分子生态学实验步骤与原理总结

./基因组DNA提取XX博彩生物科技XX：3SDNAIsolationKitforEnvironmentalSamplesV2.23S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒V2.2DNA抽提方法使用仪器：灭菌锅,无菌操作台,移液枪,漩涡振荡器,台式离心机,水浴锅,分光光度计或者琼脂糖电泳槽灭菌物品：枪头,1.5ml,2ml离心管一、污泥样品前处理样品在处理前首先要混匀,使其中的悬浮物质分布均匀。取约l0mL污水样品,加入灭菌离心管,400Orpm、离心20min,收集沉淀,加约4倍体积的TENPbuffer<50mMTirs,20mMEDTA,100mMNaCl,0.01g/mLPVP,pHl0>,加玻璃珠<d:lmm>充分匀化<解絮凝>。4000rpm,离心20min,弃上清<重复两次,直至上清液较澄清>。加约4倍体积的PBSbuffer<8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4溶于lL水、pH7.4>,旋涡混匀,4000rpm,离心20min,收集沉淀<重复两次>二、基因组DNA提取样品准备：100mg样品用200ulSolutionSUS将样品浸泡、悬浮,使样品软化分散开。加入400ulSolutionLYS,300mg石英砂,盖上离心管盖,在漩涡振荡器上高速剧烈振荡,10-30min或更长时间。用台式离心机,12000rpm,室温离心5min。将上清液完全转移到无菌1.5ml离心管中,加入120ulSolutionBID,盖上离心管盖,上下颠倒混匀。将溶液用1mlTIP全部转移到3S柱内,柱子放入2ml离心管中,不盖离心管盖,室温放置2min以上。盖上离心管盖,12000rpm,室温离心1min。取下3S柱,弃去离心管中的废液。将柱子放回同一根离心管中,加入600ulWashSolution,10000rpm,室温离心1min。重复6一次。取下3S柱,弃去离心管中的全部废液。将柱子放回同一根离心管中,10000rpm,室温离心2min,以除去残留的WashSolution。洗脱：在柱子中央加入100ulTE,将柱子放入新的干净1.5ml离心管中,室温放置2min。12000rpm,室温离心1min。收集管中的液体即为基因组DNA。根据用途,样品可以4℃或-20℃保存。为提高洗脱效率,可以将TE预热到37-55℃。如果样品中基因组DNA含量很低,用30ulTE洗脱可以提高洗脱液的样品浓度,但产率有所下降。重复该洗脱步骤一次,可以提高产率20%左右。三、提取DNA的质量检测<1>DNA纯度和浓度检测用紫外分光光度计测定DNA样品在波长230,260,280nm处的吸光光度值。DNA纯度的定性检测:通过A260/A280与A260/A230的比值可以检测所提DNA是否纯。通常纯DNA样品A26O/A280≈1.8,A260/A230>2。若A260/A280>l.9,可能有RNA污染；若A260/A280<l.6,可能有蛋白质污染；若A260/A230≤2,可能存在酚类等小分子杂质。DNA浓度的计算：浓度<µg/mL>=A260*50*稀释倍数；注：1OD值相当于50µg/mL双螺旋DNA。<2>DNA琼脂糖凝胶电泳检测将所得DNA样品进行1%琼脂糖凝胶电泳,电压100V,电泳lh,EB染色后,用紫外凝胶成像系统拍照。.〔二〕PCR扩增一、PCR扩增引物采用两组对大多数细菌和古细菌的16SrRNA基因V3区具有特异性的引物对：组合<F34,GC和RS:8>。引物组合的正向引物5’端中有一个富含GC的40bp的GC发卡结构。它们各自序列分别为:F341:<5’一eCTACGooAooeAGeAo一3’>,Rsls:<5’<5’一CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG一3组合扩增产物片段长度约为220bp。二、PCR扩增反应体系PCR扩增反应体系,与表3一3相同。加样后立即进行PCR扩增。三、PCR扩增程序PCR扩增程序,与表3一4相同。四、PCR产物电泳检测取5闪PCR产物进行电泳,胶浓度为2.0%,在电压100v条件下电泳lh后检测,经EB染色后用凝胶成像系统观察,保存凝胶图谱。电泳所用Marker为天根生化科技<>XX生产的nNAM叭e:nLZo00。.〔三〕变性梯度凝胶电泳<DGGE>分析预电泳的作用1.使体系达到反应的条件2.清除过多的变性剂和APS等,保持胶的稳定状态。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析。其装载的样品量大,回收DNA纯度高。长度仅相差0.2%<即500bp中的1bp>的核苷酸分子即能分离。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体,在催化剂TEMED<N,N,N,N'一四甲基乙二胺>和过硫酸铵的作用下,丙烯酰胺聚合形成长链,聚丙烯酰胺链在交联剂,N,N'一亚甲双丙烯酰胺参与下,聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶。一、试剂配制<l>50*TAE缓冲液:242gTris碱,57.1mL冰醋酸,100mL0.5MEDTA<pH8.0>,加水至1L。混合均匀后高压灭菌20-30min,室温保存。<2>40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺<37.5：1>：38.93g丙烯酰胺,1.07g双丙烯酰胺,加水至100mL。<3>O%变性溶液：20mL40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺,2mL50*TAE缓冲液,加水至100mL,再分别加入80µLAPS和5µLTEMED。4℃<4>100%变性溶液：2OmL40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺,2mL50*TAE缓冲液,40mL甲酰胺,42g尿素,加水至100mL,再分别加入80µLAPS和5µLTEMED。4<5>10%过硫酞胺<APS>：lg过硫酰胺加水至10mL。现用现配。<6>对于变性浓度低于100%的溶液,用0%和100%的变性溶液混合配制而成,尿素和甲酰胺含量如下所示：不同浓度的变性溶液尿素、甲酰胺含量成分10%20%30%40%50%60%70%80%90%尿素〔g〕4.28.412.616.82125.229.433.637.8甲酰胺〔ml〕4812162024283236二、DGGE胶的制备<l>用无水乙醇清洁制胶用的两块玻璃板,将spacer放在2个玻璃板之间,插入clamp中,将aligment板放入,用螺丝夹子固定,将aligment取出,用手摸底部是否平整,要绝对的平,否则会漏。<2>将软垫放在底座上,玻璃板放在软垫上固定,用水平器调节。<3>配制13.5mL高浓度变性梯度液,加入梯度仪高浓度右槽,打开左槽螺旋,溶液流入左槽,关上螺旋,用吸管将它们吸回右槽内<确保两槽无气泡阻隔>。<4>配制13.5mL低浓度变性梯度液,加入梯度仪低浓度左槽。<5>轻轻打开两槽间的活塞和梯度仪出口开关,并搅拌。将长针头插入玻璃板之间,流速保持在2mL/min左右。<6>胶板灌满后,顶部插入梳子,凝固2小时。三、DGGE凝胶电泳步骤与染色<l>在DGGE槽中加7L左右1*TAE<DGGE专用>,使槽中的水至Full和Run的中间位置；加盖,注意长杆进入底部的窟窿中,打开电源,将温度设置到60℃<2>当梳子位置的胶凝固好后,将玻璃板固定在黄色的凝胶板架上,如果只有1板胶,注意另一侧也要固定玻璃板<不加spacer>,否则漏水。安装好玻璃板后,将凝胶板架<红点在右边>放入水槽中,之后将温度控制器盖在电泳槽上,注意长杆进入底部的窟窿中。打开电源,打开heat键和bump键,开bump键后,水位会下降,降至run与maxmum的中间,水若不够的话,关闭电源,打开温度控制器上方的探望口,加1*TAE补足。<3>温度达到60℃,立即进样,先关掉所有电源,取下温度控制器,小心地拔掉梳子,用移液枪冲洗侮一个进样孔；进样要缓慢,使样品顺着玻璃板均匀地落入到进样孔中。每一个进样孔加入25µ<4>将温度控制器盖在电泳槽上,打开电源,将温度调到60℃,打开heat键和bump键,运行5min后,在主机上插入红黑电源线,注意红黑线不要颠倒。打开主机电源,将电压调到120V,时间调为5<5>电泳结束后,关掉电源,打开盖子,将凝胶板架拿出,控水,卸下玻璃板。将clamp卸下,手抓住spacer,向内侧拧,揭下短玻璃板,胶粘在长玻璃板上。<6>将托盘上平铺X保鲜膜后,将长板和胶放入托盘中银染。银染步骤步骤：时间溶液固定30min10%冰醋酸、30%乙醇,100ml敏化2*10min30%乙醇,100ml洗涤冲洗30s,漂洗5*5min双蒸水银染30min新鲜配制的0.1%AgNO3,100ml,使用前加入370μl的福尔马林溶液洗涤冲洗30s,漂洗1min,再冲洗30s双蒸水显影直至显示条带为止,密切观察溶液1：0.2g硫代硫酸钠于10ml水中溶液2：2.5g碳酸钠于100ml水中将100μl溶液1加入溶液2中,再加350μl的福尔马林溶液终止30min5.84gEDTA2Na·2H2O以与8gGlycine于双蒸水中,定容至400ml〔也可用10%的冰醋酸〕保存长达数日10%甘油长时间保存干胶自然干燥即可〔1〕AgNO3母液〔20%〕：将2gAgNO3溶解于双蒸水中,定容至10ml,放置于棕色瓶中密闭保存。每次使用时取2ml母液,稀释至400ml,再加入福尔马林。〔2〕10*TrisEDTA〔TE〕：pH=8.0A．100mmol/LTris-CI〔pH=8.0〕B．10mmol/LEDTA<pH=8.0>C．Tris-Cl<1mol/L>：用800ml蒸馏水溶解121.1gTris碱,加浓盐酸调pH值至所需值。银染原理：银染是一种常用的蛋白质染色方法,具有较高的灵敏度,可以染出SDS胶中含量低至0.2ng的蛋白。虽然这是protocol上的说法,但如果操作得当,检测到5ng左右的蛋白应该不成问题。如果搜索银染的protocol,可能会得到许多种说法。为什么这样一种重要的实验手段却得不到统一的应用呢？这可能要从银染本身那复杂而又灵活的原理说起。简单的讲,银染的原理就是将银离子还原,附着在蛋白表面,形成染色。银染所用的银,基本上是基于两种试剂,一种是硝酸银,另一种是Silverdiammine。基于硝酸银的应用要多于后者〔据说Silverdiammine比较费"银子"〕,现在主要说说基于硝酸银的银染的原理。银离子容易被还原,在PAGE胶上,哪里的银离子先开始被还原,哪里就先开始出现条带。通常由于蛋白质结构上的复杂性,一部分银离子结合在蛋白质之上后会影响更多银离子的结合,所以有蛋白的地方银离子较少,如果不做任何处理,有蛋白的部位将会染色更浅,所以最初的银染是负染。那最初的负染是如何演变成正染色的呢？一方面是选用还原速度较慢的还原剂,如甲醛,另一方面,利用慢还原争取到的时间将胶上多余的银离子洗去,由于银离子对蛋白质有一定的结合力,故更多地保留在有蛋白的位置,于是形成了正染。但是这种染色的方法灵敏度还不是很高,所以人们又在染色之前加入了敏化的步骤,能够使银染敏化的试剂很多,一类是增加蛋白质与银离子的结合位点,如SDS等；还有一类能使银离子和蛋白形成silversulfide等结合,硫代硫酸盐起到的就是这个作用；还有的试剂兼顾上述两种功能,如戊二醛。通过敏化过程,银染的灵敏度大大增加,同时也降低了背景。综上,银染的原理概括如下：让银离子尽可能多的于蛋白结合,尽可能的洗掉胶上的银离子,然后还原显色。各种各样的protocol基本上都是基于这个原理。最为经典的一个版本是这样的：谈谈其中一些具体步骤：1.固定,固定的作用主要是使蛋白变性,防止蛋白在扩散2.敏化,戊二醛和硫代硫酸钠都是增加蛋白和银离子的结合,但是做质谱兼容银染的时候一般都把戊二醛去掉,原因是对蛋白造成修饰〔在我的实验中,有戊二醛存在的时候一般也能鉴定到蛋白,不知道是不是去掉更好〕。乙酸钠的作用应该是缓冲pH。3.染色,有的protocol中这一步不加甲醛,不加甲醛使后面的显色速度将大大降低。4.显色,碳酸钠的作用是提供碱性环境,在碱性环境下甲醛才能发挥它的慢还原特性。这一步中的硫代硫酸钠有增加银化合物溶解的能力,防止氯化银在胶表面形成薄膜,但是在质谱兼容银染中,硫代硫酸钠也是省去的。5.终止,顾名思义,显色成功后终止反应。评价好的银染方法主要基于以下几个方面：灵敏度,重复性,速度。个人认为平衡好灵敏度和重复性是实验的关键,速度可以放在后面考虑。如果不知道哪个版本的银染更为合适,那么上面的那个经典版本是个不错的选择,之后可以根据具体的结果,并参考银染的原理做些优化。通常银染方法简单,只需几步。电泳后,在醋酸中固定胶除去电泳液和凝胶中的尿素,并防制小的延伸产物的扩散。换几次蒸馏水除去固定剂。胶在硝酸银和甲醛中染色。在染色后,将凝胶用水清洗,在含甲醛和硫代硫酸钠的碱性碳酸钠溶液中显色。甲醛将银离子还原为金属银。硫代硫酸钠防止自由银离子还原为金属银,否则会增加背景。在显色一定的时间后,用水清洗一下,在空气中干燥。<7>用Bio-RadGelDocTMXR凝胶成像系统观察并拍照。.〔四〕DGGE图谱目的条带的克隆测序1.DGGE图谱目的条带DNA的提取与PCR扩增将切取下来的目的条带浸泡在TE溶液中,4℃过夜,得到的溶液即可作为PCR反应的模板。PCR反应体系与程序与之前相同,采用引物对BSF338<5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’>和BSR534<5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’>。PCR反应体系〔25µl〕:10×ExTaqbuffer<Mg2+>2.5µl,2.5mmol/LdNTP2µl,20pmol/L正反引物各0.75µl,模板DNA10～100ng,ExTaq0.25µl,加双蒸水补足至25µl。PCR反应程序：94℃预变性5min,94℃变性40s,55℃退火40s,72℃延伸30s,35个循环,72℃2.PCR产物的胶回收采用E.Z.N.AGelExtractionKit,操作步骤如下：<1>电泳足够时间后,在紫外灯下小心地把所需的DNA片段切下来,并尽量去除多余的凝胶。<2>称取空离心管的重量,切下带目的片段的凝胶装在1.5ml离心管中并称其重量,求出凝胶块的重量,近似地确定其体积。一般情况下,凝胶的密度为1g/ml,于是凝胶的体积与重量的关系可按下面换算：凝胶薄片的重量为0.2g则其体积为0.2ml；加入等倍凝胶体积的BindingBuffer,把混合物置于55℃~65℃水浴中温浴7min至凝胶完全融化,其间每隔2-3<3>转移700μl的DNA-琼脂糖溶液到一个HiBindTMDNA柱子,并把柱子装在一个干净的2ml收集管内,室温下,10000×g离心1min,弃去液体；<4>将柱子重新套回收集管中,加300μlBindingBuffer至HiBindDNA柱子中,室温下,10000×g离心1分钟,去弃滤出液；<5>将柱子重新套回收集管中,加入700μlSPWWashbuffer至HiBindDNA柱子中,室温下,10000×g离心1min,去弃滤出液；<6>将柱子重新套回收集管中,重复加入700μlSPWWashbuffer至HiBindDNA柱子中,室温下,10000×g离心1min,弃去滤出液；将空柱子重新套回收集管中,10000×g离心1min以甩干