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文档简介

DNA的重组同源性重组为在两个同源序列间进行单链或双链片段的交换。左边为片段重组体（切开的链与原来断裂的链是同一条）右边为拼接重组体E.coli的同源重组RecA蛋白携带单链DNA对双链DNA的入侵RecBCD复合物负责切开双链和对双链进行解旋，有内切酶和外切酶和解旋酶的活性，都需要ATP.还需要DNA连接酶，和RuvC内切酶进行中间体的切割。一旦RecBCD识别出Chi序列，RecBCD核酸酶活性便发生变化，其3’→5’外切酶活性受到抑制，5’→3’外切酶活性被激活，由原来优先降解3’末端链，改变为只降解5’末端链。RecBCD酶活性变化的结果是产生3’末端带有Chi位点的ssDNA。分支迁移由结合在Holliday分支点上的RuvA和RuvB蛋白催化。RuvA以四聚体的形式识别并结合到Holliday分支点上。RuvB蛋白为催化分支迁移的解旋酶.特异位点重组1λ噬菌体DNA的整合通过整合酶识别其与大肠杆菌的重组位点内的相同序列。整合十分高效。反转录病毒的整合酶则将LTR（内含增强子和启动子）整合到宿主。hin基因编码倒位酶hix（为反向重复序列）为特异性的重组位点，这个地方一重组，应该会导致第一个启动子激活，引起hin基因的表达，表达的产物又连到hix位点上，在辅助因子Fis的作用下，h片段倒位。（h片段位于2个hix之间，所以是hix先倒，再倒H片段）磷酸钙转染其原理是借助形成一种DNA-磷酸钙沉淀物，使其粘附于细胞表面，通过细胞的内吞作用而使DNA被细胞捕获。DEAE葡聚糖介导转染DEAE-葡聚糖是阳离子多聚物，它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取，用DEAE-葡聚糖转染成功地应用于瞬时表达的研究，但用于稳定转染却不是十分可靠。电穿孔是功能强大的将核酸、蛋白及其它分子导入多种细胞的高效技术。通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子。脂质体转染显微注射与原核相比，多了真核调控序列，主要是增强子还有真核起始序列还有不是所有整合表达载体都有整合序列。还有多了polyA加尾信号，真核细胞药物抗性基因。单一的黏端连接易产生载体自连和多拷贝现象和DNA片段的反向插入。这时用两种限制性内切酶分别切割载体和目的DNA，形成两个不同的黏性末端就可以避免这种情况的发生，实现定向克隆。α-互补筛选β糖苷酶要在两个片段都存在的情况下才有活性，当外源基因插入，α片段基因完整性破坏，表达失败，所以无法分解底物，使其在IPTG存在的情况下，变成蓝色，故显白色。重组技术应用根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。制备单抗和生长因子等。基因治疗用于治疗单基因病和重症联合免疫缺陷和帕金森病等。基因诊断Southern印记杂交用于诊断基因缺陷Northern印记杂交用于检测mRNA筛选重组DNA的方法1利用标记补救筛选2抗生素标记基因3利用插入失活和插入表达、互补筛选4利用噬菌体的包装特性5限制性内切酶加电泳法6PCR法7

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