DNA测序概述-非常全

DNA测序技术概述2014年4月2日DNA测序技术简介DNA测序技术的开展DNA测序技术的小结与展望DNA测序简介DNA是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸。这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。对于每个生物体来说，基因组包含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基因组DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的复杂性和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要的角色。测序技术最早可以追溯到20世纪50年代，早在1954年就已经出现了关于早期测序技术的报道，直至1977年Sanger等创造的双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等创造的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。此后三十几年的开展中陆续产生了第二代测序技术，这些技术都采用了合成测序法，只是在DNA阵列的排布、DNA簇扩增，以及基于酶的测序生化反响方面存在差异。第一代DNA测序技术

三测序方法的原理第二代DNA测序技术

三个测序平台的工作原理及操作步骤第三代DNA测序技术单分子测序的特点及应用前景DNA测序技术的历史自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的开展历程。199820012002200420062007200820092010200020112012第一代DNA测序技术成熟的DNA测序技术始于20世纪70年代中期。1977年Sanger创造了双脱氧链终止法。同一时期,Maxam和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法。20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代。这些技术统称为第一代DNA测序技术。1.链终止法利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸顺序的方法，是由英国剑桥分子生物学实验室的F.Sanger等人于1977年创造的。F.Sanger〔1980年诺贝尔奖获得者〕〔Thechainterminationmethod〕双脱氧链终止法原理：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4种dNTP存在条件下复制时，在四管反响系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，因为双脱氧核苷没有3´-OH，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端,该链就停止延长，假设链端掺入单脱氧核苷,链就可以继续延长。如此每管反响体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3´端的一系列长度不等的核酸片段。反响终止后，分4个泳道进行凝胶电泳,别离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后,根据片段3′端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。技术路线与要求制备单链模板↓将单链模板与一小段引物退火↓参加DNA多聚酶4种脱氧核苷酸分别参加少量4种双脱氧核苷酸↓将4种反响产物分别在4条泳道电泳↓根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列

A克隆于质粒中DNA→用碱或热变性BM13克隆单链DNAC噬粒克隆DNADPCR产生单链DNAA高酶活B无5’→3´外切酶活性C无3´→5´外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP的3’碳原子连接的是氢原子,不是羟基5ˊPP5ˊ3ˊHOOH3ˊ5ˊPOH3ˊP325ˊ5ˊPOH3ˊHODNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTPddGTPddATPddTTPddCTP制备单链DNA加放射性引物ddGTPddATPddTTPddCTP5ˊ

32P-GTCATGTGCTAG5ˊ

32PGTCATGTGCTA5ˊ

32PGTCATGTGCT5ˊ

32PGTCATGTGC5ˊ

32PGTCATGTG5ˊ

32PGTCATGT5ˊ

32PGTCATG5ˊ

32PGTCAT5ˊ

32PGTCA5ˊ

32PGTC5ˊ

32PGT5ˊ

32PG聚合产物分别在4个泳道电泳从下到上依次读出DNA片段的核苷酸序列1、模板有两类DNA可以用做Sanger法测序的模板：纯单链DNA和经过热变性或碱变性的双链DNA。采用从重组M13噬菌体颗粒中别离得到的单链DNA模板效果最正确。Sanger法DNA测序的试剂

2.引物酶促测序反响中利用一个与模板链特定序列互补的合成寡核苷酸作为DNA合成的引物。

M13噬菌体重组克隆的通用测序引物一般长15个~29个核苷酸，并可与紧靠M13mpl8噬菌体多克隆位点区的HindⅢ位点或M13mpl9噬菌体多克隆位点区的EcoRⅠ位点的序列互补。这些引物同样也可用于对克隆于pUC质粒的DNA进行‘双链’测序。此外，还有假设干家公司出售一些引物，这些引物是为了对通过多种限制酶切位点克隆于不同质粒的靶DNA进行测序而设计的。

3、DNA聚合酶

通常用于双脱氧法序列测定的有几种不同的酶，其中包括大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的K1enow片段、反转录酶、经过修饰消除了3‘一5’外切酶活性的T7噬菌体DNA聚合酶[测序酶(5equenase)]和测序酶序酶2.0版，以及耐热DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)。〔1〕大肠杆菌DNA聚合酶Klenow这种酶是最初用以建立Sanger法的酶，也是至今仍然广泛用于DNA序列测定的酶，通常碰到的两个问题是：1)Klenow片段的持续合成能力低；2)这种酶对模板中的同聚核苷酸或其他含牢固二级结构的区域进行复制的效能很低；将聚合反响的温度提高到55℃，可以缓解但并不能彻底解决这一问题。

〔2〕反转录酶尽管日常测序工作并不广泛使用反转录酶，但有时用这个酶来解决一些由于模板DNA中存在A／T或G／C同聚核苷酸区而引起的问题。

〔3〕测序酶(SequenaseTM)是一种经过化学修饰的T7噬菌体DNA聚合酶。该酶原来具有很强的3＇一5＇外切核酸酶活性，经过修饰后，这一活性大局部均被消除。测序酶2.0版完全缺失了3＇一5外切酶活性，极其稳定而且活性要比经化学修饰的测序酶高2倍。测序酶持续合成能力很强，聚合速率很高，具有广泛的耐受性，它是测定长段DNA序列的首选酶。4〕TaqDNA聚合酶适用于测定在37℃形成大段稳定二级结构的单链DNA模板序列。这是因为Taq

DNA聚合酶在70℃一75

℃活性最高，这一温度下即使GC丰富的模板也无法形成二级结构。有人报道，使用Taq

DNA聚合酶进行测序，在放射自显影片上得到的连续数百个碱基条带始终清晰如一，说明这种酶的持续合成能力甚佳。

4．放射性标记的dNTP

[a-32p]dNTP被广泛地应用于DNA测序。然而32P发射的强β粒子造成两个问题。首先由于发生散射，放射自显影片上的条带远比凝胶上的DNA条带更宽、更为扩散，因此将影响到所读取的序列正确性。其次32P的衰变会引起样品中DNA的辐射分解，因此用32P进行标记的测序反响只能保存一两天，否那么DNA将被严重破坏以至测序凝胶上模糊不清、真假难辨。

[35s]dATP的使用大大缓解了上述两方面的矛盾。由于35S的衰变产生较弱的β粒子，其散射有所减弱，凝胶和放射自显影片之间在分辨率上相差无几，因此可以从一套反响中确切测定数百核苷酸的DNA序列。此外，35S的低能辐射所引起的样品分解比较轻微，因此，测序反响可在‐20℃保存至1周，而分辨率并不下降。通过M13载体获得单链DNA以测序M13噬菌体载体是专为得到单链DNA测序模板而设计的。美国哈佛大学的Maxam和Gilbert于1977年创造的，化学降解法主要用于测定短片段DNA的序列。用化学试剂处理末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割。由此产生的一组具有各种不同长度的DNA链的反响混合物，经凝胶电泳和放射自显影后，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。2.化学降解法化学降解法技术路线

将双链DNA样品变为单链↓每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带↓分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体↓电泳,放射自显影，读取DNA的核苷酸顺序同时完成4组反响，A、G、C、T链终止法：主流技术，易于机械化自动控制。化学降解法：试剂含有毒性。化学降解法的特点重现性好，所用试剂简单，易于掌握；所测长度比Sanger法短一些，对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果较好；序列来自原DNA分子而不是酶促合成反响所生成的拷贝；因此，不会出现误读、可对未克隆的片段、合成的寡核苷酸直接进行测序；5′和3′端均可标记，可从两方向测同一DNA，保证准确性；操作繁琐、费时、分辨率较低、试剂毒性大。

3、荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger原理，用四种不同的荧光混合物分别标记四种反响的产物，用四种反响物混合在一起进行电泳，在激光的激发下四种带有不同荧光染料标记物的ddNTP可以在同一反响管种进终止测序反响，并于变性的聚丙烯酰胺凝胶的同一泳道中进行电泳检测。当带有某种荧光素标记的DNA片段电泳到激光探头的检测范围时，激光所激发的荧光信号被探测器接受，经计算机分析数据，自动排列出DNA序列。第一代半自动测序示意图第一代全自动测序

——毛细管电泳测序用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳，可使DNA的测序速度更为迅速。这种电泳装置有96个泳道，每次可同时进行96次测序，每轮实验不到2小时，1天可完成近千次反响。毛细管电泳测序装置第一代测序法的比较方法双脱氧末端终止法化学降解法荧光自动测序技术优点操作简便，结果清晰可靠，一次能确定300-500个核苷酸序列，已成为最常用的DNA测序方法不需要进行酶促反应，可以分析甲基化等DNA的修饰情况自动化程度高，高效率，精确度增加缺点花费时间过久，成本较高一次最多只能分析250个核苷酸，所用的许多化学试剂有毒纯化量小，不能纯化较长的片段第二代DNA测序技术

二代测序的核心思想是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。第二代测序技术主要包括罗氏454公司的GSFLX测序平台、Illumina公司的SolexaGenomeAnalyzer测序平台和ABI公司的SOLiD测序平台。

第二代测序技术最显著的特征是高通量,一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序,使得对一个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行。1、Roche454——GSFLX454公司可谓新一代测序技术的奠基人。2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——GenomeSequencer20System，被《Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序〔sequencing-by-synthesis〕的先河。后来，他们又推出了全新的GSFLX系列试剂和软件的补充，让GSFLX的通量一下子提高了5倍，准确性、读长也进一步提升。Roche454测序原理原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度，到达实时检测DNA序列的目的。样品处理主要是针对大片段的DNA分子，如基因组DNA、Fosmid或BAC质粒等，利用超声或氮气打断将这些DNA分子片段化，然后采用琼脂糖凝胶电泳回收或磁珠纯化，选择500-800bp的DNA片段。对于非编码RNA或PCR产物，那么不需要这一步骤。一、样品处理454〔GSFLX〕测序技术流程二、文库制备文库制备包括接头连接和磁珠纯化两步，基因组DNA/cDNA片段经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA。454的文库接头分A、B两种，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的测序引物及4bp〔TCAG〕的“key”碱基构成，其中B接头的5’端带有生物素〔Biotin〕标记，用于磁珠纯化步骤。三、连接微珠一个DNA片段＝一个磁珠：单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上。每一个磁珠携带了一个独特的单链DNA片段。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，这样就形成了只包含一个磁珠和一个独特片段的微反响器。四、emRCR每个独特的片段在自己的微反响器里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。对于每一个片段而言，扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增的片段仍然结合在磁珠上。乳液PCR〔emRCR〕五、反响板准备、上机测序454测序的反响板称为PTP〔PicoTiterPlate〕，含有350万个由光纤组成的小孔，每个孔的直径为29μm，而测序磁珠的直径为20μm，因此每个孔中仅能容纳一个磁珠。携带DNA的捕获磁珠随后放入PTP板中进行后继的测序。放置在单独的试剂瓶里的碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在ATP硫酸化酶和萤光素酶的作用下，经过一个合成反响和一个化学发光反响，最终将萤光素氧化成氧化萤光素，同时释放出光信号。此反响释放出的光信号实时被高灵敏度CCD捕获到。一个磁珠＝一条读长Roche454测序步骤六、测序和分析将磁珠与测序试剂参加PTP中，使之可用于上机测序。GSFLX测序技术的优点GSFLX系统的测序也是一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将优点引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以到达实时测定DNA序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；特点：分析结果快速、准确、灵敏度高和自动化。

2.Illumina-SolexaGenomeAnalyzerSolexa系统应用了边合成边测序〔SequencingBySynthesis〕的原理。参加改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。这些核苷酸是“可逆终止子”，因为3’羟基末端带有可化学切割的局部，它只容许每个循环掺入单个碱基。此时，用激光扫描反响板外表，读取每条模板序列第一轮反响所聚合上去的核苷酸种类。之后，将这些基团化学切割，恢复3'端粘性，继续聚合第二个核苷酸。这样，统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA片段的序列。Solexa测序技术路线：Solexa测序技术的特点①通量高目前一台机器在两周内最高可产出360G的数据;②准确率高高于98.5%，同时也有效地解决了多聚重复序列的读取问题;③本钱低低于传统Sanger测序技术的本钱;④DNA序列的读取长度不断增加⑤可以进行Pair-end(PE)双向测序PE文库插入片段大小范围可由150bp到10kb。正确选择插入片段长度有利于高重复序列含量基因组的组装，这进一步扩展了该技术的应用范围。但是读长错误率会增高。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响，如荧光标记的不完全切割。3.ABI——SOLiD测序技术SOLiD的独特之处在于以四色荧光标记寡核苷酸的连续连接合成为根底，取代了传统的聚合酶连接反响，可对单拷贝DNA片段进行大规模扩增和高通量并行测序。就通量而言，SOLiD3系统是革命性的，目前SOLiD3单次运行可产生50GB的序列数据，相当于17倍人类基因组覆盖度。而其无以伦比的准确性、系统可靠性和可扩展性更让它从其他新一代测序平台中脱颖而出。SOLiD工作流程

a.文库制备

b.乳液PCR/微珠富集

c.微珠沉积

d.连接测序

e.数据分析SOLiD优点

1.系统可扩展性

2.高通量

3.灵活性

SOLiD系统已不再是一台单纯的测序仪，而是成为功能更全面的基因分析仪。除了测序和重测序，还能进行全基因表达图谱分析、SNP、microRNA、甲基化等多种分析。例子：

SNP分析

尽管绝大多数的人类遗传信息在所有人中都相同，但是研究人员通常更感兴趣的是研究个体之间微小的遗传差异。包括DNA片段的插入、缺失、倒位和易位等，可能对基因产生重要影响，并导致人类疾病的发生。甲基化分析

甲基化是自然发生的DNA化学修饰的一种。抑癌基因的失活与DNA序列特定区域的甲基化有关。而去甲基化那么可能导致基因组不稳定和表达模式变化。DNA甲基化区域可能作为基因在癌症过程中的标记。研究人员一直致力研究从正常到癌变过程中甲基化模式如何变化的，原癌基因异常甲基化模式在癌变过程中扮演怎样的角色。罗氏/454基因组测序仪FLX系统焦磷酸测序法光学230-400在第二代中最高读长；比第一代的测序通量大样品制备较难；难于处理重复和同种碱基多聚区域；试剂冲洗带来错误累积；仪器昂贵illuminaHiSeq2000/miSeq可逆链终止物和合成测序法荧光/光学2x150很高测序通量仪器昂贵；用于数据删节和分析的费用很高ABI/SOLiD5500xlSOLiD系统连接测序法荧光/光学25-35很高测序通量；在广为接受的几种第二代平台中，所要拼接出人类基因组的试剂成本最低测序运行时间长；读长短，造成成本高，数据分析困难和基因组拼接困难；仪器昂贵公司平台名称测序方法检测方法大约读长(碱基数)优点相对局限性三大测序平台的技术特点和差异第三代DNA测序技术第二代测序技术在制备测序文库的时候都需要经过PCR扩增，而这一PCR过程可能引入突变或者改变样品中核酸分子的比例关系。另外，第二代测序的读长普遍偏短，在进行数据拼接时会遇到麻烦。为了克服这样的缺点，业界开展出了以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术。2008年4月HelicoBioScience公司的Timothy等人在Science上报道了他们开发的真正的单分子测序技术，也被成为第三代测序技术。这项技术完全跨过了第二代测序技术依赖基于PCR扩增的信号放大过程，真正到达了读取单个荧光分子的能力。1.Helicos公司Heliscope单分子测序仪基于边合成边测序的思想，将待测序列随机打断成小片段并在3'末端加上Poly(A)，用末端转移酶在接头末端加上Cy3荧光标记。用小片段与外表带有寡聚Poly(T)的平板杂交。然后，参加DNA聚合酶和Cy5荧光标记的dNTP进行DNA合成反响，每一轮反响加一种dNTP。将未参与合成的dNTP和DNA聚合酶洗脱。检测上一步记录的杂交位置上是否有荧光信号，如果有那么说明该位置上结合了所参加的这种dNTP。用化学试剂去掉荧光标记，以便进行下一轮反响。经过不断地重复合成、洗脱、成像、淬灭过程完成测序。PacificBiosciences公司的SMRT技术基于边合成边测序的思想，以SMRT芯片为测序载体进行测序反响。SMRT芯片是一种带有很多ZMW孔的厚度为100nm的金属片。将DNA聚合酶、待测序列和不同荧光标记的dNTP放入ZMW孔的底部，进行合成反响。与其他技术不同的是，荧光标记的位置是磷酸基团而不是碱基。2.PacificBiosciences公司当一个dNTP被添加到合成链上的同时，它会进入ZMW孔的荧光信号检测区并在激光束的激发下发出荧光，根据荧光的种类就可以判定dNTP的种类。此外由于dNTP在荧光信号检测区停留的时间〔毫秒级〕与它进入和离开的时间〔微秒级〕相比会很长，所以信号强度会很大。其它未参与合成的dNTP由于没进入荧光型号检测区而不会发出荧光。在下一个dNTP被添加到合成链之前，这个dNTP的磷酸基团会被氟聚合物〔fluoropolymer〕切割并释放，荧光分子离开荧光信号检测区。3.OxfordNanoporeTechnologies公司

OxfordNanoporeTechnologies公司正在研究的纳米孔单分子技术是一种基于电信号测序的技术。他们设计了一种以α-溶血素为材料制作的纳米孔，在孔内共价结合有分子接头环糊精。用核酸外切酶切割ssDNA时，被切下来的单个碱基会落入纳米孔，并和纳米孔内的环糊精相互作用，短暂地影响流过纳米孔的电流强度，这种电流强度的变化幅度就成为每种碱基的特征。纳米孔测序技术

与NGS,SMRT等技术相比，纳米孔测序不需修饰DNA或dNTP,不需要酶和荧光基团、不需荧光检测系统等，具有直接测序和更低本钱的潜能，是单分子测序领域的热点之一。纳米孔测序原理比较简单:在一块膜内嵌入一个直径约为1.5nm的纳米孔，在纳米孔两端加上一定的电压，在电场力的作用卜，单链DNA分子会通过这个孔并引起电流变化，电流的特征用来标识碱基序列。

尽管有实验说明有些纳米孔系统可以检视出单碱基加成引起的特征电流变化，目前纳米孔DNA测序领域主要有两大障碍。第一，DNA链通过纳米孔的速度太快(约1个碱基/微秒)，超