DB36-T 1902-2023 实验动物 嗜肺巴斯德杆菌荧光定量PCR检测方法

65.020.30CCS

B

44

DB36江 西 省 地 方 标 准DB

36/T

实验动物

嗜肺巴斯德杆菌荧光定量

PCR检测方法Laboratory

animal—

quantitative

method

for

ofpasturella

江西省市场监督管理局 发

布DB36/T

1902—2023前 言

..............................................................................

II1

范围

..............................................................................

12

规范性引用文件

....................................................................

13

术语和定义

........................................................................

14

缩略语

............................................................................

25

设备和材料

........................................................................

26

试剂

..............................................................................

27

检测流程

..........................................................................

28

结果判定

..........................................................................

4附录

溶液配制方法....................................................

5附录

荧光定量

的引物与探针........................................

7附录

荧光定量

检测方法............................................

8参

考

文

献

..........................................................................

9IDB36/T

1902—2023 本文件按照GB/T

1.1-2020《标准化工作导则

第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江西省卫生健康委员会提出并归口。本文件起草单位：江西省职业病防治研究院。本文件主要起草人：熊莉娟、周银平、张陆兵、肖芳平、万筱荣、贾菠、刘欢、罗勇兵、李建昌、周剑。IIDB36/T

1902—2023实验动物

PCR

检测方法1 范围本文件规定了实验动物嗜肺巴斯德杆菌荧光定量PCR剂、检测流程和结果判定等内容。的检测参照执行。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文本文件。GB/T

分析实验室用水规格和试验方法GB

实验动物

微生物、寄生虫学等级及监测GB/T

实验动物

嗜肺巴斯德杆菌检测方法GB

实验室

生物安全通用要求GB/T

转基因产品检测

实验室技术要求GB/T

实验动物

3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1嗜肺巴斯德杆菌

pneumotropica是

Jawetz

型和

型。3.2荧光定量聚合酶链式反应

real-time

quantitative

polymerase

chain

在常规

PCR

的基础上，在反应体系中加入一对特异性引物和一条特异性探针，探针两端分别标记PCR扩增时，Taq

酶的

5'→3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，淬灭作用消失，荧光信号产生并被检测仪器接受。随着

PCR

反应的循环进行，PCR

产物与荧光信号的增长呈对应关系，通过检测荧光信号对核酸模板进行检测。3.31DB36/T

1902—2023Ct

值

cycle

value荧光定量PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:

脱氧核糖核酸(

acid)PBS:

磷酸盐缓冲液(

buffered

saline)Taq

Taq

DNA聚合酶(Taq

DNA

)5 设备和材料5.1 设备

PCR

4

℃、

℃、

℃

μL、2

、20

μL~200

、100

000

）。5.2 材料灭菌离心管（

、1.5

mL、5

mL、15

mL）、灭菌吸头、灭菌PCR扩增反应管、剪刀、镊子和灭菌棉拭子等。6 试剂6.1

本文件所用试剂均为分析纯或生化试剂，试验用水符合

6682

的要求。6.2

灭菌

PBS

A

中

A.1）。6.3

乙酸钾溶液（配制方法见附录

A

中

）。6.4

裂解液（配制方法见附录

A

中

A.6）。6.5

蛋白酶

K

溶液（配制方法见附录

A

中

A.7）。6.6

Tris-饱和酚（pH>7.8）。6.7

氯仿/异戊醇（24∶1

24∶1

的比例配制。6.8

TE

缓冲液（配制方法见附录

A

中

A.8）。6.9

70%

A

中

A.9）。6.10

无水乙醇：

℃预冷。6.11

细菌基因组

DNA

抽提试剂盒：商品化试剂盒。6.12

荧光定量

PCR

试剂盒：商品化荧光定量

PCR

试剂盒。6.13

引物和探针序列（见附录

B

中

B.1）。6.14

阳性对照（嗜肺巴斯德杆菌

DNA）。6.15

阴性对照（不含嗜肺巴斯德杆菌的

DNA）。7 检测流程7.1 生物安全要求2DB36/T

1902—2023实验操作及处理按照GB

19489GB/T

19495.2中的要求执行。采样参照GB

14922中的要求执行。7.2 样品采集7.2.1 脏器组织按照GB/T

取待检样本2.0

g于无菌15

离心管中，密封、编号，待检。7.2.2 嗜肺巴斯德杆菌分离培养物可以直接使用GB/T

14926.12分离培养法中嗜肺巴斯德杆菌血琼脂培养基的培养物作为检测样本，用接种环刮取2个菌落装于无菌5

离心管中，密封、编号，待检。7.2.3 实验动物垫料取1.0

g实验动物垫料置于

离心管中，密封、编号，待检。7.2.4 实验动物设施设备用灭菌棉拭子拭取实验动物设施设备出风口初效滤膜表面沉积物，将拭子置入灭菌15

离心管中，密封、编号，待检。7.3 样品处理7.3.1 脏器组织在生物安全柜内用灭菌剪刀将脏器组织剪碎后，加入4

灭菌PBS，使用电动匀浆器充分匀浆2，然后将组织悬液在4

℃，3

000

g离心10

，取上清液转入另一无菌5

离心管中，编号备用。7.3.2 嗜肺巴斯德杆菌分离培养物向装有样品的离心管中加入4

灭菌PBS，振荡至菌体彻底悬浮，编号备用。7.3.3实验动物垫料和实验动物设施设备向装有样品的离心管中加入4

mL灭菌PBS(垫料或棉拭子需全部浸泡于液体中)。密封后浸泡，充分混匀，静置30

，取上清液转入另一无菌5

离心管中，编号备用。7.4 样本存放采集或处理的样本在2

℃～8

℃条件下保存应不超过24

h

℃冰箱保存，避免反复冻融。7.5 样本

提取7.5.1样本

DNA

在实验室中提取步骤如下：a) 取

350

已处理好的样品加入

的蛋白酶

K

℃水浴

2

h

或

37

℃消化过夜；b) 向消化后的裂解液中加入

70

乙酸钾溶液，混匀冰浴

，4

℃，12000

g

离心

，取上清液转移至新的

1.5

离心管；3DB36/T

1902—2023c) 加入等体积的

Tris-饱和酚，缓慢颠倒混匀

10

，4

℃，12000

g

离心

10

；d)

倍体积的

Tris-饱和酚和

0.5

倍体积的氯仿/24∶1），12000

g

离心

10

；e) 取上清液至新的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），12000

g

离心

10

；f)取上清液至新的离心管中，加入

2

倍体积

℃预冷的无水乙醇，轻轻摇晃至絮状沉淀析出，12000

g

离心

10

，弃上清；g)加入

70%乙醇冲洗沉淀表面及管壁，12000

g

离心

3

，吸去上清液；h) 室温下放置

2

100

TE

缓冲液溶解

DNA

沉淀，即可用于检测或

℃保存备用。7.5.2

样本

DNA

也可采用同等效果的商品化试剂盒提取，提取按照试剂盒的使用说明书操作。7.6荧光定量

荧光定量PCR检测方法应符合附录C。8 结果判定8.1 质控标准阳性对照

Ct

值≤35，且出现对数扩增曲线。阴性对照及空白对照无

Ct

值，且无对数扩增曲线。二者均成立才可判定试验成立。8.2 检测结果判定符合Ct值≤35Ct值且无对数35＜Ct值≤40Ct值仍然数增长期，则判定阳性；否则判定阴性。4DB36/T

1902—2023AA附 录 A（规范性附录）溶液配制方法A.1 灭菌PBS溶液NaCl）8.00

g）0.20

gPO）0.24

gNaHPO·O）3.65

g

800

至

7.2～7.4

1

。在

103.4

（

条件下灭菌

20

，冷却备用。A.20.5

mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH

8.0）称取18.6

g乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na），加入80

水中，充分搅拌，用氢氧化钠（）颗粒调至，加水定容至100

。在103.4

（

℃)条件下灭菌20

。A.3 1

mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(pH

8.0)称取

121.1

g

Tris)溶解于

800

HCl

至

8.0,加水定容至1

000

。在

103.4

（

℃）条件下灭菌

A.45

mol/L氯化钠溶液称取

29.22

g

NaCl

100

103.4

℃）条件下灭菌

20

。A.5 裂解液在约

mL

水中，依次加入

10

mL

0.5

乙二铵四乙酸二钠溶液、20

1

mol/L

三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液、

5

氯化钠溶液。另称取

10g

十二烷基硫酸钠（CHOSNa，SDS），混合后加热至完全溶解后冷却至室温，用水定容至

1

000

，室温保存备用。A.6蛋白酶K溶液将

20

蛋白酶

K（＞

10

。于

℃保存备用。A.7乙酸钾溶液（pH

4.8）称取

29.43

g

溶于

HAc

至

4.8,加水定容至

100

。在103.4kPa

蒸汽压（121℃）条件下灭菌

20

。5DB36/T

1902—2023A.870%乙醇取无水乙醇，加入蒸馏水，充分混匀后备用。A.9 TE缓冲液（pH

在约

水中，依次加入

10

1

三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液和

2

0.5

乙二铵HCl）调

至

1000mL。在

蒸汽压（121℃）条件下灭菌

。6DB36/T

1902—2023BB附 录 B（规范性附录）荧光定量

B.1 引物和探针序列正向引物 5'-CGGGTTGTAAAGTTCTTTCGGT-3'反向引物探针

Jawetz 探针

注：探针可选用具有与和BHQ-1荧光基团相同效果的其他荧光报告基团和荧光淬灭基团。7反应组分用量终浓度Probe

qPCR

Mix（210μL1×正向引物（10μmol/L）0.8μL400nmol/L反向引物（10μmol/L）0.8μL400nmol/L探针（10μmol/L）0.6μL300nmol/LDNA

模板1μL-灭菌去离子水6.8μL-总体积20μL-注：反应体系可根据荧光定量PCR检测试剂盒进行相应调整。步骤温度时间采集荧光信号循环数预变性95℃-1变性95℃15s-40退火,延伸57℃60s是注：反应参数可根据荧光定量PCR检测试剂盒进行相应调整。DB36/T

1902—2023CC附 录 C（规范性附录）荧光定量

C.1 荧光定量

PCR

反应体系DNA

作阳性对照、不含嗜肺巴斯德杆菌的

DNA

作阴性对照、以灭菌去离子水作空白对照。表

C.1

反应体系C.2 荧光定量

PCR

反应条件表

C.2 荧光定量

反应条件8DB36/T

1902—2023参

考 文 献[1]

Stojek

NM,

Dutkiewicz

J.

Studies

on

the

occurrence

of

Gram-negative

bacteria

in

ticks:

Ixodesricinus

as

a

potential

vector

of

Pasteurella.

Ann

Agric

Environ

Med.

2004,11(2):319-22.[2]

胡小琦,彭焕文,田巍威.人感染嗜肺巴斯德杆菌病例报告[J].寄生虫病与感染性疾病,2017,15(01):52.[3]

Benga

L,Benten

of

a

PCR

based

on

16S-23S internaltranscribed spacer detection of rodentPasteurellaceae[J].J

Methods,2013,95(2):256-261.[4]

Gautier

AL,

Dubois

D,