不同温度对长白猪精液品质的影响

不同温度对长白猪精液品质的影响摘要采集健康状况良好饲养条件完全一致的长白猪公猪精液，分别在20℃，25℃，30℃，35℃四个温度条件下，以精子色泽、气味、精子活力、精子活率、精子密度、畸形率、精子直线速率和鞭打频率为重要指标对精液品质进行测评研究。与标准指标进行类比，以及不同温度之间的差异性比较。实验得出不同温度下对长白猪公猪精液品质的影响，从而分析出精液最适宜保存的温度范围。实验结果表明：在四个温度条件下，精液的色泽未出现不同的现象；随着温度的升高，精液气味变的浓烈，有明显腥味。在25℃时精液各指标的品质最好；当温度大于25℃后，精子活力和精子活率降低，畸形率增加，精子密度等品质明显降低；在20℃和25℃之间，不存在明显差异；35℃温度处理的精液与其他温度之间都存在极显著性差异。超过30℃后的精子活率大幅度下降，温度越高对精液的影响越大。关键词：精液品质；温度；精子活力；畸形率

目录TOC\o"1-3"\h\u18189引言 引言随着国内养猪业越来越现代工业化的发展，人工授精技术的普及率在大型养殖场中超过80％，猪精液已经成为一个畜用商品流通[1]，因此在生产实践中对精液品质的要求也更加重视起来。精液品质反应的是公猪的繁殖能力，公猪的繁殖能力的好坏直接关系到母猪的受胎率和产子数量。品质优秀的精液可以使母猪受胎率和产子数达到理想状态，提高猪群品质[2]，同时作为种公猪选种和品种改良的重要标准。俗话说：“母猪好好一窝，公猪好好一坡”，由此可看出精液品质的好坏对猪场的生产成绩和经济效益有着严重影响[3]。人工授精技术的普及以及对精液品质的重视随之带来的是公猪精液的保存以及运输流通等多方面的问题。精液的保存受许多因素影响，其中温度是其中极为重要的因素。精子在体外保存的过程中受到外界低温或高温的打击下，会出现冷休克或热应激的现象，造成精子细胞结构破坏，内容物流失，导致受精能力下降[4][5]。根据研究表明，精液在常温条件下较为适宜保存，但是由于在常温环境中也同样适合绝大多数的微生物细菌迅速大量生长繁殖，精液被污染几率增加；在常温环境中大量的微生物生长繁殖会影响精液的品质质量，因此在采集流程和运输保存中，最大程度降低微生物对精液质量的影响[6]。同时由于温度会影响蛋白质活性，某些微生物也具有分解蛋白质的作用。因此在不同温度下，精液的品质所受的影响也是不同的，精子的保存时长和存活率也存在差异。本研究的选取国外瘦肉型品种长白猪为动物模型，研究比较不同温度下长白猪精液质量参数，以探究长白猪精液保存的最适温度。从而为公猪精液的适宜保存温度和运输流通条件提供可参考的数据。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物从安徽省浩宇牧业有限公司选择健康状况良好饲养条件完全一致的2-3岁长白公猪4头，每头公猪每隔三天采集精液一次，每头猪采精3次，在12天内连续完成采精。将采集好的精液经过精液稀释剂同比例稀释后在保温箱里送回实验室，稀释好的公猪精液于17度恒温箱中保存。1.1.2主要试验器材表1主要试验仪器设备仪器厂家型号水浴锅显微镜上海一恒科学仪器有限公司OSE-PROIII计算机辅助精子分析系统纯水仪迈朗重庆艾科浦ML-117AJC-0501-P1.1.3主要试验试剂表2主要试验试剂试剂厂家货号25.4*76.2mm全透明载玻片（帆船）24*24mm标准级盖玻片（世泰）1xPBS缓冲液(PH=7.3+0.1)伊红Y(水溶)milliporemilliporeSolarbioTherm（Fermentas）710110212424CP1020E80901.2实验方法1.2.1精液稀释利用美国WIM长效猪精液稀释粉对猪精液进行稀释。方法是：将一包稀释粉溶解于1000ml预热双蒸水中，搅拌25分钟直至完全溶解。将稀释液放入37度的水浴锅中静置预温1小时，使稀释液的PH值达到稳定状态。采集到的猪精液应在20分钟内稀释完。稀释时，精液与稀释液温度差应不超过1度。根据精子浓度和质量1：1的方法进行稀释，调整浓度大小在合适范围。把稀释好的精液应储存在17度恒温箱中。储存精子需要每12小时进行一次混合，以防止精子沉淀和死亡。把稀释好的精液立即用恒温冰箱送至实验室备用。1.2.2设置温度本实验设置20℃，25℃，30℃，35℃四个不同的温度梯度，水温稳定后，将稀释好的公猪精液利用移液枪取2ML至离心管中，放置于漂浮板上水浴中2个小时后，立即利用计算机辅助精子分析系统进行精液质量指标测定。1.2.3精液感官测定的方法正常的精液呈乳白色，无杂色，略带腥味，无其他恶臭味；若出现血腥味，臭味，其他颜色则为异常精液。不正常的精液的色泽和气味都会发生变化，其中一项发生变化另外一项也会随之变化，因此色泽和气味总是同时检测，利用检测人员的视觉和嗅觉进行直接观察得出结果。1.2.4精液密度的测定方法合格的公猪精液密度在0.8亿/ml以上，精液密度测定的方法有两种：估测法：用400倍显微景观察再进行估测；计数法：用血红球计数器进行计数得出。1.2.5精子活率的测定方法：精子活率的高低作为精液品质评定的重要指标之一，精子活率与精子的受精成功率密切相关[7]。精子活率指呈直线运动前进的精子数量占总的精子数量的百分比，精子活率是反应精子正常存活的精子数量。通过计算机辅助精子分析系统（CASA）进行测定。1.2.6精子活力的测定方法精子活力指精子的运动能力，是鉴定精液品质的指标之一,按照《种猪常温精液》（GB23238-2009）国家标准对精子活力得要求，正常精子活力≥60％[8]。同样通过使用计算机辅助精子分析系统进行测定。1.2.7精子的直线速率和鞭打频率的测定方法精子正常的运动特征为直线运动，保持持续的直线运动以及直线运动时的速率对母猪的受胎率和妊娠率有很大的影响[9-10]精子直线速率是反应精子活力的指标之一，指精子在观察的单位时间内从运动起始点到终点的直线运动距离。鞭打频率同样作为反应精子活力的一个指标，展现的是精子运动能力的强弱。两个指标同样利用计算机辅助精子分析系统进行测定。1.2.8精子畸形率的测定方法畸形率指的是精液中异常精子数占精子总数的百分比，它间接反映了精子的受精能力。正常情况下，精子畸形率不超过18％，畸形率过大会降低受胎率。实验中利用伊红溶液进行染色镜检法进行测定。具体步骤如下：用移液枪取10ul精液均匀的涂抹在玻片，待自然晾干。用移液枪取配置好的50%的甲醇溶液适量，固定5min，待自然晾干。用移液枪取适量0.5%伊红染液染色5min。用1xPBS缓慢冲洗载玻片，等风干后，立即放显微镜下观察。镜检随机读取3-5个视野内的精子畸形率后求平均数。2结果与分析2.1不同温度下长白猪精液品质的差异分析2.1.1气味精液气味在20℃和25℃的气味是较浓的清新腥味，无其他异味；当温度达到30℃时精液腥味开始变淡；达到35℃时，精液腥味已经难以嗅到。经过实验结果表明，随着温度的增大精液气味的浓度开始降低，由于高温能使蛋白质变性的原理，加热温度升高破坏了精液中的蛋白质，从而使得精液气味变淡。精液气味浓度与精液品质的好坏有关，腥味越浓，品质越好。在20℃和25℃条件处理下的精液气味最浓，此时品质最好。2.1.2色泽四个温度下精液的色泽均为乳白色，没有肉眼可观察到的颜色变化。精液的色泽在短期的加热条件下没有受到影响，有实验结果表明短时间内精液的色泽不能反应精液品质的变化。则次实验中色泽不能作为评定精液品质指标。2.1.3精液的密度根据P＞0.05代表差异不显著，0.05＞P＞0.01代表差异显著，P＜0.01代表差异极显著。由表2-1可知，20℃分别与25℃和30℃之间的精子密度存在差异显著（0.05＞P＞0.01）；20℃与35℃之间的精子密度存在差异极显著（P＜0.01）；25℃分别与30℃和35℃之间的精子密度存在差异极显著（P＜0.01）；30℃与35℃之间的精子密度存在差异显著（0.05＞P＞0.01）由图2-1可知从20℃到25℃的精子密度加大（0.05＞P＞0.01）；当温度超过25℃后精子密度开始极速下降，精子密度越来越稀。结果表明随着温度的增加，每个温度之间都存在不同显著性的差异，从而得知温度对精子密度存在影响，且在这四个温度条件下，25℃时精子密度最大。表2-1不同温度下精子密度的差异性（P）温度/℃20253035200.0450.019＜0.001250.045＜0.001＜0.001300.019＜0.0010.02335＜0.001＜0.0010.023*平均值差值的显著性水平为0.05。注：根据P＞0.05代表差异不显著，0.05＞P＞0.01代表差异显著，P＜0.01代表差异极显著，以下表2-2~7同。同列大、小写字母分别表示在1%、5%水平上的差异显著性，字母相同则不显著，不同则显著。图2-1不同温度下精子密度柱状图由表2-2可知，在25℃下精子密度为中；20℃时精子密度中偏稀；当温度达到30℃和35℃时精子密度为稀。当温度超过25℃后，随着温度是升高精子密度降低；由于温度升高，导致精子的某些蛋白质变性精子活力激烈而死亡[2]。20℃到25℃时，精子密度增加；由于适当的温度增加促进了精子活力。表2-2不同温度下精子密度温度/℃密度20中偏稀25中30稀35稀2.1.4精子的活力由表2-3可知，20℃分别与25℃和30℃之间的精子活力差异不显著（P＞0.05）；20℃与35℃之间的精子活力存在差异极显著(P＜0.01)；25℃分别与30℃和35℃之间的精子活力存在差异极显著（P＜0.01）；30℃与35℃之间的精子活力存在差异极显著（P＜0.01）。由图2-2可知，在25℃的精子活力水平高于20℃(P＞0.05），在25℃时的精子活力表达水平高于30℃和35℃（P＜0.01）。即当温度超过25℃时，精子活力呈下降趋势，逐渐下降。从而可知在25℃温度下的精子活力是最好的状态。但20℃与25℃存在显著性不差异，表明在20℃下的精子活力与25℃时的品质相差不大。结果表明温度对精子活力存在影响，在25℃和20℃时之间温度的影响较小，超过25℃后温度影响愈加强烈。表2-3不同温度下精子活力的差异性（P）温度/℃20253035200.0670.150＜0.001250.0670.004＜0.001300.1500.004＜0.00135＜0.001＜0.001＜0.001*平均值差值的显著性水平为0.05。同列大、小写字母分别表示在1%、5%水平上的差异显著性，字母相同则不显著，不同则显著。图2-2不同温度下精子活力曲线图2.1.5精子的活率由表2-4可知，在20℃与25℃之间的精子活率存在差异不显著（P＞0.05）；20℃与30℃之间的活率存在差异不显著（P＞0.05）；20℃和35℃之间精子活率存在差异极显著（P＜0.01）；25℃和30℃之间的精子活率存在差异显著（0.05＞P＞0.01）；25℃与35℃间的精子活率存在差异极显著（P＜0.01）；30℃与35℃之间的精子活率存在差异极显著（P＜0.01）。由图2-3可知，25℃时的精子活率水平稍微高于20℃的（P＞0.05）；当温度大于25℃，精子活率开始逐渐下降，且温度越高下降越快（P＜0.01），温度越高精子活率越小。在20℃升高到25℃过程中，精子活率在不断增大，精子活率品质在此温度时最好。实验结果表明适当的增加温度可以使得精子活动增强，从而使得精子的活率有一定程度的增大；当温度升高超过一定的限额会严重影响精子的活率，过高的温度可能使精子的某些蛋白质变性从而使得精子死亡，降低了精子活率。温度对精子活率存在影响，，温度越高越明显。表2-4不同温度下精子活率的差异性（P）温度/℃20253035200.5020.079＜0.001250.5020.023＜0.001300.0790.0230.00335＜0.001＜0.0010.003*平均值差值的显著性水平为0.05。同列大、小写字母分别表示在1%、5%水平上的差异显著性，字母相同则不显著，不同则显著。图2-3不同温度下精子活率的曲线图2.1.6精子的直线速率由表2-5可知在20℃和25℃之间的精子直线速率存在差异显著（0.05＞P＞0.01）；在20℃与30℃之间的精子直线速率存在差异不显著（P＞0.05）；20℃与35℃之间的直线速率存在差异极显著（P＜0.01）；在25℃和30℃之间的直线速率存在差异极显著（P＜0.01）；在25℃和35℃之间的精子直线速率存在差异极显著（P＜0.01）；在30℃和35℃之间的精子直线速率存在差异显著（0.05＞P＞0.01）。在图2-4中，25℃的精子直线速率比20℃的直线速度高（0.05＞P＞0.01）呈现直线速率加快的现象；30℃的直线速率低于25℃的直线速率（P＜0.01），35℃的直线速率低于30℃（0.05＞P＞0.01），由此可得出当温度超过25℃时，精子直线速率成递减趋势，温度越高精子运动的直线速率越低。试验结果表明，温度对精子的直线速率存在一定的影响，当温度变动时，精子的直线速率也随之发生变动，在20℃升高至25℃的过程中，精子的直线速率在不断增大，在25℃时达到最快，可知适当的增加温度可以刺激精子活动增强，致使精子直线速率变快；温度超过25℃后，精子直线速率降低，意味着当温度超过适宜的限度时，使得精子某些蛋白变性、裂解，导致精子失去运动能力或死亡的现象，精子直线速率因此下降。表2-5不同温度下精子直线速率的差异性（P）温度/℃20253035200.030.0630.001250.030.001＜0.001300.0630.0010.048350.001＜0.0010.048*平均值差值的显著性水平为0.05。同列大、小写字母分别表示在1%、5%水平上的差异显著性，字母相同则不显著，不同则显著。图2-4不同温度下精子直线速率曲线图2.1.7精子的鞭打频率由表2-6可知，在20℃和25℃之间的精子的鞭打频率差异极显著（P＜0.01）；20℃和30℃之间的精子鞭打频率差异极显著（P＜0.01）；20℃和35℃之间的精子鞭打频率差异极显著（P＜0.01）；25℃和30℃之间的精子鞭打频率差异极显著（P＜0.01）；25℃和35℃之间的精子鞭打频率差异极显著（P＜0.01）；30℃和35℃之间的精子鞭打频率差异极显著（P＜0.01）。实验结果表明温度对精子鞭打效率影响较大，随温度的变化精子的鞭打效率也发生较大的变化。由图2-5可知，25℃的鞭打频率高于20℃阶段（P＜0.01），精子的鞭打频率加快；30℃与35℃的精子的鞭打频率分别低于20℃（P＜0.01）、25℃（P＜0.01）；35℃的鞭打频率低于30℃（P＜0.01）。试验结果表明，在20℃到25℃时精子的鞭打频率加快，可知适宜的范围内增加温度可促进精子的运动强度从而增大精子鞭打频率；当温度超过25℃时，精子的鞭打频率下降，温度越高精子的鞭打频率越低。由此推测精子鞭打速率最快的温度是25℃，温度超过精子运动的适宜温度范围，高温导致精子的蛋白质变性、裂解，造成精子活动异常甚至死亡，导致精子鞭打频率降低。表2-6不同温度下精子鞭打频率的差异性（P）温度/℃20253035200.009＜0.001＜0.001250.009＜0.001＜0.00130＜0.001＜0.001＜0.00135＜0.001＜0.0010.001*平均值差值的显著性水平为0.05。同列大、小写字母分别表示在1%、5%水平上的差异显著性，字母相同则不显著，不同则显著。图2-5不同温度下精子鞭打频率的曲线图2.1.8精子的畸形率由表2-7可知在20℃与25℃之间的精子畸形率存在差异不显著（P＞0.05）；20℃与30℃之间的精子畸形率存在差异显著（0.05＞P＞0.01）；20℃与35℃存在差异极显著（P＜0.01）；25℃与30℃之间的精子畸形率存在差异极显著（P＜0.01）；25℃与35℃之间的精子畸形率存在差异极显著（P＜0.01）；30℃与35℃之间的精子畸形率存在差异极显著（P＜0.01）。结果表明在精液在常温范围内的温度变化对精子的畸形率影响效果不明显，当温度超出常温范围后，不同温度之间得精子畸形率差异性显著，可知温度对精子畸形率存在严重影响。由图2-6可知，25℃的精子畸形率低于20℃的畸形率（P＞0.05）；当温度大于25℃后精子的畸形率快速升高，30℃的畸形率远远高于25℃（P＜0.01）；35℃的畸形率高于30℃（P＜0.01）。结果表明，在25℃时精子的畸形率较低，且20℃和25℃两温度之间存在差异不显著，表明在适宜温度范围内精子畸形率差异不大，当温度超过25℃后，精子畸形率逐渐增大，温度越高畸形率越大。常温条件下适宜精子存活维持正常形态结构，当温度超过适宜温度的限度时，随着温度的不断升高畸形率也在持续的增加。畸形率的增加使得公猪精液品质下降，导致母猪受精情况不理想，增大空怀率，造成经济损失。表2-7不同温度下精子畸形率的差异性（P）温度/℃20253035200.2230.030＜0.001250.2230.003＜0.001300.0300.0030.00435＜0.001＜0.0010.004*平均值差值的显著性水平为0.05。同列大、小写字母分别表示在1%、5%水平上的差异显著性，字母相同则不显著，不同则显著。图2-6不同温度下精子畸形率的曲线图3讨论3.1精液品质检测目的精液检测的目的是为了能准确的确定公猪精液中精子的活力，活率，密度和畸形率等指标，从而确保精子的有效数量和质量，提高工作效率,保证输精质量,及时淘汰不合格精液,减少了因精液质量差而引起的空怀[11]，从而提高受胎率。3.2影响精液品质的因素在自然条件下，影响精液质量的因素有很多，分为自身因素和外界因素。自身因素包括：公猪品种，个体和年龄，公猪的健康状况；环境因素包括：饲料的营养水平的高低，采精技术，采精频率，季节和温度。在外界因素中温度对公猪精液品质的影响较为明显。精液品质对温度的变化敏感,温度升高产生的热应激使大量精子外膜受到损害,造成蛋白质变性,引发精子大量死亡;故随温度升高,精液的活力、精子密度、存活率均明显降低[12]，精子的直线速率和鞭打频率也会降低，同时精子的畸形率升高。当精子的精液品质下降到一定程度时会严重影响到人工授精的成功率，出现空怀的现象降低受胎率。造成养殖场的无效工作流程，降低了经济效益，不利于养殖场的经济发展。由此可知在日常生产实践中，无论是畜禽在养殖场生产过程中的环境温度还是精液采集、储存、流通以及输精时的温度都应该被十分重视[13]，保持在精子存放最适宜的温度条件下。从而确保精液的品质在适宜授精的状态，保证良好的受胎率。在本次实验设置的四个温度条件中，25℃时的精液各方面品质最为良好；20℃时与25℃处理下的精液品质差异性较小，此两个温度都在精子适宜的温度范围中，由此说明在适宜温度范围内精子的精液品质较为良好；超过25℃后，精液各方面品质开始变差，达到不适合授精状态。3.3不同温度下对长白猪精液品质的影响温度的变化对长白猪精液品质有明显的影响效果，在不同温度下精液品质会产生差异性，本次实验结果中表明:在四个不同温度的条件作用下,精液的色泽均为乳白色，没有肉眼可观察到的颜色变化；温度在20℃和25℃时，精液气味是较为浓烈的腥味儿，无其他异味存在，当温度超过25℃时后，精液的腥味开始变得越来越淡，随着温度的升高，精液气味的浓度开始降低。当温度在20℃和25℃时，各个精液品质指标之间的差异相差不大，当温度超过25℃后，精子活力和精子活率降低，畸形率增加，精子密度，直线速率等精液品质指标明显下降。在25℃、30℃、35℃三个温度条件下的精子活力，畸形率，精子密度和精子活率等指标都存在变化差异均极显著(P<0.01)，在这三个不同温度的影响下的精液品质,随着温度升高,精液的各项指标表现得越来越差,在20℃和25℃两个温度作用下时，绝大部分的精液品质指标之间存在差异性变化不显著，说明在常温范围内的温度下对精液品质的影响作用较小，且在25℃时长白猪精液质量指标最好。最终总结得出，在25℃的长白猪精液质量整体表现最好。3.4生产实践中保证精液品质日常生产活动包括公猪精液的采集，储存；精液的运输流通；输精等。为了保证精液的品质，提高受胎率，我们应该注重精液的保存方式。常温保存作为短期保存中对精液品质影响较小且设备简单的一种方式，由于常温条件也有利于微生物的生长繁殖并且为了较长时间的在体外进行储存精液需要在合适的范围内降低精子的代谢活性，因此在常温保存的方法中常常伴随着使用稀释剂[14-15]，作为抑制微生物生长繁殖，提供精子所需营养和保护的物质，同时也隔绝了氧气的进入。使得在体外的精子也能保持在一个可逆的静止状态，同时具有良好的受精能力。采精和输精过程中要确保实用工具完备且无菌干净，精子达到最好的复苏状态；在进行常温储存时，稀释后进行分装，分装后的精液不能叠放，在外放置一个小个小时左右在放进常温的恒温箱内进行储存。精液在运输过程中使用车载恒温箱，温度控制在15℃-25℃之间，转接过程中注意温度的控制以保证精液的你良好品质。本次研究的目的是为了给公猪精液常温保存条件和流通运输环节中提供有益的可参考的数据，为了保证公猪精液在流通运输环节中保留良好的精液品质，减少环境温度变化对精液品质的影响,防止降低受胎率。可采用下面的措施：第一：对采集好的精液用规定的稀释液进行稀释并科学妥当的存放；第二：在打包精液时，要放置防潮、防震荡的护垫,最大程度的避免运输过程中发生猛烈的震动和碰撞，包装工具要保证干净，进行消毒。第三：使用车载恒温箱将温度控制在15℃-25℃之间，避免温度低于或者超过精液适宜存放的常温温度范围，从而影响精液的品质，降低受胎率。第四：在高温酷热天气环境下，采用干冰等物品对车厢温度进行降温，减少由于温度的升高对精液品质的影响。第四：需要把控运输时长，运输时间过长会对母猪受胎率造成影响。精液在进行授精前被运输的时间不超过3天[16]。4结论在四个温度条件下，精液的色泽没有明显变化；精液气味随着温度的升高逐渐浓烈，可嗅到明显腥味；在25℃时精液品质的各指标参数最好；温度超过25℃，精子活力、精子活率、精子密度、直线速率和鞭打频率的参数明显降低，精液的畸形率大大升高。在20℃到25℃属于精液适宜温度范围，超过适宜温度范围后对精液品质有严重不良影响，且温度越高对精液的影响越大。

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