生化实验课件

实验一

还原糖的测定（3,5-二硝基水杨酸法）

掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的方法。一、目的单糖和某些寡糖含有游离的醛基或酮基，有还原性，属于还原糖；而多糖和蔗糖等属于非还原性糖。利用多糖能被酸水解为单糖的性质可以通过测定水解后的单糖含量对总糖进行测定。

二、原理还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其他产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物在540nm处有最大吸收，在一定的浓度范围内还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量和总糖的含量。黄色棕红色三、实验器材1.红薯。2.试管1.5cm×15cm(×8)。3.吸管0.2ml(×2)、0.5ml(×2)、1ml(×5)、10ml(×1)。4.水浴锅。5.电陶炉。6.722型（或7220型）分光光度计。7.容量瓶100ml(×3)。8.量筒、研钵、三角烧瓶、玻璃漏斗。9.电子分析天平。四、实验试剂1.标准葡萄糖溶液（1.0mg/ml）：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，溶于蒸馏水并定容至100ml，混匀，4℃冰箱中保存备用。2.3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：将2.5gDNS和150ml2mol/LNaOH溶液，加到250ml含有90g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加2.5g结晶酚和2.5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，存储于棕色瓶中备用。五、操作1.葡萄糖标准曲线的制作取干净试管6支，按下表进行操作。以吸光度作为纵坐标，各标准液浓度（mg/ml）作为横坐标，作图得标准曲线。（用蒸馏水调零点）管号试剂012345标准葡萄糖溶液/ml00.20.40.60.81.0蒸馏水/ml1.00.80.60.40.20DNS试剂/ml2.02.02.02.02.02.0沸水浴中准确煮沸5min，取出，用自来水冷却至室温蒸馏水/ml7.07.07.07.07.07.0葡萄糖浓度/mg/ml00.20.40.60.81.0A540nm用EXCEL作图2.样品中还原糖提取和测定准确称取2g红薯，加蒸馏水约3ml，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约30ml的蒸馏水冲洗研钵2-3次，洗出液也转入三角烧瓶中，于50℃水浴中保温0.5h，不时搅拌，使还原糖浸出。将浸出液（含沉淀）转移到50ml离心管中，于4000r/min下离心5min，上清转入100ml容量瓶中，沉淀用20ml蒸馏水洗一次，再离心，将两次离心的上清液合并，用蒸馏水定容至100ml，混匀，作为还原糖待测液。取1ml进行还原糖的测定。A540nm葡萄糖浓度/mg/ml7.0蒸馏水/ml沸水浴中准确煮沸5min，取出，用自来水冷却至室温2.0DNS试剂/ml0蒸馏水/ml1.0待测溶液/ml还原糖溶液

试剂（用蒸馏水调零点）用公式计算还原糖浓度

二甲氨基萘磺酰氯与氨基酸(多肽、蛋白质）N末端的氨基反应，分别生成有荧光标记的DNS-氨基酸（多肽、蛋白质），可在紫外光照射下发出可见的荧光。灵敏度10-10摩尔。DNS－Cl标记氨基酸N末端DNS化反应胰岛素DNS标记胰岛素N末端用DNS-Cl标记胰岛素两条肽链的N末端

（A链N末端是Gly，B链N末端是Phe）DNS-胰岛素在6.0mol/L的盐酸中水解，释放出带有DNS荧光标记的DNS-Gly和DNS-Phe。（其他的氨基酸残基不带DNS荧光标记）DNS-胰岛素的水解DNS标记氨基酸标准品的N末端用DNS-Cl标记氨基酸标准品的N末端

（本实验只标记Gly和Phe两种氨基酸标准品）聚酰胺薄膜层析

分离原理：各种被分离化合物在展层剂中的溶解度及其与聚酰胺形成氢键能力的大小的不同，决定它们在展层过程中迁移的速度差异。

聚酰胺：己二酸和己二胺的聚合物（分子中含有大量的酰胺基团）nHOOC(CH2)4COOH+nH2N(CH2)6NH2→-HN-CO-(CH2)4-CO-NH(CH2)6NH-CO-己二酸

己二胺

聚酰胺

聚酰胺聚酰胺薄膜聚酰胺薄膜：将聚酰胺均匀涂在涤纶基片上，干燥后制得的薄膜。薄膜含有-CO-和-NH-基团，能与被分离的化合物形成氢键，可以分离酚类、酸类、醌类、硝基及胺基等化合物。Rf值（相对迁移率）A：样品起点C：层析终止时样品的色层中心B：溶剂前沿BC2AC1Rf=AC／AB实验操作1、取1支小试管（试管一定要清洗干净！）

0.2mL胰岛素+0.2mlDNS-Cl2、薄膜封口，40ºC水浴反应20min3、在酒精灯上将液体蒸干DNS-Cl标记胰岛素老师准备！直接点样DNS-胰岛素的水解1、加0.5mL6.0mol/LHCl，封口2、110ºC水解12-18小时3、在电炉上蒸发干液体4、加入0.1mL1.0mol/LHCl1、取2支小试管（试管一定要清洗干净！）

Phe管：0.2mlPhe＋0.2mlDNS-ClGly管：0.2mlGly＋0.2mlDNS-Cl2、薄膜封口，40ºC水浴反应20min3、在酒精灯上将液体蒸干4、各加入0.1mL1.0mol/LHClDNS-Cl标记氨基酸标准品1、将0.1mLDNS-Gly、0.1mLDNS-Phe分别转入做好标记的小离心管中。2、各加入0.1mL乙酸乙酯，盖好盖子，振荡混合后静置萃取2分钟。DNS-氨基酸的萃取取2只0.5mL小塑料离心管，做好标记（Gly、Phe）

点样注意：1、用铅笔轻轻标记点样点2、点样点距薄膜底端1.5cm3、用玻璃毛细管点样展层及结果观察展层剂：甲酸（88%）：水=1.5：100（V/V）

1、展层10-15分钟，等溶剂前沿到达距薄膜顶端1.0cm时，停止展层2、标记溶剂前沿3、干燥薄膜，在紫外线下观察结果预期展层结果展层起点展层方向1.5cm123溶剂前沿在培养皿中倒入5mm高的展层剂，将聚酰胺薄膜用透明胶固定好，放入展层剂中。目的了解酶的专一性掌握检查酶专一性的原理和方法学会排除干扰因素，设计酶学实验实验内容

本实验以唾液淀粉酶（内含淀粉酶及少量麦芽糖酶）、蔗糖酶对淀粉及蔗糖的催化作用，观察淀粉酶、蔗糖酶的底物专一性。原理

酶的专一性是指一种酶只能对一种底物或一类底物起催化作用，对其他底物无催化作用。酶的专一性程度分为：键专一性：只要求作用于一定类型的键，对键两端基团无严格要求。如脂酶、核酶基团专一性：只对键两端一个基团要求严格，如α-、β-葡萄糖苷酶，转移酶绝对专一性：只作用于一种底物，如某些核酸工具酶立体异构专一性：旋光异构专一性和几何异构专一性酶的专一性淀粉直链淀粉:由200-300个α-葡萄糖以α-1，4糖苷键相连成一直链支链淀粉:有α-1，4糖苷键和α-1，6糖苷键，在直链淀粉的基础上形成分支

直链淀粉的相对分子质量比支链淀粉小，直链淀粉的分子是由许多α-D-葡萄糖经过α-1，4-苷键反复连接而成的线状聚合物。直链淀粉

直链淀粉的形状并不是伸展状态的直链，而是有规律的卷曲成螺旋状，每一螺旋圈约有6个葡萄糖结构单位。

直链淀粉遇碘液显蓝色，加热煮沸时颜色消失，冷却后又重新显色。这个反应很灵敏，常用来检验淀粉或碘的存在。

支链淀粉比直链淀粉由更多的D-葡萄糖组成，其连接方式也有所不同。支链淀粉中D-葡萄糖之间以α-1，4苷键连接成主链，每隔20－25个葡萄糖单位便分枝出1个支链，支链上还有分枝，而支链的连接点即分枝处为α-l，6糖苷键。支链淀粉支链淀粉分枝状结构

由α-葡萄糖和β-果糖以α-1，2糖苷键相连而成的双糖蔗糖Benedict反应

Benedict试剂是碱性硫酸铜溶液，具有一定的氧化能力，能与还原性糖的半缩醛羟基发生氧化还原反应，生成氧化亚铜（Cu2O）砖红色沉淀。淀粉和蔗糖都不能反应，而它们的水解产物葡萄糖能够发生Benedict反应，所以，用颜色反应来观察淀粉酶、蔗糖酶对淀粉及蔗糖的水解作用。半缩醛羟基在右边，即与氧环同侧——α-D-葡萄糖；半缩醛羟基在左边，即与氧环异侧——β-D-葡萄糖。

试剂淀粉酶溶液：唾液2mL倒入10mL量筒中（不包括泡沫），用蒸馏水稀释到5mL，静置10分钟后，去掉上层泡沫和下层的沉淀。（自制）蔗糖酶溶液：干酵母1g置研钵中，加半勺石英沙及蒸馏水少许（约4mL），用力研磨10分钟，转移到50mL离心管中，另用25mL蒸馏水洗涤研钵，并将洗涤液一起转移到离心管中，摇匀，静置5分钟，离心(离心前对称放置的两只离心管要等重配平，精确到0.01g)，小心取出上清液（含蔗糖酶）备用。（自制）0.5%淀粉溶液（含0.3%NaCl）（取前摇匀）2%蔗糖溶液Benedict试剂Benedict试剂

在600mL蒸馏水中溶解173g柠檬酸钠和100g无水碳酸钠，冷却后稀释到850mL。在100mL热蒸馏水中溶解17.4g无水硫酸铜。冷却后稀释到150mL。把硫酸铜溶液缓缓倒入柠檬酸钠－碳酸钠溶液中，边加边搅拌，如产生沉淀。要过滤，班氏试剂配制后能长期使用。如存放较久而产生沉淀时，可取上层清液使用，不必重配。实验步骤检查试剂试管1试管2试管30.5%淀粉溶液/mL32%蔗糖溶液/mL3蒸馏水/mL3Benedict试剂/mL222摇匀，沸水煮2分钟观察记录结果原因淀粉酶的专一性试管4试管5试管6稀释的唾液淀粉酶/ml1110.5%淀粉溶液/ml32%蔗糖溶液/ml3蒸馏水/ml3摇匀，37℃保温45分钟Benedict试剂/ml222

摇匀，沸水煮沸2分钟观察记录结果原因蔗糖酶的专一性试管7试管8试管9蔗糖酶溶液/ml1110.5%淀粉溶液/ml32%蔗糖溶液/ml3蒸馏水/ml3摇匀，37℃保温15分钟Benedict试剂/ml222摇匀，沸水煮2分钟观察记录结果原因实验原理真核生物的DNA与组蛋白结合，以DNA核蛋白的形式存在于细胞核内。在提取DNA时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，释放出DNA核蛋白。实验原理在1.4mol/LNaCl中，DNA核蛋白的溶解度大，RNA核蛋白的溶解度小。在0.14mol/LNaCl中，DNA核蛋白溶解度小，RNA核蛋白溶解度大。①氯仿-异戊醇使蛋白质变性，离心除去变性蛋白。②十二烷基硫酸钠（SDS）使蛋白质变性，与核酸分离，从材料中提取出DNA。③苯酚使蛋白变性，离心分层，后者停留在酚层内。去除蛋白质的方法①化学因素：pH4.0-11.0稳定，否则变性降解。②物理因素：DNA是长链线状分子，机械剪切作用会使分子断裂。③酶的作用：DNA酶降解DNA分子。破坏DNA完整结构的因素紫外光吸收法鉴定DNA纯度和浓度核酸的紫外吸收260nm,蛋白质280nmDNA的A260/A280约1.8，RNA的约2.050ug/mLDNA溶液，A260=1.040ug/mLRNA溶液，A260=1.0

实验步骤10mLCTAB提取缓冲液加入50mL离心管中，65℃水浴中预热。50-60g植物叶片，置于预冷的研钵中，倒入液氮，充分研磨10分钟。（全班共用）每组取约2g叶片粉末，加入预热的CTAB提取缓冲液中，轻轻混匀，65℃保温30分钟。加10mL氯仿-异戊醇，振荡2-3分钟。5000rpm离心5分钟。用塑料滴管将上清吸入另一支50mL离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，静置3-5分钟。用玻棒将DNA搅起，置于10mL70％乙醇中浸泡5分钟。（如果沉淀量很少，5000rpm离心，弃上清，乙醇浸泡沉淀。）将DNA沉淀在室温干燥5-8分钟。将DNA沉淀溶于100mLTE缓冲液中。测定A260和A280计算鉴定DNA的纯度和含量试剂CTAB提取液2.0%CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）1.4mol/LNaCl20mmol/LEDTA100mmol/LTris-HCL（pH8.0）

0.2%巯基乙醇

CTABCTAB是阳离子去污剂,能使蛋白质变性，还能与核酸形成特异的核酸-CTAB复合物。核酸-CTAB复合物可溶于≥0.7mol/LNaCl的高盐缓冲液。液氮：研磨氯仿-异戊醇：蛋白质变性异丙醇：沉淀DNA70%乙醇：脱盐TE缓冲液10mmol/LTris-HCl（pH7.4）

维持弱碱性1.0mmol/LEDTA

抑制DNA酶活性限制性内切酶EcoRIRestrictionEnzyme识别序列：

G↓AATTC

CTTAA↓GHindIIIRestrictionEnzyme识别序列：

A↓AGCTT

TTCGA↓A

每一种限制性内切酶都有特定的反应条件

pH范围：7.5~8.0

缓冲液组份:Tris(三羟甲基氨基甲烷）

NaCl、MgCl2、巯基乙醇温度：37℃琼脂糖凝胶电泳

是一种简便、快速的分离纯化和鉴定核酸的方法。

琼脂糖是一种线性多糖聚合物。琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固,会形成良好的电泳介质。电泳

在电场的作用下，在某种支持介质上，将一个混合物分离成若干条区带的过程。琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度(%)线型DNA分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2试剂TBE电泳缓冲液

45mmol/LTris-硼酸，1mmol/LEDTA，pH8.0加样缓冲液

0.25%溴酚蓝（深蓝色，300bp)0.25%xylenecyanloFF（天蓝色，2000bp）40%蔗糖EB（溴化乙锭）染色液（有毒）

0.5ug/ml，用水配制溴化乙锭(ethidiumbromide，EB)是一种扁平分子荧光染料，可嵌入核酸的碱基对之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。电泳结束后，将凝胶浸入0.5ug/ml的EB溶液中染色10min。在紫外光照射下可见核酸电泳带，DNA量一般>5ng。操作步骤酶切反应反应体系

λ－DNA5ul

10xBuffer2ul

HindIII3ulH2O10ul

Total20ul混匀，37度保温30分钟

制胶用电极缓冲液（0.5×TBE）配制0.7%的琼脂糖胶20mL0.14g琼脂糖，20mL0.5×TBE微波炉加热至沸腾，确定琼脂糖完全溶解冷却至60℃左右准备好梳子和胶槽，倒入琼脂糖溶液，冷却凝固点样Sample1自提DNA5ul+2ulLoadingDye

Sample2自提DNA酶切液20ul+4ulLoadingDyeSample3λ-DNA5ul+2ulLoadingDye

Sample4λ-DNA酶切液20ul+4ulLoadingDye

点样：

Sample1和3各7ul

Sample2和4各10ul电泳接通电源，150v电泳0.5小时染色和观察切断电源，取出胶模，将凝胶放入EB染色液中，染色10分钟取出凝胶，紫外灯下观察DNA电泳带型警告EB诱变染色和观察时一定要带手套！

1234

←RNA提示1自提DNA2自提DNA/HindIII

3λ-DNA/HindIII4λ-DNA结果记录与分析绘制电泳图谱λ-DNA/HindIIIMarkerλ-DNA/HindIIIMarker

用HindIII彻底降解λ-DNA贮藏缓冲液：

10mmol/LTris-HCl(pH7.5),10mol/LNaCl,1mol/LEDTA实验原理分离纯化

用热变性、有机溶剂沉淀等方法，从酵母中提取一定纯度的醇脱氢酶。

CH3CH2OH+NAD+CH3CHO+NADH+H+

乙醇过量时，NAD+被还原成NADH的速度与酶活力成正比，NADH在340nm有较强吸收，可测定单位时间内NADH的生成量，确定酶活力。醇脱氢酶醇脱氢酶催化的反应醇脱氢酶可催化醇和醛之间的氧化还原反应，辅酶是NAD+/NADH。实验步骤一、提取纯化酵母醇脱氢酶（一）粗提称酵母粉2g，置研钵中，加半勺石英沙和Na2HPO4溶液5mL，用力研磨10分钟，转入50mL离心管，用20mLNa2HPO4溶液洗研钵，转到离心管中，摇匀，静置5分钟，5000rpm离心5min，取上清液，量取体积V1

，取2个1ml分别于1.5ml离心管中，4℃保存（一管用于测蛋白浓度，一管用于测酶活力），剩余的上清继续下一步纯化。（二）热变性去除杂蛋白

剩余的上清在55℃保温15min，间歇搅拌，冰浴冷却，5000rpm离心5min，取上清，量体积V2，取2个1ml分别于1.5ml离心管中（一管用于测蛋白浓度，一管用于测酶活力）

，4℃保存备用，剩余上清置冰浴中。（三）有机溶剂沉淀杂蛋白

将置于冰浴中上清，加上清体积一半的预冷丙酮，混匀，4℃静置5min，5000rpm，离心5min，取上清，量体积V3，取2个1ml分别于1.5ml离心管中，4℃保存备用（一管用于测蛋白浓度，一管用于测酶活力），剩余上清倒入已置于冰浴中的50ml离心管。（四）有机溶剂沉淀酶蛋白

在上清中按100ml加55ml丙酮的比例，加入预冷丙酮，混匀，静置5min，4℃，5000rpm离心5min。弃上清，沉淀溶于5.0ml0.01mol/LK2HPO4中，体积为V4，取2个1ml分别于1.5ml离心管中（一管用于测蛋白浓度，一管用于测酶活力）

。

1、将前面保存的上清用0.01mol/LK2HPO4稀释第一步、第二、三、四步的酶液各稀释10倍备用2、准备5只试管，编号1-5，加入以下四种试剂3.0M乙醇0.1ml0.06M焦磷酸钠0.5ml0.0015MNAD+0.3ml蒸馏水1.6ml酶活力测定方法3.逐管加入0.2mL已稀释的酶液，混匀后立即测定A340每分钟A340增加0.001为1个活力单位。样品编号A340/min1mL酶原液的酶活(U/mL)V1V2V3V4酶液加入体积：0.2mL酶液稀释倍数：10倍1mL酶原液的酶活=A340*1000*10/0.2酶活定义：每分钟A340增加0.001为1个活力单位。

考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，最大吸收波长在595nm，在0～100μg/ml，吸光度与蛋白质含量成正比。

蛋白质与G-250反应在2min内达到平衡，且稳定，可检测微克级的蛋白质。蛋白质含量测定（Bradford法）

取6个PA瓶，配制0～100μg/ml蛋白液各1.0ml。加5.0mlG-250试剂，混匀，放置2min，在595nm比色，绘制标准曲线。

1、蛋白质标准曲线的制作管号123456蛋白质标准液（ml）00.20.40.60.81蒸馏水（ml）1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝染液555555蛋白质含量（μg）020406080100A595

将样品提取液稀释50倍（参考值），吸取1.0mL放入PA瓶，加5mLG-250试剂，混匀，放置2min，在595nm比色，记录吸光度值，通过标准曲线查得蛋白质含量。2、样品提取液中蛋白质浓度的测定（四）计算（按照测定的数据完成下表）

C=A×BE=A×DF=D/B（或E/C）提纯步骤总体积mlA蛋白浓度(mg/ml)B蛋白总量mgC1mL酶活力（U）D总活力UE比活力(U/mg)F回收率（%）蛋白质G酶总活力H1.粗提22.51.98644.6145032625731.51001002.热变性除杂19.21.1522.081300249601130.449.5176.53.有机溶剂除杂230.46810.764800184001709.424.156.34.有机溶剂沉淀蛋白50.2591.29585042503281.82.913.0

酶的回收率：×100%总活力＝活力单位数/ml酶液X总体积（ml）比活力＝活力单位数/mg蛋白＝总活力/总蛋白mg实验材料、试剂和器材材料：酵母试剂：3.0mol/L乙醇、

0.06mol/L焦磷酸钠（pH8.5）、

0.0015mol/LNAD+、

0.01mol/LK2HPO4、丙酮（预冷）、

0.066mol/LNa2HPO4仪器：离心机、可见光分光光度计、紫外光分光光度计、水浴锅仪器和试剂仪器和用具可见分光光度计，1.0mL加液器，200μL加液器；10mLPA瓶。试剂（1）牛血清白蛋白100μg/mL（标准蛋白质）（2）考马斯亮蓝

100mgG-250溶于50mL90%乙醇，加85%（W/V）磷酸100mL，用水定容到1000mL。实验目的掌握SDS检测蛋白分子量原理和方法掌握垂直板电泳的操作方法实验步骤1、洗净玻璃板，蒸馏水冲洗3遍，吹干并安装电泳槽。2、制作12%分离胶。按下表中所列顺序加试剂，轻轻摇匀，加入两块玻璃板间，高度约玻璃板高度的一半。3、用1mL蒸馏水封住分离胶液面，室温聚合约20min，至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倒掉水层，用滤纸条吸干残余的水。4、倒出水并用滤纸吸干，配好5%浓缩胶，轻轻摇匀，加入浓缩胶，迅速插入样梳，静置约25分钟。

※水封的目的是为了使分离胶上沿平直，并排除气泡。

※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。※样梳需一次平稳插入。梳口处不得有气泡，梳底需水平。12%分离胶试剂名称12%分离胶ddH2O2.5mL30%Acr-Bis(29:1)3.0mL1.5MTris-HCl（pH8.8）2.0mL10%SDS75uLTEMED（加速剂）10uL10%APS（催化剂，最后加）75uL总体积7.5mL分离胶的高度为整个凝胶高度的一半试剂名称5%ddH2O3.4mL30%Acr-Bis（29:1）0.86mL1MTris-HCl（pH6.8）0.62mL10%SDS50uLTEMED20uL10%AP（最后加）50uL总体积5mL5%浓缩胶6、将胶板放入电泳槽，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液，拔掉梳子，液面应该完全没过电极。7、制样：待测蛋白40uL+蓝色的样品缓冲液15uL，在沸水中加热3分钟，以除掉亚稳态聚合7、点样点样孔分别点30ul、15ul和10ul样品，每板胶点20ulMarker（老师准备）。8、80V电泳20-30min，等蛋白进入分离胶后，将电压调节到120V，继续电泳。溴酚蓝接近胶底部时，关闭电源。电泳结束。10、撬开玻璃板，将凝胶做好标记，放在塑料盒内，加入染色液，染色30min左右。(染色液需回收，可反复使用)11、染色后的凝胶用蒸馏水煮沸脱色。（高火微波炉中煮5分钟）实验步骤蛋白质与SDS按1：1.4比例形成复合物，消除了各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。在15-200KD之间，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系：logMW=K-bm实验原理不连续系统:

缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性。

电荷效应、分子筛效应、浓缩效应。连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同。电荷、分子筛效应。（三个不连续性）1、凝胶孔径的不连续性（2种孔径的凝胶）2、缓冲液离子成分及pH值的不连续性（2种缓冲体系，3种pH）：浓缩胶，pH6.8，蛋白质分子的迁移率比Cl-

低，比Gly高。3、电位梯度不连续性：快离子（Cl-

）后面形成高电位梯度区，慢离子（Gly）前面形成低电位梯度区，高电位梯度和低电位梯度之间的地方，形成一个稳定而不断向阳极移动的界面，蛋白质分子在界面处浓缩成一个狭小的中间层。浓缩效应实验结果分析绘制标准曲线：logMW=K-bm

蛋白质区带中心至分离胶上沿距离相对迁移率=

溴酚蓝至分离胶上沿距离

以每个蛋白标准的分子量对数作纵坐标，相对迁移率作横坐标，作标准曲线，然后在计算出待测蛋白的迁移率即可在标准曲线上查出其分子量。实验试剂

低分子量标准蛋白（Mark）

兔磷酸化酶BMW=97400

牛血清白蛋白MW=66200

兔肌动蛋白MW=43000

牛碳酸酐酶MW=31000

胰蛋白酶抑制剂MW=20100

鸡蛋清溶菌酶MW=1440030%丙烯酰胺（Acr）

10%SDS

1.5mol/LpH8.8Tris-HCl缓冲液

1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液

10%过硫酸铵(AP)（现配现用）

TEMED（四甲基乙二胺）

2

样品缓冲液

10

电极缓冲液母液（pH8.3）

染色液实验目的掌握GST亲和层析分离纯化目标蛋白的原理和实验方法（第一部分）掌握SDS检测目标蛋白原理和方法（第二部分）第一部分

GST亲和层析分离纯化目标蛋白亲和层析原理

生物大分子与配体特异非共价可逆结合酶-底物酶-底物类似物（酶的竞争性抑制剂）抗体-抗原激素-受体外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体核酸-互补核苷酸序列（Oligo-dT）亲和层析原理GST亲合层析谷胱甘肽硫转移酶（GST，26kd）谷胱甘肽（GSH）作为配体，共价结合在葡聚糖上，（Sepharose4B）葡聚糖上的GSH与GST结合用还原型GSH洗脱GSTGSH-Sepharose4BGSH-Sepharose4BGSH-Sepharose4B实验步骤一、细胞破碎3600mL诱导后的菌液，离心分装到12只50mL离心管，-20℃保存。（每个班用2管）每管加30mLPBS缓冲液，混匀；超声3S，暂停5S，持续15min；平衡，10000rpm/，5min，离心；取25uL上清，作为分离纯化前的样品；每组分取3-5mL上清液，上柱纯化。二、装GSH-Sepharose4B柱1.清洗和装好层析柱，封闭出口；2.加入2mLPBS；3.取1-2mlGSH-Sepharose4B，加入柱子中；4.打开柱子出口，使PBS缓慢流出。注意：始终保持柱内的液面高于GSH-Sepharose4B

三、纯化目的蛋白1.用5mlPBS缓冲液洗柱床，重复3遍。2.将混合蛋白质溶液2-3mL加到柱子中。3.用5mlPBS缓冲液洗柱子，重复3遍。4.加入1.5ml洗脱液。5.用1.5mL离心管收集洗脱液，每管收集0.3ml（约6滴）,共收集5管。6.PBS缓冲液洗柱子3遍，关闭出口。7.将第3、4管和第5管用于目的蛋白的检测。四、SDS样品制备

0号样：过柱前的蛋白溶液40uL，加10uL5X

上样缓冲液。

3号样：洗脱的蛋白溶液（3号管）40uL，加10uL5X上样缓冲液。

4号样：洗脱的蛋白溶液（4号管）40uL，加10uL5X上样缓冲液。5号样：洗脱的蛋白溶液（5号管）40uL，加10uL5X上样缓冲液。

混匀后在沸水中加热3-5min。03450345M每个样点30微升亲和层析试剂PBS（pH7.4）NaCl（58.5）40g；KCl（74.5）1.0g；KH2PO4（136.09）1.2g；Na2HPO4·12H2O（358.14）18.1g；加水定容到5000mL。亲和层析试剂50mMTris-HCl（pH8.0）Tris（121.14）6.055g，溶于900mL水，用HCl调pH到8.0，用水定容至1000mL。洗脱液还原型谷胱甘肽（307.32）0.15366g，溶于50ml50mMTris-HCl（pH8.0）中。第二部分

SDS检测目标蛋白实验目的掌握SDS检测蛋白原理和方法掌握垂直板电泳的操作方法实验步骤1、洗净玻璃板，蒸馏水冲洗3遍，吹干并安装电泳槽。2、制作12%分离胶。按下表中所列顺序加试剂，轻轻摇匀，加入两块玻璃板间，高度约玻璃板高度的一半。3、用1mL蒸馏水封住分离胶液面，室温聚合约30min，至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倒掉水层，用滤纸条吸干残余的水。4、倒出水并用滤纸吸干，配好5%浓缩胶，轻轻摇匀，加入浓缩胶，迅速插入样梳，静置约30分钟。

※水封的目的是为了使分离胶上沿平直，并排除气泡。

※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。※样梳需一次平稳插入。梳口处不得有气泡，梳底需水平。12%分离胶试剂名称12%分离胶ddH2O2.5mL30%Acr-Bis(29:1)3.0mL1.5MTris-HCl（pH8.8）2.0mL10%SDS75uLTEMED（加速剂）10uL10%APS（催化剂，最后加）75uL总体积7.5mL分离胶的高度为整个凝胶高度的一半试剂名称5%ddH2O3.4mL30%Acr-Bis（29:1）0.86mL1MTris-HCl（pH6.8）0.62mL10%SDS50uLTEMED20uL10%AP（最后加）50uL总体积5mL5%浓缩胶5.将胶板放入电泳槽，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液，拔掉梳子，液面应该完全没过电极。6.点样（Marker和待测蛋白样，加入样品缓冲液）每个点样孔点30uL样品，每板胶点15uLMarker。

加样前，样品在沸水中加热3分钟，以除掉亚稳态聚合7.80V电泳约30min，等蛋白进入分离胶后，将电压调节到120V，继续电泳。溴酚蓝接近胶底部时，关闭电源。电泳结束。实验步骤8、撬开玻璃板，将凝胶做好标记，切除多余的胶，放在塑料盒内，加入染色液，染色30min左右。(染色液需回收，可反复使用)9、染色后的凝胶用蒸馏水煮沸脱色。（高火微波炉中煮5分钟）10、观察实验步骤纯化前纯化后mark实验试剂

低分子量标准蛋白

兔磷酸化酶B97400

牛血清白蛋白66200

兔肌动蛋白43000

牛碳酸酐酶31000

胰蛋白酶抑制剂20100

鸡蛋清溶菌酶14400实验结果分析绘制标准曲线：logMW=K-bm

蛋白质区带中心至分离胶上沿距离相对迁移率=

溴酚蓝至分离胶上沿距离

以每个蛋白标准的分子量对数作纵坐标，相对迁移率作横坐标，作标准曲线，然后在计算出待测蛋白的迁移率即可在标准曲线上查出其分子量。蛋白质与SDS按1：1.4比例形成复合物，消除了各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。在15-200KD之间，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系：logMW=K-bm实验原理不连续系统:

缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性。

电荷效应、分子筛效应、浓缩效应。连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同。电荷、分子筛效应。（三个不连续性）1、凝胶孔径的不连续性（2种孔径的凝胶）2、缓冲液离子成分及pH值的不连续性（2种缓冲体系，3种pH）：浓缩胶，pH6.8，蛋白质分子的迁移率比Cl-

低，比Gly高。3、电位梯度不连续性：快离子（Cl-

）后面形成高电位梯度区，慢离子（Gly）前面形成低电位梯度区，高电位梯度和低电位梯度之间的地方，形成一个稳定而不断向阳极移动的界面，蛋白质分子在界面处浓缩成一个狭小的中间层。浓缩效应SDS试剂1.30%（W/V）凝胶：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰胺（Bis）1.0g，加水到100mL。2.分离胶缓冲液（pH8.8，1.0mol/LTris-HCl）：三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.1g，加约80mL蒸馏水，用1.0mol/LHCl调节pH到8.8，用蒸馏水稀释到100mL。3.浓缩胶缓冲液（1.0mol/LTris-HCl，pH6.8）

Tris12.1g，加约60mL蒸馏水，用1.0mol/LHCl调节pH到6.8，加蒸馏水到100mL。4.10.0%（W/V）SDS5.10.0%（W/V）过硫酸铵（现用现配）6.10X电极缓冲液（pH8.3）：Tris30.3g，Gly144.2g，SDS10.0g，加水到1000mL。（用时稀释10倍）7.蛋白质标准溶液：低分子量蛋白质标准，加200uL水溶解，加50uL上样缓冲液。实验原理SDS转膜结合一抗和二抗显色蛋白质与SDS按1：1.4比例形成复合物，消除了各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。在15-200KD之间，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系：logMW=K-bmSDS实验原理170kd130kd95kd72kd55kd43kd34kd26kd17kd10kd预染markerWesternBlottingWesternBlotting显色原理二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）是过氧化物酶（Peroxidase）的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成棕褐色不溶性产物。样品和抗体大肠杆菌可溶蛋白（含GST蛋白）一抗鼠抗GST抗体二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体实验步骤SDS（每班做8版胶，用4个电泳槽）1、洗净玻璃板，蒸馏水冲洗3遍，吹干并安装电泳槽。3、制作12%分离胶。按下表中所列顺序加试剂，轻轻摇匀，加入两块玻璃板间。4、用1mL蒸馏水封住分离胶液面，室温聚合约15min，至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倒掉水层，用滤纸条吸干残余的水。5、倒出水并用滤纸吸干，配好浓缩胶（10ml），轻轻摇匀，加入浓缩胶，迅速插入样梳，静置约20分钟。

※水封的目的是为了使分离胶上沿平直，并排除气泡。

※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。※样梳需一次平稳插入。梳口处不得有气泡，梳底需水平。12%分离胶试剂名称12%分离胶ddH2O2.5mL30%Acr-Bis(29:1)3.0mL1.5MTris-HCl（pH8.8）2.0mL10%SDS75uLTEMED（加速剂）10uL10%APS（催化剂，最后加）75uL总体积7.5mL试剂名称5%ddH2O3.4mL30%Acr-Bis（29:1）0.86mL1MTris-HCl（pH6.8）0.62mL10%SDS50uLTEMED20uL10%AP（最后加）50uL总体积5mL5%浓缩胶6、将胶板放入电泳槽，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液，拔掉梳子，液面应该完全没过电极。7、点样（待测蛋白样，加入样品缓冲液）每个点样孔点15ul样品，每板胶点5ul预染Marker（预染Marker是有颜色的，可以作为电泳和转膜的指示）。

加样前，样品在沸水中加热3分钟，以除掉亚稳态聚合8、80V电泳20min，等蛋白进入分离胶后，将电压调节到120V，电泳2h。9、溴酚蓝接近胶底部时，关闭电源。电泳结束10、撬开玻璃板，根据预染Marker和溴酚蓝的位置切去浓缩胶和多余的分离胶，（不要染色）SDSSDS样品制备

0号样：未纯化的蛋白溶液20uL，加5uL5×上样缓冲液。

1号样：纯化的蛋白溶液20uL，加5uL5×上样缓冲液。混匀后在沸水中加热3-5min。12345678910预染marker未纯化15uL纯化15uL未纯化10uL纯化10uL1、用尺量出胶的长度和宽度

2、用裁纸刀裁出12张与胶大小一样的滤纸和1张同样大小硝酸纤维素膜（NC膜）