白酒酿造过程中酵母菌的研究进展

.引言在中国历史的发展过程中，白酒的酿造是一颗璀璨的明珠，意义深远。酿造白酒的主要原材料是粮谷类物质，正是由于其中饱含的淀粉质而得以进行发酵，后续再酿酒的过程中是可以采用一些酒母作为一种发酵剂的，为粮谷类物质其中的糖化物质进行充分的发酵[1]。白酒的酿造形式也多种多样，包括固态、半固态和液态等多种的发酵方式。最后还需要经过煮沸、发酵、调兑、密封等工序才可以形成蒸馏酒，白酒是世界七大蒸馏酒之一，具体介绍，百度百科上有介绍。在酿造白酒的过程中，自然是离不开各种各样的酵母菌。不同的酵母菌在酿造白酒的过程中都产生着不可替代的作用，必不可少。这种酵母菌包括了自然环境中自己生长的，也包括一些人为加入的高纯度的酵母菌。其中，曲饼在一定条件下，自然发酵的是自然酵母菌；还有对白酒有必要加入产香菌、产酒菌等酵母菌[2]。在酿造白酒的过程中，有许多因素都会影响到白酒的口味，如酵母菌的数目、种类、分布等诸多因素。由于酵母菌在白酒的酿造过程中占有重要的地位，并且对于白酒的口味影响较大，因此，研究在白酒酿造过程中酵母菌的变化具有重大意义。从酵母菌的研究入手，深入分析白酒发酵的实质，同时结合现代分子学技术对白酒中的微生物进行探索，意义重大[3]。2.酵母菌简介酵母菌(Saccharomycetes)属于单细胞真菌，归类为兼性厌氧菌，喜生活于含糖量较高的酸环境[4]。酵母体内含有丰富的蛋白质，特别是含有13种酶系蔗糖酶、麦芽糖酶、己糖磷酸化酶、脱羧酶、脱氢酶、氧化酶醛缩酶等，生理活性物质如辅酶烟酰胺氧化还原酶、辅酶CoA脱羧酶、辅酶Q、细胞色素C呼吸链的重要成分、还原型谷胱甘肽和RNA核酶等；同时具备人体所必需的8种必需氨基酸B族维生素B3-B，和B，)、维生素D原碳水化合物、粗纤维素、脂肪矿质元素和微量元素等[5]。2.1酵母菌的分类酵母在酿酒中起着重要的作用。酵母以出芽繁殖为主，在高温大曲中主要起酿酒和酯化作用。根据酵母的种类，大曲的风格也会发生变化。进而影响白酒的品质和风格。酿酒酵母在葡萄酒酿造中的作用分为产酒酵母和产脂酵母。酿酒酵母一般具有较高的酿造能力和较强的发酵能力。产脂酵母的发酵能力没有产酒酵母的发酵能力强，但是它具有产香的能力，在酶系统的作用下，将酶醇酸转化成为酸酯化合物，这种物质具有增香的能力，让酒体的芳香更加的浓厚，正是因为这样，产脂酵母也可以被称为产香酵母[6]。通过研究发现，酵母菌不仅仅有产酒和产香的能力，还有许多能力可以被挖掘，比如产酶能力和产醇能力。合理运用酵母菌的这些能力可以提高白酒的产量及浓厚的酒香味[7]。2.1.1产酒酵母菌在实际的白酒酿造中，产酒酵母的发酵能力会受到多种因素的影响，有研究者通过实验发现，影响酒精酵母发酵效果的因素有温度、通风、pH、尿素、糖比例等[8]。目前研究学者们已发现众多高产酒精的产酒酵母，同时还在不断通过筛选鉴定或者基因重组等手段，寻找更高产酒效率的酵母菌，发掘酒精生产潜力[9]。2.1.2产酯酵母菌产酯酵母是一类在发酵过程中能够产生酯类物质的酵母菌的总称，产酯酵母主要通过在代谢中产生的酶，将发酵液中的醇、糖、酸等物质转化为酯、醛和芳香物质[10]。不同品种的酒曲，不同发酵条件，因为产酯的种类和数量不一样，所以酒的风味也不相同。和产酒酵母一样，酿酒行业和微生物工程行业的研究者们都致力于发掘各种产生白酒特征风味物质的产酯酵母[11]。3.酵母菌的生长及理化特性3.1生长特性酵母菌属于单细胞厌氧生物，作为一种发酵真菌，在没有氧气的情况下，通过酵母菌将发酵物中的糖性物质转化为酒精，酵母菌是无害生物，无论是在有氧环境下还是无氧环境下均可生存，可以无限繁殖，和真菌相同的是它具有细胞核和细胞壁等关键性的组织，生存形态有多种，其中以球形形态和椭圆形形态为主[12]。酵母菌与细菌的形态特征相似，菌落的颜色是乳白色为主，内部含水量较多，表面比较黏稠，柔软，质地均匀，但是在个头上比细菌大许多，超过1-20微米，由于没有鞭毛这一组织，酵母菌无法游动。一般情况下，酵母菌喜欢生活在多糖的环境下，所以在水果和多糖的植物上可以检测到酵母菌的存在[13]。3.1.1温度对酵母菌生长情况影响刘建学等人采用YDP液体培养法，以OD600nm为评价指标对所筛选酵母菌株受不同温度影响时菌株的生长情况进行了深入研究，结果表明：当温度为30~40℃时，菌株W5生长状况优于菌株Y1和M3，但在温度为40℃时三者生长受到抑制(OD600nm值〈0.5)，说明菌株W5具有一定的耐温性[14]。在浓香型白酒发酵过程中，发酵温度需控制在30~40℃，这样浓香型白酒的酒质才能得到保障。3.1.2pH对酵母菌生长情况影响刘建学等人采用YDP液体培养法，以OD600nm为评价指标对所筛选酵母菌株受不同pH影响时菌株的生长情况进行了深入研究，结果表明：3株母菌株都有良好的pH耐受性、当pH为3.5时，3株酵母菌株都能正常生长，随着酸度的增加，酵母菌的生长状况相对减弱了，但生物活性仍能保持[15]。菌株W5的生长状况优于菌株Y1和菌株M3。浓香型白酒的发酵环境是酸性的，主要原因是产酸微生物的作用。具有良好pH耐受性的酵母可使白酒发酵效果更好[16]。3.1.3乙醇浓度对酵母菌生长情况的影响刘建学等人采用YDP液体培养法，以OD600nm为评价指标对所筛选酵母菌株受不同乙醇浓度影响时菌株的生长情况进行了深入研究，研究表明：在乙醇含量为12%时，3株酵母菌的生长都受到抑制(OD600mm<0.5)；乙醇浓度为6%~10%时菌株W5的生长状况优于菌株Y1和W5，说明菌株W5具有一定的乙醇耐受性[17]。3.2酵母菌的理化特性3.2.1耐乙醇性黄志国等人采用YDP液体培养法，以OD600nm为评价指标对两种酵母菌的耐乙醇性展开了深入研究，结果表明：发现两种酵母菌在不同乙醇浓度下变化趋势基本一致，OD值逐渐减小并趋近于0。[18]当乙醇体积分数为0~5%时，两种酵母的OD值均显著降低。NZ3和NZ4的OD值分别约为0.1和0.5，当乙醇体积分数为5%~11%时，N23的OD值变化较小，在乙醇体积分数为11%时，N23的OD值变为0。当乙醇体积分数为5%~7%时，NZ4的OD值大幅下降，当乙醇体积分数为7%~11%时，NZ4的OD值继续下降，趋于0[19]。同样的生长条件下，nz4的OD值比nz3的更大，说明nz4的乙醇耐受性比nz3的更好[20]。3.2.2耐温性黄志国等人采用YDP液体培养法，以OD600nm为评价指标对两种酵母菌的耐温性展开了深入研究，结果表明：两种酵母菌的OD值变化趋势一致，均先升高后降低[21]。当温度为20~29℃时，两种酵母菌的OD值持续上升，在29℃时达最大值，且nz4的增长幅度更大；当温度为29~44℃时，两种酵母菌的OD值持续下降，nz3的下降幅度较大，在44℃时接近0，nz4在29~38℃时下降幅度较小，在38℃后急剧下降，44℃时接近0[22]。同样的生长环境下，nz4的OD值高于nz3，因此nz4的耐温性更好。3.2.3耐酸性黄志国等人采用YDP液体培养法，以OD600nm为评价指标对两种酵母菌的耐酸性展开深入研究，结果表明两种酵母菌的OD值变化趋势一致，均先平稳后上升再下降[23]。当pH为2.0~3.5时.n23的OD值是pH3.0开始大幅度上升，在pH3.5时汰1.4左右，nz4的OD值从pH2.0开始急剧增长，在pH3.5时达1.8左右；当pH为3.5~5.5时，nz3的OD值仍在增长，从1.4增长至1.6左右，而nz4的增长幅度较小，变化趋于平缓，在pH5.5时达最大值1.9；当pH从5.5增加至6.0时，两种酵母菌的OD值均下降至1.6左右[24]。4.白酒发酵体系中酵母菌多样性的研究4.1白酒大曲酵母多样性茅台酒厂技术中心在2001-2006年对茅台酒制曲发酵过程中微生物的消长规律做了系统的研究，共分离到了18种酵母，包括假丝酵母、丝孢酵母、汉逊酵母、异常汉逊酵母、毕赤酵母、红酵母、拟内孢霉、白地霉等酵母[25]。还从酱香大曲中还分离到了伯顿毕赤酵母、扣囊复膜酵母、东方伊萨酵母、异常毕赤酵母、酿酒酵母、汉逊德巴利酵母等[26]。4.2白酒堆积酒醅中酵母多样性通过对茅台酒厂堆积酒醅进行研究，已经分离到了酿酒酵母、克鲁斯假丝酵母、汉逊酵母、异常汉逊酵母、丝孢酵母、假丝酵母、白地霉、意大利酵母、地生酵母、掷孢酵母、卡尔斯伯酵母、间型假丝酵母、球拟酵母等[27]。4.3白酒窖内酒醅中酵母多样性江南大学对酱香型白酒窖内发酵过程中酵母的组成变化进行研究，发现同一轮次三层酒醅中酵母种属基本没有差别，但随着时间的推进，优势酵母种类明显发生了变化[28]。研究发现拜耳结合酵母与酿酒酵母是第二、三、四轮次中最主要的2种酵母，但是随着时间的推进，栗酒裂殖酵母成了第五、六、七轮中的优势酵母[29]。此外还采用变形梯度凝胶电泳和实时荧光定量PCR技术分别对酒质好和酒质差的两个轮次发酵过程中的酵母群落结构进行解析，发现两轮次中优势酵母种类的不同，酒质较好的轮次中酵母数量更多，种类也更丰富：检测出东方伊萨酵母、戴尔凯氏有孢圆酵母、栗酒裂殖酵母、白地霉、拜耳结合酵母、酿酒酵母、费比恩毕赤酵母等九种酵母。[30]5.酵母菌在白酒酿造中的作用5.1产酒酵母在白酒酿造过程中的作用酵母菌在白酒酿造过程中发挥重要的作用，没有酵母菌就完成不了白酒的酿造，在酒化工艺和酯化工艺都需要酵母菌的参与，那么在酿酒过程中究竟使用了什么样的酵母菌呢？首先需要的酵母必须是酿酒酵母菌，葡萄酒酵母菌主要可以将原料转化为乙醇，葡萄酒酵母菌的乙醇生产能力很强，可以保证产酒的速率以及乙醇的产量，研究发现，在白酒酿造过程中需要多种酵母菌互相催化，而产酒酵母菌属于最具优势的，也是最主要的酵母菌，而别的酵母菌都属于产酯酵母菌，尽管产酯酵母菌在转化乙醇方面没有酿酒酵母菌的能力强，但是这些酵母菌可以起到增香的作用，在白酒酿造期间将原料转化为酯类、酸类化合物等，形成了类似于乙酸乙酯等带着香气的物质，从而获得风味优良的白酒。5.2产酯酵母菌在白酒酿造中的作用在白酒的酿造过程中，可以通过改变加入量，从而提高乙醇的产量和白酒的质量，所以，酵母菌在酿酒工艺上起到了至关重要的作用，白酒酿造过程中，产酯酵母菌主要产生酯类化合物，由于产酯酵母菌在有氧环境下参与反应，在其新陈代谢的过程中产生了多种酯质，可以增添酒的香气，故称产酯酵母是白酒产香过程中的重要参与者。产膜酵母有着和产酯酵母同样的喜好，喜欢在有氧环境下参与反应，同样为产香过程起到了重要作用。产酒酵母一般都和产酯酵母共同使用，这样可以保酒精产品的同时可以提升白酒的气味含量，异常毕赤酵母就是和产酒酵母一起使用，通过适合的比例，将其混合加入酿酒工艺中，提高乙醇产生含量的同时也提高了香气物质的产量，其中香气物质以乙酸乙酯含量的增加最为明显。6.酵母菌对白酒风味物质的影响6.1对醇类物质的影响酵母菌代谢产物对白酒风味和风味物质的形成有一定的作用，其代谢规律与菌株、酶活性、培养基组成和培养时间有关。当碳源为葡萄糖时，主要的挥发性代谢物包括2-苯乙醇，它是苯丙氨酸衍生物，具有果味或花味。米根霉和酿酒酵母混合发酵可以提高葡萄酒中总酸和氨基氮的含量，大大降低有害醇(甲醇、异丁醇、异戊醇)和总高级醇的含量，从而提高葡萄酒的品质。这可能是酵母菌株不能有效地将丙酮酸转化为乙醇，而是产生乳酸和乙酸，从而间接抑制了高级醇的产生。6.2对酯类物质的影响酒体中对风味作贡献的酵母菌主要为产香酵母，如假丝酵母、毕赤酵母、汉逊酵母等。在特殊风味白酒发酵醅中添加发香酵母，显著提高了优势风味中酯类的含量。感官评价结果表明，其酒体醇厚，风味协调，但没有改变特殊风味白酒的风味风格。黄惠芬对20株白酒制香酵母进行了筛选鉴定，并对其碱基序列进行了分析。6.3对有机酸的影响白酒酿造过程中经扣攮复膜酵母发酵产生的主要代谢物中包括4种脂肪酸(硬脂酸、软脂酸、丙酸、肉豆蔻酸)、2种有机酸(琥珀酸、草酸)和8种氨基酸(异亮氨酸、苏氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸)，白酒中的酸类主要是乙酸、己酸、和乳酸等有机酸类，它们是影响白酒口感的主要因素，缺酸会导致白酒苦味、口感不对、酒体余味不够等。过酸会造成酒粗，香气差，香气不直，有涩味。7.白酒酿造过程中酵母菌的未来研究趋势随着对于白酒酿造过程中酵母菌的研究不断加深，越来越多的研究人员意识到酵母菌对于酿酒的作用，同时也发现酒池中酵母菌的种类和数量影响着白酒的质量。对于酵母菌进行更加细致的分类研究和更加深入的分析研究。通过高分子技术继续开展研究，分析酵母菌的多样性，准确掌握酵母菌的分解原理以及对酿酒工艺的影响，阐述各个产酒酵母菌和非产酒酵母菌的相互促进的影响，分离提纯出产酒量多且香气十足的酵母菌。不仅如此，还需要对酵母菌转化的物质进行分析，利用添加催化剂进一步地控制白酒产出的速率，调节各个酵母菌之间的配比来提高白酒的质量。虽然现在研究停留在某些功能性的酵母菌株，但是对于酵母菌的品种类型、生长适应环境、各个菌株相互之间的影响还需要继续加深研究，尤其是酵母菌对于白酒酿造过程的配合关系的研究更加重要，另一方面，由于产香酵母研究的深入与应用，白酒的风味也愈加的多样化，而越来越受到消费者的喜爱，尽管酵母菌发酵增香是非常重要的工序，但是对于产香酵母菌种类的研究以及其作用机理的研究仍然缺乏。所以，未来对于白酒酵母菌的研究仍然从这两部分着手，重点分析产香酵母菌转化香气物质的过程，这个过程对于白酒酿造过程必将做出巨大的贡献。了解白酒发酵的原理需要结合现代高分子技术对白酒酿造过程的各个酵母菌的变化深度研究，澄清白酒酿造过程中酵母菌多样性的变化规律及其生物转化与风味物质之间的关系。通过白酒酿造池开展酵母菌的新菌种研究，也是白酒酿造过程中酵母菌的未来研究趋势。参考文献[1]申孟林.浓香型白酒大曲发酵成熟过程中四种主要酶产生菌多样性分析[D].成都：西华大学，2018[2]赵爽，杨春霞，窦屾，等.白酒生产中酿酒微生物研究进展[J].中国酿造，2012，31(4)：5-10[3]翟磊，于学健，冯慧军，等.宜宾产区浓香型白酒酿造生境中细菌的群落结构[J].食品与发酵工业，2020，46(2)：18-24[4]任爱容，黄永光，涂华彬.茅台镇酱香型白酒酿造大曲及环境中可培养细菌多样性及功能分析[J/OL].食品科学，http：///kcms/detail/11.2206.TS.20190826.1132.002.html[5]王定昌，赖荣婷.酵母的用途[J].粮油食品科技，2002，10(1)：12-16[6]赵龙飞，徐亚军，周红杰.酵母菌综合利用的研究进展[J].食品研究与开发，2004，25(4)：29-32[7]杜艾明,董孝元,李俊薇,孙培彬,胡申才.清香型白酒酿造体系中酵母菌的分离鉴技,2021,46(07):29-36.DOI:10.13684/ki.spkj.2021.07.006.[8]杜艾明.黄鹤楼清香型白酒酒体成分分析及酵母菌的筛选与生产特性研究[D].武汉轻工大学,2021.DOI:10.27776/ki.gwhgy.2021.000345.[9]黄治国,彭思婕,李浩,钟姝霞,邓杰,任志强,卫春会.浓香型白酒酿造车间空气中酵母菌的分离鉴定及生长特性研究[J].食品与机械,2021,37(03):7-11.DOI:10.13652/j.issn.1003-5788.2021.03.002.[10]杨文翠,张文丽,任文吉,樊金光,王红丽.生物学技术对白酒酿造微生物的影响分析[J].现代食品,2021(05):56-58.DOI:10.16736/41-1434/ts.2021.05.018.[11]刘小改,马美荣,周林艳,王小伟,张坤.高产乙酸乙酯酵母菌筛选及固态发酵应用研究[J].中国酿造,2020,39(10):79-83.[12]梁栩煜钱敏白卫东肖更生刘功良俞剑燊郭波.白酒酿造过程中的微生物研究进展[J].中国酿造202039(07):11-15.[13]张松白酒酿造系统中布氏乳杆菌的多样性及其功能研究[D]武汉轻工大学,2020DOI:1027776/dcnkigwhgy2020000122[14]信春晖,许玲,夏晓波,董乔娟.自然环境与白酒酿造关系解析——水质与酿酒微生物的生长代谢[J].酿酒,2020,47(01):68-72.[15]张松白酒酿造系统中布氏乳杆菌的多样性及其功能研究[D]武汉轻工大学,2020DOI:1027776/dcnkigwhgy2020000122[16]信春晖,许玲,夏晓波,董乔娟.自然环境与白酒酿造关系解析——水质与酿酒微生物的生长代谢[J].酿酒,2020,47(01):68-72.[17]彭俊,杨团元,刘蒲临,赵永威,缪礼鸿,廖卫芳.白酒酿造酒醅与周边土壤中酵母菌多样性及东方伊萨酵母发酵特性比较[J].中国酿造,2019,38(08):77-84.[18]李秋志,刘姣,王国明,任长成,肖冬光.不同添加量高产酯低产高级醇酵母菌在芝品,2019(10):56-60.DOI:10.16736/41-1434/ts.2019.10.019.[19]郝飞吕锡斌吴耀领曾祥炼张巧玲陈良强袁颉罗汝叶杨帆王和玉王莉尉洪涛韩培杰白逢彦.酱香型白酒酿造酒醅中酵母菌多样性研究[J].菌物学报201938(05):620-630.DOI:10.13346/j.mycosystema.180313.[20]戴奕杰,李宗军,田志强,孟望霓.酱香型白酒酿造过程中微生物及其代谢产