.哺乳动物组织基因组DNA提取

11三月2024.哺乳动物组织基因组DNA提取*2一、实验目的(ExperimentalPurpose)Aftertheexperimentdone,studentsshouldbeabletoknowhowtoextractgenomicDNAfrommammaltissue.掌握动物基因组DNA提取的操作方法。*3细菌-原核细胞(prokaryote)无真正的细胞核真核细胞(eukaryote)有真正的细胞核，还有很复杂的细胞器*4动物细胞特有中心体，高等植物细胞特有细胞壁，叶绿体和液泡动物细胞(animalcell)植物细胞(plantcell)*5二、实验原理(ExperimentalPrinciple)Intheproceduredescribedhere,theSDS(sodiumdodecylsulfate)areaddedtodenatureproteinsandsolubilizelipidsinmembranesleadingtocelllysis.ThecelllysateisoftentreatedwithenzymesthathydrolyzeRNAandproteins.

本实验利用去垢剂SDS(十二烷基磺酸钠)是为了使蛋白变性并溶解细胞膜中的脂质从而导致细胞裂解，而细胞裂解物又常用蛋白酶K和RNA酶进行水解处理。*6真核生物染色体DNA组装不同层次的结构*7Thisisgenerallyfollowedbyphenolofphenol:chloroformextractiontoremovetheremainingproteins,whichwilleitherentertheorganicphaseor,ifdenatured,appearattheinterphase.Chloroformtreatmentisusedtoremovethephenol,andalcoholprecipitationconcentratestheDNAwhileremovingimpurity.

随后用酚︰氯仿进行抽提，以去除残留的蛋白质，这时蛋白质将进入有机相，或者假如己变性的话将呈现在有机相与水相之间。氯仿处理是为了去除苯酚，而乙醇沉淀处理则可以浓缩DNA，同时去除核苷酸、氨基酸以及低分子量的寡核苷酸和肽。*8Asafurtherprecaution,ethylenediaminetetraace-ticacid(EDTA)isinclude-edinthebufferstochelateMg2+.Thiswillreducedeoxyribonuclease(DNase)activitybecauseoftheMg2+requirementoftheseenzymes.为了进一步保护DNA样品的完整性，通常需要在缓冲液中添加乙二胺四乙酸(EDTA)以整合Mg2+，这样将会减少脱氧核糖核酸酶(DNase)的活性，因为该酶必须在有Mg2+存在时才会起作用。*9ThemethoddescribedhereresultinDNAthatiseasilycutwithrestrictionenzymesand,therefore,isusefulforSouthernHybridizationstudies.IftheDNAistobeusedtoconstructaclonebank,highermolecularweightDNAisdesirable,sothevortexstepshouldbeeliminated.

本实验方法分离得到的染色体DNA样品易被限制酶切割，因此，较适用于Southern杂交的研究。如果所制备的基因组DNA是用于构建克隆文库，要求得到较大分子量的DNA，则必须省略其中的振荡步骤。*10核酸的分离纯化、测定及研究方法一、

分离核酸的一般原则

因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础。*11（一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则

①保证核酸一级结构的完整性；

②排除其它分子的污染。（二）核酸的纯度要求

①

核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。*12（三）核酸分离纯化的注意事项为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意：①尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；②减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4～10条件下进行；③防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中DNA酶需要金属二价阳离子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素；④减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。

*13高温：如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的某些化合键也有破坏作用。核酸提取过程中常规操作温度为0～4℃以降低核酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。

机械剪切力：包括强力高速的溶液振荡、搅拌，细胞突然置于低渗液中；细胞爆炸式地破裂及DNA样品的反复冻融等。这些操作细节在实验操作中应加倍注意。机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA等。

*14二、核酸分离纯化的一般步骤破碎细胞→去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子→沉淀核酸→去除盐类、有机溶剂等杂质→纯化干燥→溶解。核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。*15三、试剂与器材（Reagentsandapparatus）

Ⅰ.Instruments

Highspeedrefrigeratedcentrifuge（高速冷冻离心机）、Glasshomogenizer（玻璃匀浆器）

、ElectrophoresisSystem（电泳系统）

、Ultraviolettransilluminator（紫外透射仪）

、Ultracoldstoragefreezer（超低温冰箱）

、Autoclave（高压灭菌锅）

、Pipettes（微量加样器）

、Electronicbalance（电子天平）

、

Acidometer（酸度计）*16Ⅱ.Materials

Liverofmice*17Ⅲ.ReagentsTris：Tris(Hydroxymethyl)aminomethane

（三羟甲基氨基甲烷）、SDSsodiumdodecylsulfate,sodiumsalt(十二烷基硫酸钠)、EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid(乙二胺四乙酸)、HClhydrochloricacid（盐酸）、NaOHSodiumhydroxide（氢氧化钠）、Sodiumacetate(醋酸钠)、Aceticacid（冰乙酸）、Phenol（平衡酚）、Chloroform（氯仿）、Isoamylol（异戊醇）、Ethanol（乙醇）、TEbufferProteaseK（蛋白酶K）、RNaseA（RNA酶）、Agarose（琼脂糖）、DNAmolecularweightmarkers（DNA相对分子质量标准物[MarkDNA]）、Boricacid硼酸、Sugar蔗糖、Bromophenolblue溴酚蓝、Fluorescentdye(荧光染料)[Gelview]*18溶液的配制摩尔质量的计算:质量(g)分子量例：5mol/LNaCl分子量58.4450ml

x58.44密度的计算：÷0.05(L)＝5（mol/L）x＝14.61（g）÷体积(L)＝摩尔体积（mol/L）质量(g)体积（V）＝密度（g/ml）*19(1)5mol/L氯化钠（NaCl）：溶解292g氯化钠于足量的水中，定容至1000ml。(2)0.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）:配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三钠盐。或称取186.2g的Na2EDTA·2H2O和20g的NaOH，pH调至8.0，并溶于约900ml水中，定容至1000ml。（3)3mol/L乙酸钠（NaAc）：溶解204g的三水乙酸钠于约450ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至5.2，再加水定容到500ml。*20(4)10％十二烷基硫酸钠（SDS）：称取10gSDS慢慢转移到约含90ml的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解定容至100ml。(5)5mol/L氢氧化钠（NaOH）：溶解20g氢氧化钠颗粒于约90ml水的烧杯中（磁力搅拌器搅拌），完全溶解后用水定容至100ml。(6)1mol/L盐酸（HCl）：加8.6ml的浓盐酸至91.4ml的水中。*21(7)20mg/ml蛋白酶K（proteinaseK）：将200mg的蛋白酶k加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份(1ml)贮存于-20℃。(8)10mg/mlRnase（无DNase）（DNase-freeRNase）：溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸钠水溶液中（pH5.0）。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。用1mol/L的Tris-HCl调pH至7.5，于-20℃贮存。（配制过程中要戴手套）*22(9)

1mol／L

Tris缓冲液（Tris·HClbuffer）

将121g的Tris碱溶解于约0.9L水中，再根据所要求的pH（25℃下）加一定量的浓盐酸（11.6N），用水调整终体积至1L。浓盐酸的体积（ml）pH148.621

28.5

38

46

56

66

71.3

769.08.8

8.6

8.4

8.2

8.0

7.8

7.6

7.4

7.2*23四、实验步骤(ExperimentalProcedures)

冰浴处理生理盐水玻璃匀浆器

冰冷的生理盐水清洗配制工作液处死小鼠取出肝脏

组织匀浆液

酶解液2ml匀浆液

组织细胞液

玻璃匀浆器匀浆移至1.5ml离心管5000r／min30—60s加400ul吹散加400ul离心无菌水酶解液水浴处理（55℃、12—18h）

*24工作液配置：贮备液摩尔浓度×贮备液（体积）＝工作液摩尔浓度×工作液（体积）例：组织匀浆液（10ml）贮备液摩尔浓度：5mol／LNaCl工作液摩尔浓度：100mmol／L5mol／L×x＝0.1mol／L×10mlx＝0.2ml*25组织匀浆液（装入10ml离心管中）10ml100mmol/LNaCl：

0.2ml（5mol/LNaCl）25mmol/LEDTA：

0.5ml（0.5mol/LEDTApH8.0)10mmol/LTris·HCl：

0.1ml（1mol/LTris·HClpH8.0)加三蒸水:9.2ml*26酶解液（装入1.5ml离心管中）1ml200mmol/LNaCl：0.04ml

（5mol/LNaCl）50mmol/LEDTA：0.1ml

（0.5mol/LEDTApH8．0)20mmol/LTris·HCl：0.02ml（1mol/LTris·HClpH8．0)1%SDS：

0.5ml（2%SDS）200μg/mL蛋白酶K：

0.02ml

（10mg/ml）

加三蒸水:0.32ml*27无DNA酶的RNA酶（-20℃保存）

10mmol/LTris·HCl将胰RNA酶溶于浓度10mg／mL

15mmol/LNaCl

于100℃水浴处理15min以降解DNA酶缓慢冷却到室温。*28四、实验步骤(ExperimentalProcedures)

等量分装在两支离心管内加入20ul的RNase加入等体积①提取液4℃10min酶解样品待抽提的样品抽提

静置离心

配制TE缓冲液

加等体积②提取液500ul10000r／min离心10min4℃10min

移出水相至离心管抽提

静置

10000r／min离心10min加1/10加2倍放入离心移出水相NaAc无水乙醇

-20℃1-2h12000r／min离心15min加入超低温冰箱融化、离心弃上清液

洗涤12000r／min离心15min干燥4℃

75%冷乙醇离心弃上清液加TE50µl存放DNA

*29平衡酚(pH8.0)：氯仿：异戊醇：25：24：1

(体积比)即配即用

每管加500ul平衡酚(pH8.0)：250ul氯仿：240ul异戊醇：10ul*30氯仿：异戊醇：24：1(体积比)即配即用

每支试管加500µl氯仿：480µl异戊醇：20µl*31TE缓冲液1ml10mmol/LTris·HCl：

10µl（1mol/LTris·HClpH8.0)1mmol/LEDTA：

2µl（0.5mol/LEDTApH8.0)加三蒸水0.988ml至1ml*32核酸的酚抽提原理：交替使用酚、氯仿两种蛋白质变性剂，更有效去除蛋白质。氯仿还可加速有机相与水相的分层。异戊醇：抑制界面泡沫的形成。标准程序：酚——酚-氯仿——氯仿。*33酚抽提除去蛋白质的示意图*34四、实验步骤(ExperimentalProcedures)

等量分装在两支离心管内加入20ul的RNase加入等体积①提取液4℃10min酶解样品待抽提的样品抽提

静置离心

配制TE缓冲液

加等体积②提取液500ul10000r／min离心10min4℃10min

移出水相至离心管抽提

静置

10000r／min离心10min加1/10加2倍放入离心移出水相NaAc无水乙醇

-20℃1-2h12000r／min离心15min加入超低温冰箱融化、离心弃上清液

洗涤12000r／min离心15min干燥4℃

75%冷乙醇离心弃上清液加TE50µl存放DNA

*35核酸的沉淀原理：核酸与钠、钾、镁形成的盐在许多有机溶剂中不溶，也不会变性。醋酸钠为沉淀DNA、RNA的最常用盐类。有机溶剂：乙醇、异丙醇、聚乙二醇。温度：冰水*36四、实验步骤(ExperimentalProcedures)

等量分装在两支离心管内加入20ul的RNase加入等体积①提取液4℃10min酶解样品待抽提的样品抽提

静置离心

配制TE缓冲液

加等体积②提取液500ul10000r／min离心10min4℃10min

移出水相至离心管抽提

静置

10000r／min离心10min加1/10加2倍放入离心移出水相NaAc无水乙醇

-20℃1-2h12000r／min离心15min加入超低温冰箱融化、离心弃上清液

洗涤12000r／min离心15min干燥4℃

75%冷乙醇离心弃上清液加TE50µl存放DNA

*37四、实验步骤(ExperimentalProcedures)AgaroseGelElectrophoresis：Preparationofthegel

制备0.3％琼脂糖凝胶LoadingDNAsamples