六章真核生物遗传分析

第六章真核生物的遗传分析第一节真核生物基因组一、C值悖理（Cvalueparadox）基因组与C值基因组：一个物种单倍体的染色体的数目及其所携带的全部基因称为该物种的基因组（genome）DNA。C值：一个物种单倍体基因组的DNA含量是相对恒定的，它通常称为该物种DNA的C值。

最小的C值:支原体(106bp),

最大的C值:某些显花植物和两栖动物(1011bp)

从原核生物到真核生物，基因组大小和DNA含量（C值）随生物进化复杂程度的增加而稳步上升。

结构与功能相似的同一类生物中,以至亲缘关系很近的物种之间,C值差异可达10倍乃至上百倍.

如：豌豆、蚕豆，均为12条染色体，而C值相差7倍。人类的C值为109bp，而肺鱼的C值为1011bp。C值悖理（Cvalueparadox）:C值的大小并不能完全说明生物进化的程度和遗传复杂性的高低，也就是说，物种的C值和它进化复杂性之间没有严格的对应关系。二、N值悖理人类基因组：含有25000个基因；线虫基因组：有近20000个基因；果蝇基因组：有14000个基因。在进化关系上，线虫最低等，而其遗传信息比高等的果蝇还多。生物的基因数目与生物在进化树上的位置不存在正相关的事实称为N值悖理（Nvalueparadox）或N值佯谬。

N值悖理说明，生物体的复杂性不仅仅是基因数目的函数，随生物体复杂性的增加，基因的大小和基因结构的复杂性也增加.

这些复杂性体现在：基因转录的可变剪接；基因的重复程度；蛋白质功能域的数目；内含子的数目；基因家族等等。三

真核生物基因组DNA序列的复杂度1重复序列的检测真核生物C值的巨大差异

---是否C值愈大的物种含有更多的基因？

---还是基因数目没有增加而含有大量非编码的重复序列？如果是前者，随C值增加基因数目增加，编码单一DNA序列的数量也增加：相反，基因组DNA中含大量不编码的重复序列。通过复性动力学来检测基因组DNA的复杂性。即通过DNA的变性和复性反应的动力学过程分析DNA序列的性质。C为单链DNA的浓度（单位是每升的核苷酸摩尔数）；C0为单链DNA

起始浓度；t为时间（单位为s）；k为重组速率常数（单位是L／mol·s），k取决于阳离子浓度、温度、片段大小和DNA序列的复杂性。

复性的分数C／C0是起始浓度和经过时间的乘积C0t的函数，这样的函数绘成图称为C0t曲线（图6-3）。当t=0时，C＝C0，表明所有DNA都是单链；当t=t1/2时，C＝1/2C0，C0t1/2=1/k

如果基因组中每一种基因只有一个，即都是单拷贝序列，那么基因组愈大则基因组的复杂性愈大，复性速率愈小，k也愈小，所以C0t1/2与非重复序列的基因组大小呈正比。

不同生物基因组的C0t1/2是不相同的，C0t1/2的位置除了决定于基因组的大小以外，还取决于每个基因的核苷酸序列的重复次数，重复次数愈少则复性愈慢，C0t1/2的位置愈后，重复次数愈多，C0t1/2位置愈前。真核生物的基因组比较庞大人：单倍体基因组3.16×109bp

按1000个碱基编码一种蛋白质计：理论上，有300万个基因，实际大概25000个基因

说明：有许多DNA序列并不转录成mRNA指导合成蛋白质。

真核生物基因组的结构特点真核生物基因组大部分位于细胞核中，一般由多条染色体组成，每条染色体又是由DNA分子与蛋白质稳定地结合成染色质的多级结构。每条染色体的DNA分子具有多个复制起点，基因内存在着不表达的插入序列，即内含子。功能上密切相关的基因集中程度不如原核生物，在真核生物中尚未见到有关操纵子的报道。存在大量不编码蛋白质的DNA序列，果蝇的基因数约为14000个，占基因组DNA序列的10％左右，人的基因数推测为25000个，约占基因组DNA序列的1％。D.真核生物的蛋白质编码基因往往位于基因组DNA单拷贝序列中，除单拷贝序列外还存在大量重复序列（repeatsequence），重复序列的拷贝数可高达百万份以上，在人的基因组中，至少具有20份拷贝的DNA，占总DNA的30％左右。E.真核生物基因组中，有许多结构相似、功能相关的基因组成所谓的基因家族（genefamilies）。F.真核生物除了主要的核基因组外，还有细胞器基因组，而且细胞器基因组对生命是必须的，不像原核生物质粒DNA基因对细菌生存不是必须的。

真核生物基因组复性曲线往往出现两个或3个明显不同的C0t1/2位置，说明这类基因组中包含着重复次数显然不同的几个成分。真核生物基因组序列分类

(p115)（一）单拷贝序列（uniquesequence）亦称非重复序列（nonrepetitivesequence）

在一个基因组中只有一个拷贝或2-3个拷贝（二）中度重复序列（moderatelyrepetitivesequence）重复单位平均长度约300bp，重复次数10-102（三）高度重复序列（highlyrepetitivesequence）

重复次数在106以上卫星DNA（satelliteDNA）重复顺序：由2-10bp组成重复单位，重复单位成串排列而成由于这类序列的碱基组成不同于其他部份，可用等密度梯度离心法将其与主体DNA分开，因而称为卫星DNA（或随体DNA）在人细胞组中，卫星DNA约占5-6％，按其浮力密度不同，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四种；果蝇的卫星DNA顺序已经清楚，可分为三类，都是由7bp组成的高度重复顺序：

卫星Ⅰ为：5’ACAACTT3’

卫星Ⅱ为：5’ACAAATT3’蟹的卫星DNA为只有AT两个碱基的重复顺序组成。真核生物基因结构示意图第二节真菌类的四分子分析与作图粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)也叫红色面包霉,是一种丝状真菌，是一种低等真核生物.两种繁殖方式:1.无性繁殖.

当其孢子（N）或菌丝落在营养物上，孢子萌发，菌丝生长形成菌丝体（N）。2.有性繁殖.

两个亲本必须是不同的交配型（matingtype）A和a.当不同交配型的分生孢子散落在子实体的受精丝上时，就进入子实体，进行核融合，形成二倍体(Aa)。二倍体进行一次减数分裂和有丝分裂，在子囊中产生8个单倍体的子囊孢子.一、顺序四分子及其遗传分析粗糙链孢霉的生活史第2次分裂第1次分裂2N核减数分裂有丝分裂单倍体子囊孢子单倍体子囊孢子子囊孢子(4A:4a)

萌发

萌发子囊开始形成核融合核融合营养菌丝体营养菌丝体分生孢子分生孢子Aa粗糙链孢霉减数分裂的特点：每次减数分裂结果(四个分生孢子，或其有丝分裂产生的八个子囊孢子)都保存在一个子囊中；四分子或八分子在子囊中呈直线排列——直列四分子，直列八分子，具有严格的顺序。粗糙链孢霉作为遗传学材料的优点:体积小,易于繁殖、培养和管理;一次杂交可产生大量后代,易于统计；子囊孢子是单倍体,可直接观察基因表现，无需测交；可获得、分析单次减数分裂的结果.四分子分析(tetradanalysis)：粗糙链孢霉减数分裂的4个产物保留在一起，称四分子，对四分子表现进行的遗传分析，称为四分子分析。顺序四分子

由于子囊外形狭窄,分裂的纺锤体不能重叠,只能纵列于它的长轴中,这样形成的子囊孢子从上到下按顺序排列成行,因此,粗糙链孢霉减数分裂形成的四分子属于顺序四分子.四分子分析的优越性：1、可把着丝粒看作一个座位,计算某一基因与着丝粒的重组率;2、子囊孢子的对称性，证明减数分裂是一个交互过程。3、可以检验染色单体的交换是否有干涉，还可用于基因转变的研究。4、证明双交换不仅可以包括4线中的两线而且可以包括

3线或4线。（1）着丝粒作图（centromeremapping)定义:

利用四分子分析法，测定基因与着丝粒间的距离，称为着丝粒作图。依据：在一对非姐妹染色单体间没有发生着丝粒和基因间交换的减数分裂和发生了交换的减数分裂,其产物在排列方式上是不同的.在非姐妹染色单体间没有发生着丝粒和基因间交换的减数分裂，等位基因(A,a)在第一次减数分裂时分离,称第一次分裂分离或叫M1模式分离.

未发生交换--第一次分裂分离若发生了交换，等位基因(A,a)在第二次减数分裂时分离,称第二次分裂分离或称M2模式分离.发生交换--第二次分裂分离第一次减数分裂第二次减数分裂有丝分裂等位基因的排列模式:AAAAaaaa(或aaaaAAAA)

等位基因的排列模式:AAaaAAaa(或aaAAaaAA)AAaaaaAA或aaAAAAaa

有一半的四分子产物中发生了重组。粗糙链孢霉生物性状:赖氨酸合成(lys)：野生型——能够合成赖氨酸，记为lys+，能在基本培养基(不含赖氨酸)上正常生长，成熟子囊孢子呈黑色；突变型——不能合成赖氨酸，称为赖氨酸缺陷型，记为lys-，在基本培养基上生长缓慢，子囊孢子成熟较迟，呈灰色。着丝粒作图的例子两种菌株杂交：lys+X

lys-

六种子囊孢子排列方式非交换型子囊交换型子囊lys+

lys-(1)(2)(3)(4)(5)(6)子囊类型++----+++-+--+-++--+-++-子囊型105129951016分裂类型M1M1M2M2M2M2未交换型交换型着丝粒距离与着丝粒作图将着丝点当作一个基因位点看待，计算基因位点与着丝点间的交换值，估计基因与着丝点间的遗传距离，称为着丝点距离。着丝点距离着丝点作图每个交换型子囊中，基因位点与着丝粒间发生一次交换，其中半数孢子是重组型(重组型配子)。因此，交换值（重组率RF）的计算公式为：子囊总数交换型子囊数×1/2RF=×100%RF0-lys=(9+5+10+16)×1/2(105+129+9+5+10+16)×100%=7.3%即着丝粒与lys间的距离为7.3cM。（2）两个连锁基因的作图利用顺序四分子分析也可以对两个基因进行连锁分析和作图。粗糙链孢酶有两个突变型：烟酸依赖型(nic，n)----需在培养基中添加烟酸才能生长腺嘌呤依赖型(ade，a)---需在培养基中添加腺嘌呤才能生长将两个菌株杂交：

n+×+a

一对等位基因杂交有6中子囊型，两对基因杂交有6×6=36种子囊型。但若把着丝粒在减数分裂中的随机趋向造成的不同归为一类，可归纳为7种基本子囊型

子囊型①②③④⑤⑥⑦四分子基因型次序+a+an+n+++++nana+++an+na+ana++n++an++an+++na++na++na+an+分离发生的时期MⅠMⅠMⅠMⅠMⅠMⅡMⅡMⅠMⅡMⅡMⅡMⅡMⅡMⅡ

四分子类别PDNPDTTPDNPDT实得子囊数808190590151、亲二型（PD)，2种基因型，都为亲型，包括①和⑤2、非亲二型（NPD)：2种基因型，都为重组型，包括②和⑥。3、四型（T)：4种基因型，2亲本2重组，包括③、④和⑦如只考虑性状组合，不考虑孢子排列顺序，还可把子囊分为3种类型：亲二型（PD),非亲二型（NPD),四型（T).判断n、a基因是独立分配还是连锁如果两个基因是自由组合的话，则PD︰NPD=1︰1而实验结果PD=808+90=898，NPD=1+1=2，PD远远大于NPD。说明这两个基因是相互连锁的。计算n与着丝粒之间的重组率：计算a与着丝粒之间的重组率：5.059.30nicadenicade5.059.30哪一种排列正确呢？判断它们处在同臂还是异臂上的方法:1.利用两连锁都处在MⅡ时的PD和NPD四分子类型出现的频率来判断.2.通过在n和a分别为MI

和MⅡ的情况下,对子囊数与

RF(·－n),RF(·－a)进行比较分析来判断.1.两连锁都处在MⅡ时,PD和NPD四分子类型出现的频率

类型交换产物同一染色体上标记基因在异臂上在同臂上PDMⅡMⅡ(90个)+an

++an

+

MⅡMⅡNPD(1)

++na

++na

两线双交换n＋＋＋n＋aan＋n＋a＋＋a＋an＋＋an＋单交换四线双交换

＋an＋na＋＋四线三交换如果n，a在异臂，则PD，NPD均为双交换型，机会应相等，因此我们可以判断na在同臂。2.通过在n和a分别为MI

和MⅡ的情况下,对子囊数与

RF(·－n),RF(·－a)进行比较分析来判断按照等位基因分离的时期,n+

+a杂交结果排列表nic/＋＋/ade子囊数MIMIMIIMIIMIMIIMIMII(808+1)=809(90)=90(5)=5(90+5+1)=961000RF(·－nic)=5.05%RF(·－ade)=9.30%若n和a各自独立的与着丝粒发生交换的话，则MII的子囊数比应为9.30%︰5.05%≈1.84︰1事实上：交换发生在着丝粒与ade间，n是MI,a是MII的子囊有90个。交换发生在着丝粒与n间，n是MII

，a是MI的子囊只有5个。比例相差悬殊，所以这两个基因处在着丝粒的同一侧。另外，在n与着丝粒发生交换时，a基因也一道与着丝粒发生了交换。即n是MII

，a也是MII共计96（=90+1+5)个子囊。也就是，同一交换使nic/＋出现MII型分离，也使＋/ade出现MII型分离，101次中有96次，也证明n,a在着丝粒的同一侧。

从染色体交换和重组规律来理解3种四分子类型和各类子囊形成机制图6-83种四分子的形成原因

交换类型染色体图象重组四分子类型子囊型无交换

四线双交换(1-4)(2-3)单交换

(1-4)0%100%50%＋an＋＋an＋＋an＋＋a,＋a,n＋,n＋(PD)＋＋,＋＋,na,na(NPD)＋＋＋,＋a,n＋,na(T)①②③＋an＋n＋a＋n＋交换类型染色体图象重组四分子类型子囊型二线双交换(2-3)单交换(2-3)四线多交换(1-4)(2-3)50%0%100%＋an＋＋a,na,＋＋,n＋(T)＋a,n＋,＋a,n＋(PD)＋＋,na,＋＋,na(NPD)④⑤⑥＋an＋

＋an＋＋na＋＋an＋an＋＋＋an＋＋＋,na,＋a,n＋(T)⑦50%三线双交换(1-3)(2-3)＋＋na

校正着丝粒与ade间的重组值估算两基因的RF值：

RF（nic-ade)=重组型/（亲本型+重组型）×100%=（1/2T+NPD）/（T+PD+NPD）×100%=5.20%

0nicade

9.30

10.25

5.25.05注意：5.05+5.2=10.25

9.30。原因：着丝粒和ade间发生过双交换，但在计算RF（0-ade)时却没有计算在内，而在计算RF（0-nic)和RF（nic-ade)时都各计算一次。着丝粒与ade间的重组值可从下表中得到校正子囊型每一子囊被计算为重组子的染色单体数子囊数在所有子囊中被计算为重组子的染色单体数·－nn－a·－a

·－

nn－a·－

a2345670400222202022422221905901504001800180242101010总数202208372由上表可以看出202+208≠372，低估的重组值=（202）/4000×100%=0.95%RF（0-nic)+RF（nic-ade)=RF（0-ade)+0.95%=9.30%+0.95%=10.25%

二.非顺序四分子的遗传分析酿酒酵母、构巢曲霉和单细胞藻类的衣藻的每一个子囊中8个子囊孢子的排列是杂乱无序的,这种四分子为非顺序四分子.

ab×a＋b＋

abaB

ababaB

aB

AB

Ab

AbAB

Ab

AB

无序四分子三种可能的类型

孢子类型:

PDNPDT①②③

abAB●●如酿酒酵母：a+b+×ab杂交时，无论有无连锁，只产生3种可能的无序四分子。RF=0.5A,B基因不连锁RF<0.5A,B基因连锁第一种类型（PD）看起来似乎是两个基因座位都属于MI模式，实际上，这些孢子以任意顺序写出来都是等效的。因此子囊仅仅有二型和四型两种类型。在二型子囊中，要么是亲二型（PD），要么是非亲二型（NPD），四型子囊由T所示。m值和遗传图距的计算m值:指某一区域平均每个减数分裂的交换数.M=1单交换SCO+2×双交换DCO1双交换DCO=4非亲本型NPD1单交换SCO=T-2NPDm=T+6NPD图距=m×50m=T-2NPD+2×4NPD举例：

若在AB×ab中，PD=0.56，NPD=0.03，T=0.41，请计算a、b间的图距。

RF=1/2T+NPD=1/2×0.41+0.03=0.235=23.5%

图距=50×（T+6NPD）

=50×（0.41+6×0.03）=29.5cM第三节真核生物重组的分子机制遗传重组：造成基因型变化的基因交流过程。发生：减数分裂性细胞内，体细胞地点：核基因间，叶绿体基因间，线粒体基因间，重组子间；前提条件：不同基因型的遗传物质彼此能够转移。作用：保证了遗传多样性,为选择奠定了物质基础,使生物得以进化发展，与突变一起是变异的来源同源重组/普遍性重组

1.同源重组：依赖大范围的DNA同源序列的联会，重组过程中，两个染色体或DNA分子交换对等的部分。例：同源染色体非姐妹单体交换；细菌的转化、转导、结合；噬菌体的重组…需要重组的蛋白质参与；（例如.大肠杆菌：RecA蛋白、RecBC蛋白）蛋白质因子对DNA碱基序列的特异性要求不高；（存在重组热点和序列长度的影响）真核生物染色质的状态影响重组的频率。

2.条件：2个DNA分子序列同源，且同源区域越长越有利。

3.功能：

A：维持种群的遗传多样性；

B：有助于DNA的损伤修复；

C：是真核生物在第一次减数分裂中染色体正确分离到子细胞至关重要的瞬间物理连接。6.3.2同源重组的分子模型(1)同源重组的Holliday模型RobinHolliday于1964年提出了重组的杂合DNA模型，又称Holliday模型。该模型对重组过程的解释如下（图6-13）：A、同源的非姐妹染色单体联会；B：同源非姐妹染色单体DNA中两个方向相同的单链，在DNA内切酶的作用下，在相同位置同时切开；C：切开的单链交换重接;D：形成交联桥结构；E：交联桥沿配对DNA分子“移动”。两个亲本DNA分子间造成一大段异源双链DNA（Holliday结构）F：E和F相同；G：绕交联桥旋转1800；H：形成Holliday异构体；I、通过两种方式之一切断DNA单链，若左右切，则形成非重组体，若上下切则形成重组体。由上可知：无论Holliday结构断裂是否导致旁侧遗传标记的重组，他们都含有一个异源双链DNA区。HOLLIDAY模型(2)双链断裂起始重组模型

重组Holliday模型显示了两个双链DNA分子的单链依次被切开并参与遗传重组。但实际的遗传交换大多是由双链断裂引发的。第四节基因转变及其分子机制一、异常分离与基因转变在子囊菌中，一对等位基因杂交子代的子囊通常形成6种正常分离类型(AAAAaaaa等—M1分离或AAaaAAaa等—M2分离).在这6种类型中，等位基因A:a=4:4。但后来发现在有