SNT 2518-2010贝类食品中食源性病毒检测方法纳米磁珠-基因芯片法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准贝类食品中食源性病毒检测方法纳米磁珠-基因芯片法2010-03-02发布国家质量监督检验检疫总局ISN/T2518—2010本标准的附录A为规范性附录，附录B和附录C为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、博奥生物有限公司暨生物芯片北京国家工程研究中心、北京金纳信生物有限公司、天津生物芯片有限公司。本标准系首次发布出入境检验检疫行业标准。1SN/T2518—2010贝类食品中食源性病毒检测方法纳米磁珠-基因芯片法1范围本标准规定了贝类中甲肝病毒、GI型和GⅡ型诺如病毒、A群轮状病毒和星状病毒的纳米磁珠-基因芯片检测方法。中毒样品中上述5种病毒的检测可参照使用。2规范性引用文件GB19489实验室生物安全通用要求3.1术语和定义基因芯片genechip生物芯片技术是通过缩微技术，根据分子间特异性地相互作用原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对基因及其他生物组分的准确、甲肝病毒属中只有人甲型肝炎病毒一个成员，简称甲肝病毒。甲肝病毒粒子的直径约27nm,诺如病毒属于人类杯状病毒科，是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。诺如病毒直径约为polyA尾。诺如病毒共可分为5个型，其中感染人的主要是GI型和GⅡ型。2股正链RNA,长6.8kb,3’端有polyA尾。3.2缩略语bpbasepairDEPCdiethylpyrocarbonatePEGpolyethyleneglycol聚乙二醇。检测5种食源性致病病毒。5试剂GB/T6682中一级水标准。5.2匀浆缓冲液1:见附录A.1.1。5.3匀浆缓冲液2:见附录A.1.2。5.6引物和探针：5种病毒基因芯片检测所用引物核酸序列见表1,探针核酸序列见表2;根据表1的表15种病毒RT-PCR引物名称和序列病毒名称引物(5’-3’)产物大小/bp甲肝病毒TGTGCTATGGTTCCTGGTGACCCAATCGAATCTGAAGCAT3表1(续)病毒名称引物(5³-3’)产物大小/bp星状病毒HAsV-FCATTGTTTGTTGTCATACTAACHAsV-RACATGTGCTGCTGTTACTAT诺如病毒GI型GI-SKFCTGCCCGAATTYGTAAATGAGI-SKRCCAACCCARCCATTRTACA诺如病毒GⅡ型GⅡ-SKFCARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAGGⅡ-SKRCCRCCNGCATRHCCRTTRTACATA群轮状病毒RotavirnsAFGGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGGRotavirusARGATCCTGTTGGCCATCC注：诺如病毒I型、诺如病毒Ⅱ型、星状病毒、甲肝病毒负链引物的5’端用TAMRA标记；轮状病毒正链引物的5’端用TAMRA标记。表25种病毒特异性探针核苷酸序列病毒名称探针名称探针序列甲肝病毒HAVNH2-TITTTTTTTTTTTTTCATTGGAACAGGAACTTCAGCG星状病毒HaslNH2-TTTTTTTTTTTTTTTGAGATCCGTGATGTTAATGGHas2NH2-TTTTTTTTTTTTTTTGAGATCCGTGATGCTAATGGHas3NH2-TTTTTTTTTTTTTTTGAGATACGTGATGCTAATGGNH2-TTTTTTTTTTTTTTTGTAAATGATGATGGCGTCTAANH2-TTTTTTTTTTTTTTTAGGGCGATCGCAATCTGGCTRotNH2-TTTTTTTTTTTTTTTGTGGTATATTCAATACCATAC芯片杂交阳性对照NH2-TTTTTTTTTTTTTTTCTCATGCCCATGCCGATGC5.11RNA逆转录试剂盒：SuperScriptⅢFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR(Invitrogen5.16溴化乙锭溶液(10pg/μL):见附录A.1.5.17含0.5pg/mL溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶：见附录A.1.7。5.18磷酸盐缓冲液(PhosphatebufferedsalinePBS):见附录A.1.8。1)给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用等效产品。45.20洗液I:2×SSC,0.2%SDS。5.23三氯甲烷。6仪器与设备6.106.116.126.136.156.186.216.22恒温空气浴振荡器：37℃±1℃,200r/min;42℃±1℃,90r/min。电泳仪。高速冷冻离心机：4℃,10000g。7实验室要求实验室设施应达到SN/T1193实验室技术要求。8检测流程基因芯片检验流程见图1。5SN/T2518—2010 图1基因芯片检验流程图9制取样方法9.1样品的运输与保存储存和运输过程中保持样品温度在0℃~5℃。实验室接到样品后应尽快进行检测。如暂时不能9.2取样首先用灭菌蒸馏水将贝壳表面的污泥清洗干净，打开贝壳后，倒掉腔内的液体，使用灭菌消毒的剪刀和镊子取贝类消化腺组织5g。GI型、GⅡ型和甲肝病毒RNA时，加入匀浆缓冲液2。充分匀浆150s,37℃温育30min或室温下200r/min,振荡39min;4℃,106000g,离心1qmin。注：轮状病毒和星状病毒RNA的提取可以采用本方法10.1.1取9.3所得的上清液1m上转移到2mL离心管中，加入0.14mL16%PEG8000溶液(PEG终浓度为2%),颠倒5次混匀。冰上放置至少1h,4℃,10l₀0og,离心10min,弃上清液，保留沉淀。下放置5min～15min,每隔1min～2min,颠倒混匀几次。10.1.4将离心管放置于磁力架上，吸附纳米磁珠1min～5min,弃上清液。病毒RNA,立即置于冰上冷却1min,4℃,10000g离心5min,将含有病毒RNA的上清液转移至新的无RNase的1.5mL离心管中，-80℃冰箱保存备用。该方法提取的病毒RNA无需进一步纯化可以直接进行逆转录。10.2.1将9.3中的上清液全部转移到无RNase的50mL离心管中(可以分装于2个50mL离心管),加入等体积16%的PEG8000溶液(PEG终浓度为8%),上下颠倒离心管以充分混匀。将离心管置于6旋混匀1min,室温放置5min。10.2.44℃,10000g离心5min,小心吸取上清液至一无RNase的10mL离心管中。加入0.5倍体注：按照Dynabeads①Oligo(dT)zs使用说明进行RNA纯化。10.3.1将10.2.6所得的RNA溶液置于65℃温育2min,立即置于冰上。10.3.2温育RNA溶液同时，转移50μL已充分重悬的DynabeadsOligo(dT)zs至1.5mL无RNase10.3.5将10.3.1所得RNA溶液全部转移至10.3.4的离心管中，轻柔混合，使磁珠与RNA溶液充分混匀，室温放置3min～5min。将离心管置于磁力架上1mi清澄清后立即将上清液(洗脱下来的RNA)转移至一干净的无RNase的1.5mL离心管中。制备好的11.1逆转录反应体系和反应条件将贝类样品中提取的5种病毒RNA混合均匀后同时进行针对5种病毒的逆转录。逆转录反应体系和反应条件见表3。每个反应体系设置两个平行。反应体系中各试剂的量可根据具体情况进行适当表3逆转录反应体系和反应条件反应液组成加样量/pL逆转录混合引物(10μmol/L)1随机引物2dNTP(10mmol/L)16混匀，65℃加热5min,冰浴5min缓冲液(10×)247SN/T2518—2010反应液组成加样量/μL2RNaseOUT(40U/μL)1反转录酶111.2多重PCR反应体系11.2.1甲肝病毒与星状病毒多重PCR反应体系见表4。表4甲肝病毒与星状病毒多重PCR反应体系加样量/μLPCR缓冲液(10×)22HAV-F(未标记5pmol/L)和HAsV-F(未标记5μmol/L)各0.23LA-TagE(5U/μL)水11.2.2诺如病毒GI型、GⅡ型和轮状病毒多重PCR反应体系见表5。加样量/μLPCR缓冲液(10×)22dNTP(10mmol/L)GI-SKF(未标记5μmol/L),GⅡ-SKF(未标记5μmol/L)和RotavirusAF(荧光标记40μmol/L)RotavirusAF0.5,其余各0.2GI-SKR(荧光标记40μmol/L),GⅡ-SKR(荧光标记40μmol/L)和RotavirusA R(未标记5μmol/L)RotavirusAR0.2,其余各0.53LA-TagE(5U/μL)水11.2.3PCR反应参数如下，11.2.4PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测(根据需要进行)后进行芯片杂交。将适量50×TAE稀释成1×TAE溶液，配制溴化乙锭含量为0.5pg/mL的1.5%琼脂糖凝胶。取15μLPCR产物，加1.5μL上样缓冲液点样，在琼脂糖凝胶的两边或中间位置点样83V/cm～5V/cm,当电泳指示剂溴酚蓝移动到凝胶边缘时关闭电源，电泳结果检测采用凝胶成像12.1芯片杂交体系将11.2.1和11.2.2所得PCR产物进行等体积混合。按表6配制杂交液，充分混匀，3000g离心加样量/pL终浓度甲酰胺50×Denhardt's-总体积—-12.2芯片杂交12.2.1PCR产物变性将配制好的12.1的杂交体系在95℃,变性了min,立即置于冰上，冰浴1min。12.2.2杂交12.2.3洗片洗4min;最后用42℃预热好清水清洗一次，清洗后的芯片放在50mL锥形离心管中(标签纸端朝下)12.2.4芯片扫描及结果判读13结果的判定标准13.1信号值≥背景信号平均值+4×背景信号值标准差，且信号值≥阴性对照信号平均值+4×阴性13.2背景信号平均值+2×背景信号值标准差<信号值<背景信号平均值+4×背景信号值标准差，9且阴性对照信号平均值+2×阴性对照信号值标准差<信号值<阴性对照信号平均值+4×阴性对照信号值标准差，重新进行杂交，杂交结果与前一次一致，报告阳性；杂交结果与阴性结果一致，报告阴性13.3信号值≤背景信号平均值+2×背景信号值标准差，且信号值≤阴性对照信号平均值+2×阴性对照信号值标准差，探针杂交结果为阴性。14.1若芯片检测结果为阴性，则结果报告为未检出相应的病毒。14.2若芯片检测结果为阳性，则结果报告为检出相应的病毒。15安全措施为了保护试验室人员的安全，所有培养物和废弃物应小心处置。并按GB19489中有关规定执行。SN/T2518—2010(规范性附录)溶液的配制与容器的处理A.1溶液的配制氯化钠去离子水5mol/L氢氧化钠溶液800mL调pH9.6加去离子水至1000mL,加DEPC至终浓度为0.05%,37℃温育过夜；121℃,15min灭菌。甘氨酸氯化钠去离子水5mol/L氢氧化钠溶液加去离子水至1000mL,加800mLDEPC至终浓度为0.05%,37℃温育过夜；121℃,15min灭菌。加双蒸水至500mL,加DEPC至终浓度为0.05%,37℃温育过夜；121℃,15min灭菌。去离子水1000mL,加0.05%DEPC,37℃温育过夜，121℃,15min灭菌；或直接购买无RNase超羟基甲基氨基甲烷(Tris)242冰乙酸57.1mL加双蒸水至1000mL,121℃,15min灭菌备用。A.1.6溴化乙锭(EB)溶液溴化乙锭10mg灭菌双蒸水20mL将溴化乙锭充分溶解于双蒸水中，分装于1.5mL离心管中，避光保存。A.1.71.5%琼脂糖凝胶的配制混合后加热完全熔化，待冷至50℃~60℃时，加溴化乙锭(EB)溶液2μL,轻轻晃动摇匀，避免产氯化钠7.650g无水磷酸氢二钠0.724