细胞生物学课件

1

细胞生物学研究方法

ExperimentalApproachesforStudyingCells2OUTLINE2.1显微成像技术（TECHNIQUESOFMICROSCOPY）2.2细胞组分的分析方法（TECHNIQUESOFCYTOCHEMISTRY、CELLSORTING、ISOLATIONOFCELLCOMPONENT）

2.3细胞工程技术（CELLENGINEERING）2.4组学研究技术

(GENOME、TRANSCRIPTOMICS、PROTEOME)32.1TECHNIQUESOFMICROSCOPY

镜像形成的三要素:

照明系统(illumination)

样品(sample)

透镜系统(optics)物镜:

玻璃vs电磁透镜目镜：玻璃vs

荧光屏可见光

vs

电子束

Light

Electron

光学显微镜

电子显微镜(TheLightMicroscope)

(Electronmicroscope)42.1.1

光学显微镜（TheLightMicroscope）技术参数：

放大率(magnification,M) M=物镜放大率X目镜放大率

分辨率（resolution,R）:分辨出相邻两个物点间的最小距离

R=0.61λ/NA（λ:波长，可见光0.4~0.7μm）

显微镜的数值孔径(numericalaperture,NA) NA=nsina（n，介质折射率;a，镜口角）???最大分辨率a:70°n:1.5(油)λ:450nm(可见光)200nm(紫外光)5

常用光学显微镜：

◆普通双筒显微镜

(binoularmicroscope) ◆相差显微镜:

(phasecontrastmicroscope) ◆微分干涉显微镜

(differentialinterferencemicroscope）

◆暗视野显微镜

(darkfieldmicroscope)

◆荧光显微镜

(fluorescencemicroscope) ◆激光共聚焦显微镜

(laserconfocalscaningmicroscope)6倒置显微镜正置显微镜7◆相差显微镜：(phasecontrastmicroscope)无色、透明、活细胞结构环形光阑（annulardiaphragm）相位板（annularphaseplate）标本密度不同导致光程差振幅差

8DIC◆微分干涉显微镜：(differentialinterferencemicroscope）

更强立体感，便于显微操作9◆暗视野显微镜(darkfieldmicroscope)：物体轮廓，无微细结构

丁达尔现象：光斜射到样品上10◆荧光显微镜：(fluorescencemicroscope)紫外光源激发细胞内荧光标记染料ExcitationEmission11◆激光共聚焦显微镜：(laserconfocalscaningmicroscope)激光扫描、分辨力提高、可立体三维重建122.1.2电子显微镜

(Electronmicroscope)电子束波长比光短100000倍亚显微结构（超微结构）：R<1nm

基本结构◆电子光学系统由照明系统、标本室、成像系统、观察窗和记录用的照相机等组成；◆真空系统是保持电镜的真空度；◆电子学系统即供电系统，需要高压稳压。13电子显微镜种类：

◆透射电子显微镜：细胞内部结构观察

(transmissionelectronmicroscope) ◆扫描电子显微镜：样品表面形貌特征观察

(scanningelectronmicroscope) ◆扫描隧道显微镜

(scanningtunnelingmicroscope)

微观世界物质表面特征，但样品必须是导体 ◆原子力显微镜

(atomicforcemicroscope）

微观世界物质表面特征，不要求导体，提供三维表面图，不需样品处理、常压及液体环境中工作；但分辨率低于扫描电镜142.2细胞组分的分析方法2.2.1细胞化学技术（cytochemistry）2.2.2细胞分选(cellsorting)2.2.3细胞组分的分离

(isolationofcellcomponent)

15◆酶细胞化学技术（酶与底物）

酶细胞化学技术就是通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位。◆免疫细胞化学技术（抗原抗体）

利用免疫反应定位组织或细胞中的抗原成分分布

免疫荧光技术

免疫电镜技术◆放射自显影技术(radioautography)：利用放射性同位素标记研究细胞内大分子的合成动态（分布、定位、排出、合成等）◆其他：DNA、RNA染色:原位杂交技术(insituhybridization)2.2.1细胞化学技术（cytochemistry）Cellmorphology+cellcomponentanalysis162.2.2细胞分选(cellsorting)◆流式细胞术(Flowcytometry)干涉检测器：发现细胞荧光检测器：发现标记◆染色体分选(chromosomesorting)172.2.2细胞分选(cellsorting)◆流式细胞术(Flowcytometry)182.2.3细胞组分的分离

(isolationofcellcomponents)

超速离心技术(Ultracentrifugation)：分离细胞器与生物大分子及复合物◆速度离心：差速离心、移动区带离心◆等密度离心：densitygradient层析分离技术(Highperformanceliquidchromatography,HPLC)：分离蛋白质◆凝胶过滤(gelfiltration)：◆亲和层析(affinitypurification)：◆离子交换层析(ion-exchangechromatography)19202.3细胞工程技术（CELLENGINEERING）2.3.1细胞培养(Cellculture)

体外细胞培养的条件

◆营养

◆环境因素∶

无菌环境、合适的温度、一定的渗透压和气体环境、O2和CO2。后者对于维持细胞培养液的酸碱度十分重要。

◆代谢物和废物排除

原代细胞(primarycells)：从机体分离取出，<10passages细胞系(cell

line)：原代培养物首次传代成功后细胞株(cell

clone)：单细胞克隆CHO细胞的培养22胚胎干细胞（embryonicstemcell）体细胞（somaticcell）和干细胞(stemcell)Yamanaka/Jaenisch四因子实验Oct4Sox2MycKlf4囊胚显微注射嵌合体小鼠带选择标记的成纤维细胞iPS细胞移植诱导多能干细胞(induced

pluripotentstemcell,iPSC）24基因敲除示意图（1）25基因敲除示意图（2）262.3.2细胞融合与单克隆抗体

272.3.3基因转染与敲除转染(transfection)：将具有生物功能的核酸转移或运送到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能敲除(knockout）:显微操作术(microinjection)动物细胞核移植克隆(Nucleartransfer)转基因鼠及选择性基因剔除(transgenicmiceandconditionalknockout)28细胞核移植克隆29KnockoutMiceThetechniqueusedtogenerateknockoutmicewasdevelopedinthelate1980sbyMarlo

CapecchiattheUniversityofUtah.

实验分三步∶

◆构建重组载体；

◆转基因敲除；

◆筛选。30基因敲除原理312.4组学研究技术

(GENOME、TRANSCRIPTOMICS、PROTEOME)GENOME：HighthroughputDNAsequencing…TRANSCRIPTOMICS:Geneexpressionarray/Chip…PROTEOME:proteinarray/Chip,tissueorcellchip,Massspectrometry…OUTLINE3.1细胞膜概述（INTRODUCTION

OF

CELL

MEMBRANE）

3.2膜的化学组成(THECHEMICALCOMPOSITIONOFMEMBRANES)3.3膜的分子结构及特点(MOLECULARSTRUCTUREOFTHEPLASMAMEMBRANE)3.4物质的跨膜运输(PASSIVE

ANDACTIVETRANSPPORTOF

SUBSTANCES)3233细胞的生物膜体系

膜的结构

细胞质膜(PlasmaMembrane):

细胞表面

内膜系统（EndomembraneSystem)：

或胞质膜，细胞质内

生物膜(Biomembrane)：细胞所有膜结构343.1细胞膜概述（INTRODUCTION

OF

CELL

MEMBRANE）

2024/3/1835Commonfunctionsofplasmamembrane界膜和区室化;功能定位与组织化：Actaspermeabilitybarrierandtakepartinthecompartmentalizationofcell参与细胞间的相互作用；信号检测与传递：Formspecificjunctionsbetweencells；Anchorcomponentsoftheextracellularmatrix；Containreceptorproteinsthatbindspecificsignalingmolecules能量转换；调节运输：Energytransduction，transport细胞壁的组装:

Intimatelyengagedintheassemblyofcellwalls3.2膜的化学组成(THECHEMICALCOMPOSITIONOFMEMBRANES)

TheErythrocyteMembraneSkeleton◆MatureRedBloodCells: ■nointracellularorganelle

■plasmamembrane:theonlymembranestructure!!3637红细胞血影38推测双脂层的实验：Langmuir水盘“脂单层”39

红细胞膜脂双层结构的研究

◆1925年两位荷兰科学家E.Gorter和F.Grendel根据对红细胞质膜的研究发现红细胞膜脂铺展后面积与实际测量的表面积之比约为1.8～2.2∶1。

首次提出质膜的基本结构是脂双层

(lipidbilayer)

？？Questions∶

◆行程∶500,000米

◆要多次穿过小于自身直径一半的微小通道;

◆要在脾脏内经受少氧、低pH值的不利条件;

◆又要经过心脏内瓣膜涡流冲击，但始终保持结构的完整。

40？？红细胞膜仅仅是双层脂？？41红细胞膜蛋白其中有三种主要的蛋白*骨架蛋白：#血影蛋白*#血型糖蛋白*带3蛋白*锚定蛋白#带4.1蛋白#肌动蛋白#42ErythrocyteMembraneSkeleton

膜骨架：红细胞膜内表面膜蛋白、纤维蛋白

3.2.1膜脂（MembraneLipids）maintypesofmembranelipids:◆甘油磷酯(phosphoglycerides)：◆鞘脂（sphingolipid）◆胆固醇（cholesterol）433.2膜的化学组成(THECHEMICALCOMPOSITIONOFMEMBRANES)脂类、蛋白质、糖类(lipids,proteins,saccharide)Phospholipid44Structureofmembranelipidamphipathicmolecules（两性分子）hydrophilicheadgroup+hydrophobictailgroup45

Phosphoglyceride？？头部尾部特性46PhosphoglycerideandSphingolipidsPhosphoglycerideSphingolipids47Sphingolipids◆磷脂(phospholipids)

动、植物细胞膜上都有磷脂,约占膜脂的50%以上；磷脂分子的亲水端是磷酸基团，称为头部；磷脂分子的疏水端是两条长短不一的烃链,称为尾部,一般含有14～24个偶数碳原子；其中一烃链常含有一个或数个双键,双键的存在造成这条不饱和链有一定角度的扭转；结构影响膜的流动性4849TypicalCholesterol◆胆固醇(Cholesterol)胆固醇存在于真核细胞膜中：●动物细胞膜胆固醇的含量较高●植物、细菌细胞膜多不含胆固醇●酵母细胞膜中是麦角固醇胆固醇分子包括三部分:

●极性的头部：羟基

●非极性的类固醇环结构

●一个非极性的碳氢尾部。干扰磷脂脂肪酸尾部运动：调节膜流动性，增强膜通透性屏障50

膜脂的特性

膜脂的基本性质是“amphipathicmolecule”,能够selfassemblingas双层结构或自我封闭成球状，受到损伤时可以自动再封闭。5152SelfAssemblyofLipidBilayer◆脂质体(Liposome)可用作生物膜的研究模型，并可作为生物大分子与药物的运载体。

膜脂的功能◆构成膜的基本骨架,去除膜脂，则使膜解体;◆是膜蛋白的溶剂，一些蛋白通过疏水端同膜脂作用，使蛋白镶嵌在膜上，得以执行特殊的功能;◆膜脂为某些膜蛋白(酶)维持构象、表现活性提供环境,一般膜脂本身不参与反应(细菌的膜脂参与反应);◆膜上有很多酶的活性依赖于膜脂的存在。有些膜蛋白只有在特异的磷脂头部基团存在时才有功能。533.2.2膜糖（membranecarbohydrate）

◆存在方式：glycoprotein(93%)；glycolipid(7%)◆膜糖功能保护作用细胞与环境的相互作用2024/3/1855Structureofglycolipidmoleculesinplasmamembrane◆糖脂(Glycolipid)56糖脂普遍存在于原核和真核细胞膜上,含量约占膜脂的5%以下;最简单的糖脂是己糖脑苷脂,它仅有一个己糖作为极性头部;变化最多、最复杂的是神经节苷脂,它是神经原质膜具特征性的成分;保护细胞膜、信号识别。

Glycolipid

function:Protectionsignaltransduction3.2.3膜蛋白（membraneprotein）

◆存在方式：整合蛋白：跨膜蛋白，部分或全部镶嵌在膜中外周蛋白：外露在膜的外侧或内侧，非共价键脂锚定蛋白：共价键方式与脂分子连接◆膜蛋白功能：运输代谢连接信号转导去垢剂可以破坏脂双层溶解膜蛋白利用温和去垢剂溶解、纯化和重建功能膜蛋白的系统3.3.1STRUCTUREMODELS◆流动镶嵌模型(Fluidmosaicmodel)◆脂筏模型(Lipidraftsmodel)3.3膜的分子结构及特点(MOLECULARSTRUCTUREOFTHEPLASMAMEMBRANE)1972年Singer和Nicolson提出了生物膜的“流动镶嵌模型”，它的要点是：膜上脂质分子排成双层构成生物膜的骨架，蛋白质分子以不同方式镶嵌或联结于脂双层上；膜的两侧结构是不对称的，膜脂和膜蛋白具有一定的流动性。Fluidmosaicmodelβ桶跨膜结构局限在细菌、线粒体和叶绿体的外膜上。跨膜a螺旋脂筏模型(Lipidraftsmodel)膜上一些特殊的脂质能形成稍厚的微区，这种大小约70纳米的动态结构像筏子一样，带着大量的膜蛋白以集中完成各种复杂功能，这就是生物膜的脂筏模型。脂筏模型是对流动镶嵌模型的补充!!!!!63具有较长的饱和脂肪酸链，分子间的作用力较强，所以这些区域结构致密，介于无序液体与液晶之间，称为有序液体（Liquid-ordered）。在低温下这些区域能抵抗非离子去垢剂的抽提，所以又称为抗去垢剂膜（detergent-resistantmembranes，DRMs）。像一个蛋白质停泊的平台，与膜的信号转导、蛋白质分选均有密切的关系。脂筏中的胆固醇就像胶水一样，它对具有饱和脂肪酸链的鞘磷脂亲和力很高，而对不饱和脂肪酸链的亲和力低。用甲基-β-环糊精（methyl-β-cyclodextrin）去除胆固醇，抗去垢剂的蛋白就变得易于提取。膜中的鞘磷脂主要位于外层，而且大部分都参与形成脂筏。脂筏的面积可能占膜表面积的一半以上。脂筏的大小是可以调节的。小的独立脂筏可能在保持信号蛋白呈关闭状态方面具有重要作用；当必要时，这些小的脂筏聚集成大一个大的平台，在那里信号分子（如受体）将和它们的配件相遇，启动信号传递途径。脂筏特点：3.3.2膜的不对称性（Membraneasymmetry）

研究方法：

冰冻蚀刻技术(Freeze-fracturereplication)

膜不对称性的表现：◆膜脂不对称性：脂双层两小叶（leaflet）中分布的各类脂的含量不同。◆膜蛋白的分布不对称：在膜两侧分布不对称，一般说,细胞质面的蛋白比外表面少,一些酶和受体多处于外表面。◆膜糖的不对称：糖脂分布在动物细胞外表面，糖蛋白分布于脂膜双层的外叶。

膜的不对称性的意义：◆膜脂、膜蛋白及膜糖分布的不对称性导致了膜功能的不对称性和方向性,保证了生命活动的高度有序性。◆膜不仅内外两侧的功能不同,不同区域的功能也不相同。造成这种功能上的差异,主要是膜蛋白、膜脂和膜糖分布不对称引起的。◆细胞间的识别、运动、物质运输、信号传递等都具有方向性。这些方向性的维持就靠分布不对称的膜蛋白、膜脂和膜糖来提供。

1970年，LarryFrye和MichaelEdidin进行了鼠、人细胞融合实验，令人信服地证明膜的流动性。3.3.3膜的流动性（MEMBRANEFLUIDITY）

膜脂的运动方式

◆侧向扩散(lateraldiffusion)

◆旋转(rotation)

◆翻转(flip-flop)

◆屈曲(flexion)使用荧光漂泊再恢复方法来测定膜上脂质的侧向扩散70

影响膜流动性的因素：

膜的流动性依赖于膜的组分和温度。

◆相变温度（transitiontemperature）在生理条件下,膜脂多呈拟液态（liquid-likestate）。温度下降至某点,则变为晶态（frozencrystallinegel）。一定温度下,晶态又可熔解再变成液晶态，这种临界温度称为相变温度。◆相变(phasetransition)在不同温度下发生的膜脂状态的改变称为相变。不同的膜脂由于成分不同而各有其相变温度。71◆膜脂肪酸链对膜流动性的影响：不饱和程度和链的长短碳氢链较短或者含有双键，相变温度就会降低，这样膜在较低的温度下还可以保持流动性。较短的链减少了同一层或者双层之间碳氢链的相互作用。顺式双键使得碳氢链产生弯折难以相互堆积。◆胆固醇使得脂质在双层中堆积更为紧密，提高稳定性及有序性可塑分子：在相变温度以上,它可使磷脂分子的脂酰链末端的运动减小,即限制膜的流动性。在相变温度以下,可增加脂类分子脂酰链的运动,这样可以增强膜的流动性。72◆卵磷脂/鞘磷脂比值对膜脂流动性的影响卵磷脂所含的脂肪酸链的不饱和程度高,链较短,相变温度低,因此卵磷脂含量高,流动性大。而鞘磷脂的脂肪酸链的饱和程度高,相变温度也高,因此,鞘磷脂的含量高,流动性低。◆膜蛋白对膜脂流动性的影响73

影响膜蛋白流动性的因素 ◆整合蛋白相互间的影响 ◆膜骨架的影响 ◆细胞外基质的影响 ◆相邻细胞的影响 ◆细胞外配体、抗体、及药物大分子的影响

膜蛋白的运动方式

◆随机

◆定向

◆局部细胞外基质对整合蛋白移动的影响膜骨架对膜蛋白流动性的影响

膜的流动性的意义：

◆酶活性 ◆物质运输

◆能量转换

◆信号转导 ◆细胞周期 在M期,膜的流动性最大,而在G1期和S期,膜流动性最低；

3.4物质的跨膜运输(PASSIVE

ANDACTIVETRANSPPORTOF

SUBSTANCES)77生物大分子:膜泡运输(vesicle

transport)

离子及小分子:穿膜运输Phagocytosis78脂双层具有半通透性质：极性分子，只能很慢地穿过合成脂双层，但膜上有一些特别的蛋白帮助这些分子跨膜运输。膜蛋白的主要功能就是跨膜运输营养分子、排出代谢废物以及调节胞内的离子浓度，这些跨膜运输蛋白占膜蛋白的15-30%。离子及小分子:穿膜运输

两类主要的跨膜运输蛋白转运蛋白（transporter）和通道蛋白（channel）转运蛋白：跨膜运输分子的过程类似酶和底物的反应，有最大运输速率和亲和反应常数，被运输小分子的结合还可以被竞争性或非竞争性的抑制剂所抑制，不同的是转运蛋白并不会改变被运输的小分子。通道蛋白：与溶质分子的结合能力非常弱，它们形成狭窄的跨膜水溶性通道，在通道开放时允许特定的溶质分子（通常是一些小的无机离子）穿越通道。与转运蛋白相比，通道蛋白的运输速率要高4到8个数量级。被动运输和主动运输被动运输（passivetransport):分子或离子顺电化学梯度跨膜运输，不需要消耗另外的能量，包括简单扩散和易化扩散。主动运输（activetransport)：需要提供额外的能量、逆着电化学梯度跨膜运输。主动运输是由一些称作泵（pump）的转运蛋白完成的，它们有很强的方向性。3.4.1被动运输3.4.1.1

简单扩散（simplediffusion）指被动运输不需要膜蛋白的帮助，但不额外消耗能量。仅靠膜两侧保持一定的浓度差,通过扩散发生的物质运输。◆限制因素■脂溶性∶

细胞质膜的通透性具有选择性。

■Size

：质膜的通透性孔径不会大于0.5-1.0nm，能够扩散的最大分子是水分子。■Polarity∶极性物质通常同水结合形成一个水合的外壳，这不仅增加了它们的分子体积，同时也大大降低了脂溶性。3.4.1被动运输3.4.1.2

易化扩散（facilitateddiffusion）指被动运输需要膜蛋白的帮助，顺浓度梯度或电化学梯度，但不额外消耗能量。

促进扩散的特点：

Similarinmanywaystoanenzyme-catalyzedreaction

◆速度快，要比自由扩散快几个数量级；◆自由扩散的速率与溶质的浓度成正比，而膜蛋白促进的运输可以达到最大值；◆具有特异性;◆运输作用受抑制剂的抑制。3.4.1被动运输

通道蛋白与易化扩散◆通道蛋白形成的通道又叫闸门通道(gatedchannels)，是通道蛋白进行的间断开放通道。■配体闸门通道(Ligand-gatedchannels)■电位闸门通道(Voltage-gatedchannels)■牵张闸门通道(Stretch-gatedchannels)

载体蛋白与易化扩散◆载体蛋白需要同被运输的离子和分子结合，然后通过自身的构型变化或移动完成物质运输。载体蛋白特点:■高度特异性■载体蛋白既参与被动的物质运输，也参与主动的物质运输。3.4.2主动运输主动运输的特点:■逆梯度运输■依赖于膜运输蛋白■需要代谢能■耗能选择性和特异性主动运输的意义:■保证细胞及细胞器从周围环境中或细胞表面摄取必需的营养■能将细胞内的各种物质排到细胞外■能够维持一些无机离子在细胞内恒定和最适浓度

主动运输方向：单向转运（cotransport),偶联转运（coupling

transport)。

根据能量的来源在细胞中有三种主动运输的方式：偶联转运，ATP驱动泵和光驱动泵。LightelectrochemicalgradientLightpoweredpump88

偶联运输

又称协同运输。这种运输需要先建立离子学梯度(Iongradients)，在动物细胞主要是靠Na+泵、在植物细胞则是由H+泵完成的。

协同运输的方向分为：◆同向协同(symport)：

动物细胞的葡萄糖和氨基酸就是与Na+

同向协同运输。◆反向协同(antiport)：

H+

与Na+

的反向协同。运输：H+,Na+,K+,Ca2+H+onlyIonsandvarioussmallmoleculesATP驱动的主动运输利用ATP水解成ADP和磷酸所释放出来的能量跨膜主动运输物质的蛋白叫做ATP驱动泵，也称为转运ATP酶，它在原核细胞和真核细胞中广泛存在。2024/3/1890三类ATP泵ClassExamplesP-ClassPlasmamembraneofplants,fungi,bacteria(H+pump),Plasmamembraneofhighereukaryotes(Na+/K+pump),Apicalplasmamembraneofmammalianstomach(H+/K+pump),Plasmamembraneofalleukaryoticcells(Ca2+pump),Sarcoplasmicreticulummembraneinmusclecells(Ca2+pump)V-ClassVacuolarmembranesinplants,yeast,otherfungi,Endosomalandlysosmalmembranesinanimalcells,Plasmamembraneofosteoclastsandsomekidneytubulecells.F-ClassBacterialplasmamembrane,Innermitochondrialmembrane,ThylakoidmembraneofchloroplastABC-ClassBacterialplasmamembranes(aminoacid,sugar,andpeptidepermeases),Mammalianplasmamembranes(transportersofphospholipids,smalllipophilicdrugs,cholesterol,othersmallmolecules)P型泵-钠钾泵P型泵在泵循环过程中会自我磷酸化，由多次跨膜蛋白构成，包括很多负责建立和维持跨膜钠离子、钾离子、质子和钙离子梯度的主动运输蛋白。也叫做钠钾ATP酶，它利用ATP水解的能量逆电化学梯度将钠离子运出细胞、将钾离子运进细胞。当钠离子和钾离子的浓度梯度增加到一定程度，使得电化学梯度的能量比ATP水解的化学能更高的时候，钠钾泵就可以反向作用，利用这些离子顺电化学梯度扩散的能量来产生ATP。总的自由能变化是用于合成ATP还是泵出钠离子，取决于ATP、ADP和磷酸根的相对浓度，以及钠离子和钾离子的电化学梯度。F/V型泵-ATP合成酶F型泵是由不同亚基组成的形状像涡轮机的蛋白。在细菌的质膜、线粒体内膜和叶绿体类囊体膜上发现，通常也被称作ATP合成酶，它们利用质子的跨膜梯度驱动ATP合成。质子梯度的形成来源于厌氧细菌和线粒体中的氧化磷酸化过程，或者是植物叶绿体中光合作用中的电子运输，也可以是嗜盐菌中光驱动的质子泵形成的。

V型ATP泵与F型ATP泵结构类似，它们通常是利用ATP水解的能量来驱动质子运输，将质子泵进细胞器（例如溶酶体，突触囊泡和植物的液泡），酸化这些细胞器的内部环境。V型ATP泵与膜上钠离子浓度梯度驱动运输质子的主动转运蛋白一起，来共同调节膜内的pH环境。ABC转运蛋白–多药抗性蛋白ABC转运蛋白是膜转运蛋白中的一个大家族，跨膜转运种类繁多的分子，包括无机离子、氨基酸、单糖、多糖、小肽甚至是蛋白质。ABC转运蛋白有两个高度保守的ATP结合区（ATP-bindingcassette），结合ATP可以使该区域二聚化，水解ATP使得这个结合区解聚。在胞内发生的这种结构变化被认为可以传递到跨膜区，使得蛋白构象循环变化，可以将底物结合的位点交替地朝向膜内和膜外。通过这种方式，ABC转运蛋白利用结合ATP和水解ATP来跨膜运输多种多样的小分子。金黄色葡萄球菌中的多药抗性蛋白，显示了结合ATP后的构象。Nature443:156,180(2006)光能驱动的主动运输一些细菌和古细菌能利用光能作为能量来源，驱动跨膜的离子运输。它们通常需要一个特别的可以吸收光子的生色团分子（如蛋白质-细菌视紫红质（bacteriorhodopsin）的视黄醛（retinal）生色团），当被一个单光子激活时，它会改变形状并引起蛋白中一系列的构象变化，使得一个质子从细胞内转移到细胞外。并将光能转化为生物可以直接利用的化学能。光驱动的质子转移在细菌质膜两边建立起质子浓度梯度，它可以被F型ATP泵利用来合成ATP，也可以作为细菌中其它活动的能量来源。跨膜运输的方式Over360familiesoftransporterhavebeenidentifiedthroughbiochemicalandgenomicanalysis.TransportProteinDatabase:/tcdb96动物、植物细胞主动运输的比较OUTLINE4.1

细胞表面(CELL

SURFACE)4.2

细胞外基质

(EXTRACELLULAR

MATRIX,ECM)4.3细胞识别、黏着与连接(CELLRECOGNITION,ADHESIONANDJUNCTION)97Anoverviewofcellsinteractwiththeirenvironment

4.1CellSurface●细胞被(cellcoat)●细胞质膜(cytoplasmicmembrane)●保护细胞,使细胞有一个相对稳定的内环境；●参与细胞内外的物质交换和能量交换；●参与信号的识别和信息的传递；●参与细胞运动；●维护细胞的各种形态；与免疫、癌变等有十分密切关系。◆结构：◆功能：Electronmicrographofthesurfaceofalymphocyte4.1.1CellCoat

细胞被(cellcoat)or多糖包被或糖萼(Glycocalyx)●组成：“糖”●功能：

mechanicalprotectioncell-cellandcell-substratuminteractions

纤维素(cellulos):

葡萄糖多聚体

半纤维素(Hemicellulose)：不同类型单糖的异质多聚体

果胶(pectin)：半乳糖醛酸及其衍生物多聚体

木质素(lignin)：聚合芳香醇

糖蛋白(glycoprotein)：extensin4.1.2PLANTCELLWALLS

细胞壁的结构组成

(植物)细胞壁=(动物)细胞外基质多糖蛋白质分子

CELLWALLSLAYERSofPLANTCELLWALLS主要是果胶在细胞停止生长后分泌形成的

植物细胞壁的分泌合成◆中间层形成：

主要是果胶。果胶是相邻两细胞壁所共有，并且具有将两个细胞连接在一起的作用。◆初生壁形成：

是细胞正在生长时形成的。初生壁由纤维素、半纤维素、果胶和糖蛋白等松散组成。◆次生壁形成：

是在细胞停止生长后分泌形成的。主要是增加细胞壁的厚度和强度。次生壁主要成分是纤维素和木质素。

植物细胞壁的作用◆提供机械强度◆植物细胞壁是一个动态结构，能够进行很多活动:●与细胞壁有关的酶能够吸收细胞外的营养，生成能够通过细胞膜进入细胞的小分子化合物。●细胞壁也可以作为物质通透的障碍，在代谢和分泌过程中起重要作用。4.1.3BACTERIACELLWALLS

细胞壁的结构组成

Gram-positivevsGram-negativeN-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸交替连接形成胞壁质多糖链通过N-乙酰胞壁酸与肽桥结合

胞壁质(murein):肽聚糖(peptidoglycan)？青霉素的作用4.2Extracellularmatrix◆细胞分泌的大分子在细胞间交织连接成网状结构，称ECM

细胞外基质的组成∶●蛋白聚糖(proteoglycan)●结构蛋白(structureprotein)：胶原和弹性蛋白，它们赋予基质一定的强度和韧性。●黏着蛋白(adhesiveproteins)：纤连蛋白和层粘蛋白，它们促使细胞同基质结合。◆维持细胞形态及活性，信号转导，细胞分化….TypicalECM4.2.1蛋白聚糖(Proteoglycan,PG)●coreprotein+glycosaminoglycans(GAGs,糖胺聚糖)

，构成ECM的基质

糖胺聚糖

(Glycosaminoglycans)●重复二糖单位构成无分支长链多糖●二糖单位之一是氨基己糖(氨基葡萄糖或氨基半乳糖),故称为糖胺聚糖。●二糖单位包括∶硫酸软骨素(chondroitinsulfate)

透明质酸(hyaluronicacid)…..构成糖胺聚糖的二糖

透明质酸(hyaluronicacid)不同于其他PG，在细胞外基质中也可游离存在。作为长轴，将蛋白聚糖连接在一起。

透明质酸-蛋白聚糖复合物。4.2.2结构蛋白

胶原(Collagen)●water-insolublefibrousglycoproteins,thebackboneproteinsforECM.●mostabundantproteininthehumanbody(>25percentofallprotein)withhightensilestrength:collagenfiber(Φ1mm)

suspending10kg.●producedprimarilybyfibroblasts,andalsobysmoothmusclecellsandepithelialcells.●tropocollagenconsistingofthreeapolypeptidechains(Gly-X-Y)nStructuralfeatures原胶原的三条链之间的赖氨酸(lysine)残基间的交联不同原胶原间的赖氨酸交联◆胶原的组装◆胶原的合成、装配与运输◆胶原的作用

●胶原是骨、腱和皮肤组织中的主要蛋白，在这些组织的细胞外基质中,胶原起着细胞外基质骨架作用；

●胶原具有促进细胞生长的作用；

●维持并诱导细胞分化的作用。皮肤过渡松弛症胶原酶的遗传缺陷，胶原纤维不能正确地装配

弹性蛋白(Elastin)◆是弹性纤维(elasticfibers)的主要成分。◆功能：能够赋予细胞外基质弹性。◆富含甘氨酸和脯氨酸的蛋白质。◆与胶原不同：弹性蛋白没有羟基化，所以没有羟赖氨酸的存在。弹性蛋白的结构4.2.3黏着蛋白(adhesiveprotein)细胞外基质与细胞联系的桥梁，促进细胞同基质结合

纤连蛋白(Fibronectin,FN)

层连蛋白(laminin,LN)Fibronectin◆功能：◆RGD序列，介导细胞的黏着。◆具有同时与细胞外基质各类成分相结合的特点,是细胞外基质的组织者。Laminin◆功能◆基膜的主要结构成分对基膜的组装起关键作用。◆介导细胞黏着于胶原,使之发生铺展。

基膜(Basementmembrane)◆细胞外基质特异区：上皮和内皮的基底面4.2.4

细胞外基质与细胞的相互作用■层连蛋白：是基膜的主要成分，也是基膜的组织者；■Ⅳ型胶原■巢蛋白(entactin)■硫酸肝素糖蛋白基膜的结构Ⅳ型胶原是基膜的核心分子，排列成网状；层粘连蛋白同Ⅳ型胶原结合，覆盖在细胞表层。

整联蛋白(integrin)◆细胞外基质受体◆受体浓度高，与配体结合力低◆胞外端同基质蛋白结合◆胞内尾部与肌动蛋白结合◆细胞外基质与细胞内骨架双向联络，即细胞黏着◆信号传递整联蛋白与细胞外基质相连RGD序列：精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)4.3

CELLRECOGNITIONANDADHESION后

细胞的黏着(CellAdhesion)在细胞识别的基础上,同类细胞发生聚集形成细胞团或组织的过程。先

细胞的识别(CellRecognition)细胞对同种或异种细胞、同源或异源细胞以及对自己和异己分子的认识和鉴别。

细胞的识别◆抗原-抗体的识别◆酶与底物的识别◆细胞间的识别基本特性：选择性-特异性！！！拣出(sortingout)4.3.1

CELLRECOGNITION

细胞识别与黏着的分子基础

识别反应

细胞识别引起的细胞反应,大致有三种类型: ◆内吞 ◆细胞黏着 ◆信号反应糖-识别蛋白-黏着

细胞黏着◆概念：在细胞识别的基础上,同类细胞发生聚集形成细胞团或组织的过程。◆引起细胞黏着的主要是膜蛋白-细胞黏着分子(celladhesionmolecule,CAM）。4.3.2

CELLADHESION◆选择蛋白(Selectins);◆免疫球蛋白超家族(Immunoglobulinsuperfamily,orIgSF);

◆整合素(Integrins);

◆钙黏着蛋白(Cadherins)。其中①、③、④是钙依赖性的，②为钙非依赖性的◆细胞黏着的方式◆由同种细胞黏着分子介导◆由互补的细胞黏着分子介导◆由中介分子与细胞表面黏着分子介导钙黏着蛋白自我黏着同类细胞的拣出选择蛋白与细胞黏着识别特异性的糖基免疫球蛋白超家族同嗜性黏着或异嗜性黏着

细胞黏着小结共有六种不同的方式的细胞黏着：？四种细胞间黏着？两种细胞与细胞外基质的黏着

细胞的六种黏着方式4.3.3CellJunction细胞连接的概念：细胞表面的特化结构，或特化区域。两个细胞通过这种结构连接起来。与细胞黏着的关系：黏着在前，连接在后。CellJunction类型：◆紧密连接(tightjunction)：封闭◆斑形成连接(plaque-bearingjunction)：黏着◆间隙连接(gapjunction)：通讯

存在部位和结构特点◆又叫不通透连接(impermeablejunction),它不仅连接相邻的细胞,而且封闭细胞间隙,使大多数分子难以在细胞间通透。◆这种连接方式普遍存在于腔道上皮细胞靠近管腔端的相邻细胞膜间。◆从结构上看,通过连接蛋白形成焊接线，封闭相邻细胞间的空隙。紧密连接(tightjunction)紧密连接缝合蛋白(occludin)密封蛋白(claudin)

紧密连接的功能◆连接作用◆防止物质双向渗漏，◆维持细胞的极性，并限制了膜蛋白在脂分子层的流动◆又称锚定连接(anchoringjunction)；◆主要靠黏着蛋白、整联蛋白和细胞骨架体系将相邻两细胞或细胞与细胞外基质连接在一起。◆斑块连接分为：

●黏着连接(adherensjunctions)细胞间的连接作用与细胞骨架系统的肌动蛋白相关称为黏着连接。（黏着带+黏着斑）●桥粒(desmosome)

细胞间的连接作用与细胞骨架系统的中间纤维相关称为桥粒。（桥粒+半桥粒）

斑块连接(plaque-bearingjunction)黏着带(Adhesionbelts)细胞-细胞间黏着钙黏蛋白同肌动蛋白相互作用黏着斑(Focaladhesion)细胞-细胞外基质进行连接细胞外基质中的纤连蛋白通过整联蛋白同肌动蛋白相互作用黏着连接的作用桥粒(desmosomes)细胞-细胞间黏着钙黏着蛋白同中间纤维相互作用半桥粒(Hemidesmosomes)细胞-细胞外基质间黏着整联蛋白同中间纤维相互作用CommunicationJunction◆一种特殊的细胞连接,位于特化的具有细胞间通讯作用的细胞

◆具机械的细胞连接作用◆在细胞间形成电偶联或代谢偶联,以此来传递信号

◆通讯连接的方式：●间隙连接(gapjunction)：动物●胞间连丝(plasmodesma)：植物

间隙连接(gapjunction)◆Connexons●一种跨膜结构●每个连接子由6个相同或相似连接蛋白

(connexin)亚单位环绕中央形成孔径为

1.5-2nm的水性通道；●相邻两细胞分别用各自的连接子相互对接形成分子间的通道，允许分子量在

1200道尔顿以下的分子通过。间隙连接◆间隙连接的主要功能：●机械连接作用；●电偶联（Electricalcoupling）：在神经冲动信息传递过程中起重要作用●代谢偶联（Metaboliccoupling）代谢偶联可允许小分子代谢物和信号分子通过间隙连接

胞间连丝(plasmodesmata)◆胞间连丝的结构∶●是相邻植物细胞壁上的一个狭窄细胞壁通道●有管状的内质网通过。因此，通过胞间连丝，使得相邻细胞的细胞质膜、细胞质、内质网交融在一起●胞间连丝直径约30-60nm，允许1000道尔顿以下的分子渗透及大分子的运输。胞间连丝（Plasmodesmata）突触（

synapse）Figure19-22cMolecularBiologyoftheCell(©GarlandScience2008)？细胞连接的不同方式163OUTLINE5.1

BASICCHARACTERISTICSOFCELL-SIGNALINGSYSTEMS

5.2 GPROTEINCOUPLEDRECEPTOR5.3 SIGNALINGVIAENZYME-LINKEDRECEPTORSANDOTHERSIGNALINGPATHWAY5.4 SIGNALCONVERGENT、DIVERGENT、CROSSTALKANDCELLADAPTATION信号出现传递消息决策执行功能信息感受信息传递命令传递日常生活中的信息传递细胞通讯：CellCommunication165细胞通讯：CellCommunication细胞间或细胞内通过高精度和高效的接收信息通讯机制并通过放大引起快速的细胞生理反应/或引起基因活动，从而发生一系列的细胞活动来协调各组织行动，使之成为统一生命整体对外界环境变化作出综合应答。166CellSignal：信号的产生及传送

synthesisofsignalmolecule

release

transport

CellCommunicationReactionSignalTransduction：信号的接收、转换、应答

signalrecognition

transduction

responseTransductionSignalmoleculesrecognition(receptor)ReactionSIGNALINGCOMPONENTSFourTypesofCellCommunicationCell-SurfaceReceptorsFallintoThreeMainClassesTheBasicCellSignalingProcess(A)Contact-dependent:don’tneedsecretedmolecule(B)Papacrine:tonearbyneighbor(C)Neuronalsignaling(D)Endocrine:tolongdistanceFromBruceAlbertsetal.,MolecularBiologyofTheCell(5thedition))Signalcanactoverlongorshortrange.FourTypesofCellCommunicationFromEssentialCellBiology(©GarlandScience2010)FromEssentialCellBiology(©GarlandScience2010)1715.1.1

CellSignalingandSignalmolecule不依赖于细胞接触：依赖于细胞接触：172TransductionSignalmoleculesrecognition(receptor)Reaction5.1.2

SignalRecognitionandReceptors受体（receptor）：任何能够与信号分子结合并能

引起细胞功能变化的生物大分子。173接收信息→受体信号分子→配体(ligand)

FromBruceAlbertsetal.,MolecularBiologyofTheCell(5thedition)1.Anion-channel-coupledopensorclosesinresponsetobindingofitsextracellularsignalmolecule.Thesechannelsarealsocalled‘transmitter-gatedionchannelsCellsurfacereceptorsfallintothreebasicclasses

FromBruceAlbertsetal.,MolecularBiologyofTheCell(5thedition)G-protein-coupledreceptor:WhenaG-coupledreceptorbindsitsextracellularsignalmolecule,thesignalispassedfirsttoaGTP-bindingprotein(Gprotein)thatisassociatedwiththereceptor.TheactivatedGproteinthenleavesthereceptorandturnonatargetenzyme(orionchannel)inthemembrane

FromBruceAlbertsetal.,MolecularBiologyofTheCell(5thedition)3.Enzyme-coupledreceptors:Anenzyme-linkedreceptorbindsitsextracellularsignalmolecule,switchingonanenzymeactivity,eitherattheotherendoftheenzymeorotherassociatedenzyme177Cell-surfaceReceptors（受体本身就是离子通道的一部分）（GTP结合的调节蛋白偶联）（受体本身就是酶，又称催化受体）178IntracellularReceptorsTwo

motifs,twobindingsites179180GenerationofconditionalknockoutmiceER-Cre/tamoxifen181TransductionSignalmoleculesrecognition(receptor)Reaction1825.1.3

SignalTransduction信号转导：细胞表面受体通过一定机制将外部信号转为内部信号。

Manyintracellularsignalingproteinsactasmolecularswitches:Signalingbyphosphorylation:signalingproteinsareactivatedbytheadditionofaphosphategroupbyproteinkinase,andinactivatedbyremovalofthephosphatebyproteinphosphatase.Proteinkinasephosphatesserine/threonine(calledser/thrkinase)ortyrosine(calledtyrosinekinase)(B)SignalingbyGTP-bindingprotein:aGTP-bindingsignalingproteinisinducedtoexchangeitsboundGDTforGTP(i.e.addsaphosphatetotheprotein).ThehydrolysisoftheboundGTPtoGDPThenswitchestheproteinoffProteinkinase2isactivatedbyproteinkinase1.Onceactivated,proteinkinase2phosphorylatesproteinkinase3,activatingtheenzyme.Proteinkinase3thenphosphorylatesatranscriptionfactor,increasingitsaffinityforasiteontheDNA.BindingofatranscriptionfactortotheDNAaffectsthetranscriptionofthegeneinquestion.Eachoftheseactivationstepsinthepathwayisreversedbyaphosphatase.FromGeraldKarp,CellandMolecularBiology-conceptsandexperiments(6thedition)SignaltransductionpathwayconsistingofproteinkinasesandproteinphosphatasesFromBruceAlbertsetal.,MolecularBiologyofTheCell(5thedition)GTPase-activatingproteins(GAPs)inactivatetheproteinbystimulatingittohydrolyzeitsboundGTPtoGDP.Guaninenucleotideexchangefactors(GEFs)activatetheinactiveproteinbystimulatingittoreleaseitsGDP;NotethattheconcentrationofGTPincytosolis10timesgreaterthantheconcentrationofGDP,theproteinrapidlybindsGTPonceitejectsGDPandistherebyactivatedTheregulationofamonomericGTPases.186SecondMessenger第一信使：细胞外部信号。第二信使：由细胞表面受体转换而来的细胞内部信号。第一信使同其膜受体结合后最早在胞膜内侧或胞浆中出现的仅在细胞内部起作用的信号分子；能启动或调解细胞内稍晚出现的细胞应答。187SignalTransductionataGlance188TypesofReceptor-EffectorLinkage189TransductionSignalmoleculesrecognition(receptor)ReactionExtracellularsignalscanactslowlyorrapidlyFromEssentialCellBiology(©GarlandScience2010)191SignalCascadeTwodifferenttypesofsignaltransductionpathways:oneinwhichasignalingpathwayisactivatedbyadiffusiblesecondmessengerandanotherinwhichasignalingpathwayisactivatedbyrecruitmentofproteinstotheplasmamembrane.Mostsignaltransductionpathwaysinvolveacombinationofthesemechanisms.signalingpathwaysarenottypicallylineartracksasdepictedhere,butarebranchedandinterconnectedtoformacomplexweb.FromGeraldKarp,CellandMolecularBiology-conceptsandexperiments(6thedition)TheBasicCellSignalingProcess1935.2

GProtein-coupledReceptor

2006NatureReviewDrugDiscoveryGPCRTrulyuniquedrugs：~1,300Smallmolecules：~1,200Majordrugtargets：~300Drugtargetsinhuman：2664majortypesofdrugtargets：GPCRs，nuclearreceptors，ligand-gatedorvoltage-gatedionchannelsGPCR：>60GPCR－最具潜力的药靶2006全球销量前10名的药物排行药名2006年销售额(USD

百万)公司疾病主要靶点批准上市日期1Lipitor14,385Pfizer高血脂HMG-CoA还原酶Dec-962Advair,Seretide6,129GSK哮喘糖皮质激素受体/肾上腺素受体Aug-003Plavix,Iscover6,057Bristol-MyersSquibb/Sanofi-Aventis血栓P2Y12受体Nov-974Nexium5,182AstraZeneca肠胃溃疡质子泵抑制剂Mar-005Norvasc4,866Pfizer高血压钙离子通道Jul-926Remicade4,428Johnson&Johnson,Schering-Plough,MitsubishiTanabePharma自免疫性肠炎及类风湿性关节炎TNFα抗体Aug-987Enbrel4,379Wyeth类风湿性关节炎TNFαNov-988Zyprexa4,364EliLillyandCompany精神病多种GPCR,包括D1,D2,5HT2A,5HT2C等Sep-969Diovan4,223Novartis高血压血管紧张素受体AT1RDec-9610Risperdal4,183Johnson&Johnson精神病多种GPCR,包括5HT1A,5HT1,5HT2A,5HT2C，5HT7，D1,D2,等Dec-93196

G-蛋白:◆组成:一般由三个亚基组成,分别叫α、β、γ,β、γ两亚基通常紧密结合在一起,只有在蛋白变性时才分开