国境口岸流感、副流感、呼吸道合胞病毒的酶联免疫吸附试验检测方法

国境口岸流感、副流感、呼吸道合胞病毒的酶联免疫吸附试验检测方法本标准规定了国境口岸流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒抗体(IgG/lgM)的检测对象及方法。本标准适用于国境口岸入出境人员，可疑流感病毒或呼吸道合胞病毒感染者等人群的流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒抗体(IgG/lgM)检测的酶联免疫吸附试验，其他人群的抗体检测也可参照。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单》适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定文下列术语和定义适用于本文件。甲型流感病毒是八节段RNA病毒，属正粘病毒科，感染人可引起流感。乙型流感病毒是八节段RNA病毒，属正粘病毒科，感染人可引起流感。副流感病毒属副粘病毒科，基因组为单股负链RNA,感染人可引起善通感旨、气管炎和肺炎。呼吸道合胞病毒respiratorysyncytialvirus.RSV呼吸道合胞病毒属副粘病毒科，基因组为单股负链RNA.是世界范围内婴幼儿病毒性下呼吸道感染最重要的病毒病原。酶联免疫吸附试验enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA本标准采用间接法，其原理是在固相包被板上包被抗原，用特异性抗人IgG/IgM的酶标二抗检测结合到包被板上的样品中的特异性IgG/lgM抗体。底物反应后，所显示的颜色强度与样品中1gG/lgM的含量成正比，IgG/lgM的含量可以通过标准曲线获得。4(资料性附录)ELISA检测过程中技术要求A.1试剂的准备A.1.1放冰箱内保存的试剂，在使用前应先恢复到室温，一般在室湿平衡30min。A.1.2仔组检查试剂各组分是否变质。A.1.3浓缩的洗涤液需用新鲜的蒸馏水或去离子水按要求稀释，使用不合格的蒸馏水可能使空白值增高。A.1.4保存试剂的冰箱应定期检查其储存温度(正常为2℃~8℃),并尽量避免冰箱频繁开关。A.2标本的采取与保存A.2.1尽量避免溶血。A.2.2血清标本的制备：非抗凝自然凝固1h～2h,1500g～2000g离心5min,A.2.3标本宜在新鲜时检测。若5d内检测，可使用冰箱2℃~8℃保存，超过1周时间测定，应于-20℃低温冻存。A.3.1严格按照说明书要求，按规定的量和顺序进行。A.3.2使用的微量加样器应注意保养并定期校正。A.3.3加样前应使溶液充分混匀，并将液体加在孔底，避免加在反应孔壁上部，注意不可出现气泡。A.3.4加样时避免样本溅出，如有样本溅出反应孔外时，应用吸水纸轻轻拭干并消毒处理，同时做相应记录。A.3.5加样后微孔板应及时温育，尽量缩短加样后温育前的等待时间。A.4.1严格按照说明书要求，按规定的温度和温育时间进行，并保证设定的温度达到要求以及足够的反应时间。A.4.2保温容器最好是恒温培养箱，可使温度很快达到平衡。A.4.3微孔板不可重叠放置，以免传热不均匀。A.4.4为道免孔内液体蒸发，可用封板胶将ELISA板面密封后进行温育。A.4.5温育时尽量少开启箱门以保持箱内温度稳定。A.5.1微孔板每遍洗板次数一般为3次，每次设计浸泡时间一般为30s~60s。A.5.2洗板时需保证微孔板平故，将洗涤液注满各反应孔，但尽量避免漏液溢液现象。(资料性附录)ELISA检测甲型流感病毒抗体(IgG/IgM)B.1在包被有甲型流感病毒抗原的反应孔中加入100pl.标准品和已经稀释并处理的待检血清样品，同时加入阴性对照、阳性对照，封板后37℃孵育60min。B.2奔去反应孔中的液体，用300pl.洗涤液洗板3次，在吸水纸上拍干。B.3在反应孔中加入100pl.酶标抗人IgG/lgM抗体，封板后37℃解育30min。B.4奔去反应孔中的液体，用300pl.洗涤液洗板3次，在吸水纸上拍干。B.5向每孔中加入100pl.底物液，37℃下避光解育20min。B.6向每反应孔中加入100pl.终止液，波体颜色由蓝色变为黄色。B.7加终止液后60min内在450nm处测定OD值。7C.1在包被有乙型流感病毒抗原的反应孔中加入100μl.标准品和已经稀释并处理的待检血清样品，C.3在反应孔中加入100pl.酶标抗人IgG/lgM抗体，封板后37℃孵育30min。C.4弃去反应孔中的减体，用300gl.C.5向每反应孔中加入100pl.底物液.37℃下避光孵育20min。C.7加终止液后60min内在450nm处测定OD值。D.1在包被有副流感病毒抗原的反应孔中加入100pL标准品和已经稀释并处理的待检血清样品，同D.3在反应孔中加入100yl.醇标抗人1gG/lgM抗体，封板后37℃孵育30min。D.7加终止液后60min内在450mm处测定OD值。(资料性附录)ELISA检测呼吸道合胞病毒抗体(IgG/lgM)E.1在包被有呼吸道合胞病毒抗原的反应孔中加入100μL标准品和已经稀释并处理的待检血清样品，同时加入阴性对照、阳性对照，封板后37℃孵育60min。E.2奔去反应孔中的液体，用300yl.洗涤液洗板3次，在吸水纸上拍干。E.3在反应孔中加入100pl.酶标抗人IgG/lgM抗体，封板后37℃孵育30min。E.4弃去反应孔中的减体，用300gl.洗涤液洗板