放入结晶皿中的卵串数量和日期；j)每个卵串的特性(大小、行政和生育力);k)产卵率-卵串总数除以加人交配笼的所有雌性总数；1)生育率-受精卵串总数除以加入配种笼中的雌性总数；n)结果讨论，包括任何偏差得出到试验结果的影响。(资料性附录)试验操作指导试验操作装置及过程见图A.1～图A.4。说明：A——笼具顶部和至少一面为筛网(筛孔尺寸约为1mm);B——将羽化成虫放入和移出卵串的孔；A——为上覆水提供空气的巴斯德吸管；B--放置羽化成虫飞走的玻璃盖；C——水层表面；D——试验容器(最小600mL的玻璃烧杯);E------沉积物层。说明：A——连接自动启动泵的玻璃试管(内径大约5mm); A B D EB——带玻璃试管(A)的穿孔硬化橡胶塞，位于内部的开口玻璃吸管(A)上盖着棉花和筛网(筛网大小约1mm²)防止抽吸时损伤成虫；C—-获取成虫的转移容器(塑料或玻璃，长度约为15cm);D——带试管(E)的穿孔硬化橡胶塞。可释放成虫到配种笼，塞子D可以从容器C中取出；E——从容器中收集成虫的试管(塑料或玻璃，内径约8mm)。图A.3获取成虫的抽吸器样例(箭头指示空气流动方法)BCDFOA——1代-试验容器中装有沉积物-水系统，8个平行样，每个容器20只一龄幼虫；B——每个配种笼4个试验容器，A和B;C——配种笼(A和B),用于容纳、交配和产卵；F——2代-含有沉积物-水系统的试验容器，8个平行样，每个容器20只一龄幼虫。(资料性附录)配制沉积物B.1沉积物组分(见表B.1)占沉积物干重的百分比/%泥炭水藓泥炭，pH值尽可能接近5.5～6.0,无可见植物残余，研磨细致(粒径≤1mm),风干4～5石英砂高岭土高岭土含量≥30%有机碳通过加入泥炭和砂调节2(±0.5)碳酸钙CaCO₃,粉末，化学纯0.05～0.1水电导率≤10MS/cm将泥炭风干并细致研磨成粉末，放人去离子水中采用高性能混匀设备制成混悬液。用CaCO₃调pH值为5.5±0.5。将混悬液放置在20℃±2℃,温柔搅拌至少2d.以稳定pH值和建立稳定的微生物成分。然后再次测量pH值，应在6.5±0.5。然后将泥炭混悬液与其他组分(砂和高岭土)和水混合，形成均质沉积物，含水量为沉积物干重的30%～50%。检测最终混合物的pH值，用CaCO₃调节至6.5～7.5。将沉积物取样检测干重和有机碳含量。在用于摇蚊毒性试验前，将配制沉积物放置在与试验条件相同处7d。B.3储存人工沉积物的干组分可以储存在干燥和阴凉的室温下。配制(湿的)沉积物在使用前不能储存。需在7d的适应条件周期结束后立即使用。(资料性附录)可使用的稀释水的化学特性可使用的稀释水化学特性见表C.1。颗粒物有机碳总量未离子化氨以CaCO₃计硬度氯残留有机磷杀虫剂总量有机氯杀虫剂和聚氯联苯总量有机氯总量注：如有硬度离子与受试物可能反应，应采用较低硬度的水(这种情况下Elendt培养基M4就不能使用)。(资料性附录)Chironomusriparius培养推荐方法D.1饲养条件摇蚊属幼虫可以饲养结晶盘或更大的容器里。在容器底部铺约5cm～10cm的一层薄薄的细石英砂。也可用硅藻土是一个合适的衬底(铺很薄的一层就足够了)。然后，添加合适的水到几厘米深度。水位应加满来补偿蒸发损失防止干燥。如必要更换水。提供温和的通风，幼虫饲养容器应放在一个合适的笼子以防止羽化成虫飞走。笼子里应该足够大，允许蜂拥出现的成虫，否则可能不会交配(最小值为约为30cm×30cm×30cm)。饲养容器应