DB21-T 2777-2017海洋浮游微藻分离和筛选技术规程

ICS65.150

B51

备案号：58435-2018DB21

辽宁省地方标准

DB21/T2777—2017

海洋浮游微藻分离和筛选技术规程

DB21/T2777—2017

海洋浮游微藻分离和筛选技术规程

1范围

本标准规定了海洋浮游微藻藻种分离筛选的术语和定义、设施设备和条件、消毒灭菌处理、培养基

配制、分离筛选、纯化培养、种类鉴定、保存藻种、藻种种质库的建立和管理等技术要点。

本标准适用于常见海洋浮游微藻藻种的分离和筛选，其它种类也可参照执行。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T1160渔业水质标准

SC/T2047水产养殖用海洋微藻保种操作技术规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1

分离筛选separationandscreening

采用一定的方法与手段从天然水域或原有微藻藻种液中获得单种或纯种藻种的方法。

3.2

单种培养xenicculture

参照SC/T2047。

3.3

纯种培养pureculture

在培养液中排除了细菌和其它一切生物条件下的单一微藻种类的培养。

3.4

预备培养preparatoryculture

从天然水域中分离和筛选微藻藻种的一个重要环节，即采得的水样中生物量少而不利于分离时，需

选用适宜培养基培养一段时间，使水样中藻细胞数量变多以后，便于进行分离。

3.5

1

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复壮培养rejuvenatedculture

对处于静止期的藻种液进行单（纯）种分离和选择性培养，使其中未衰退的个体获得大量繁殖，重

新成为单（纯）种群体的措施。

3.6

固体培养基solidmedium

在培养液中加入适宜凝固剂，灭菌处理后凝固制成平板或斜面，用于微藻藻种的分离、纯化、复壮、

保存培养的培养基。

3.7

土壤—水培养基soil—watermedium

土、水按1:4的比例混合，经灭菌处理后制成的用于预备培养的一种有效的双相培养基。

4水质和设施设备条件

4.1水质条件

分离、培养用水系经沉淀、多级过滤的洁净海水，水质应符合GB1160的规定。

4.2设施设备

4.2.1清洗消毒间

应配备各种用于分离和培养的玻璃器皿，用于消毒或灭菌的烘箱、消毒柜、紫外线灯、电炉、煤气

或液化气灶、高压蒸汽灭菌锅等。

4.2.2操作观察间

应配有各种所需化学试剂（化学纯以上等级）、药品柜、电子天平、无菌室、超净工作台、显微镜、

酸度计、分光光度计、离心机、超滤装置等。

4.2.3培养保种间

应具备控温条件，配备人工光源、各式培养架、冰箱、低温培养箱、恒温光照培养箱等。

5消毒灭菌处理

5.1海水的处理

5.1.1单种培养海水的处理

煮沸5min~10min，冷却备用。

5.1.2纯种培养海水的处理

121℃高压蒸汽灭菌20min~30min，冷却后无菌保存备用。

5.2容器和工具的处理

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5.2.1接种环（针）

采用灼烧法进行灭菌处理。

5.2.2小型玻璃容器和工具

清洗干净后，采用121℃高压蒸汽灭菌20min~30min或150℃~160℃烘箱干燥灭菌2h，用于纯种

培养；采用煮沸消毒用于单种培养。

6培养基配制

6.1配制要求

——土壤—水培养基的制作：向试管中加入1cm取自农田或庭院的土壤，再加海水至5cm，搅动

后，塞上棉塞，采用蒸汽间歇灭菌，每天1次，连续2天，制作好后保存备用。

——其它参照SC/T2047执行。

6.2常用培养基配方

康威（Conwey）配方见附录A。其它参照SC/T2047。

7分离筛选

7.1水样采集

从自然海区（近岸或港湾等）、养殖池塘、已被污染藻种液中采集水样或网样（较大型种类）。

7.1.1水样处理

——镜检各种水样，选择能见到所须分离的种类的水样。

——水样中生物量太少时，采用静置沉降、微孔滤膜抽滤及离心等方法对水样进行浓缩处理。

——水样中生物量较多时，应适当稀释水样以便于分离。

——水样经浓缩后若生物量还是太少，分离困难时，须进行预备培养。

7.2预备培养

7.2.1培养基的选择

采用土壤—水培养基进行预备培养。其它常用培养基见附录A或参照SC/T2047。

7.2.2营养浓度

培养基中各种添加物的浓度通常只有原配方的1/4~1/2。

7.2.3接种水样

——用250ml容量瓶装入配制好的培养基100ml，把30ml~50ml水样接种至其中；

——将2ml~3ml水样接种至盛有土壤—水培养基的试管中。

7.2.4培养管理

接种水样后，按附录B所列培养条件培养至适于进行分离的藻细胞密度。

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7.3分离筛选方法

7.3.1平板分离法

此法可进行纯种分离。

7.4.1.1固体平板培养基的制作

按分离种类的需要，选用合适的培养基，加入1.5％的琼脂，加热溶解，稍冷后分装注入洁净培养

皿中（厚度0.5cm~0.7cm），加盖后采用高压蒸汽或间歇蒸汽灭菌法灭菌，冷却凝固后即为固体平板

培养基。

7.4.1.2接种水样

将待分离水样接种至固体平板培养基上。

——喷雾接种法：在无菌条件下用已消毒灭菌的培养液将水样稀释到适宜浓度，装入消毒好的医用

喉头喷雾器中，在平板表面喷雾。

——划线法：取金属接种环经灼烧灭菌冷却后，无菌条件下蘸取水样在平板培养基上轻轻做平行划

线或连续划线。

7.4.1.3培养

喷雾或划线接种后，盖好盖子放在无菌适宜条件下培养至在平板培养基上生长出相互隔离的藻类群

落（约20d~30d）。

7.4.1.4镜检分离

用解剖针或玻璃针取藻群落放入已灭菌或消毒的装有适宜培养液的试管或小型三角烧瓶（100ml

~250ml）中，漫射光下进行培养，每天轻轻摇动1次～2次。10d~20d后镜检无其他生物混杂即达到

分离目的。

7.3.2稀释分离法

7.4.2.1稀释水样

取已灭菌或消毒试管5只，第1支管中加培养液9ml，第2支～5支管中各加4.5ml，高压蒸汽灭

菌冷却后，向第1支管中加入待分离水样1ml，充分振荡至均匀稀释。用消毒过的吸管，从第1管中

吸取0.5ml混合液滴入第2管中如前振荡，使均匀稀释。同法依次移入第3～5管中，并都充分均匀

稀释。

7.4.2.2接种

取5个已灭菌备用的平板培养基，加热使之溶解，待冷却而尚未凝固时，取上述5个试管中的稀释

水样各1ml分别加入5个培养皿中，用力摇动培养皿，使待分离水样和培养基混合均匀，待凝固后，

至漫射光、20℃下培养约10d，至出现藻群落。

7.4.2.3镜检并分离

同7.4.1.4的操作，显微镜下检查分离效果。可反复进行若干次，直至得到完全分离的纯种或单种。

7.3.3微吸管分离法

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DB21/T2777—2017

——用微吸管吸取待分离水样以小水滴置于已消毒的载玻片上4滴~5滴。

——显微镜下检查，发现所要分离的种类，用干净的微吸管吸取单个细胞置于事先准备好的液体培

养基中进行培养。

——镜检分离效果。

7.3.4水滴分离法

取样同7.4.3，水样要充分稀释，镜检到小水滴中只有所要分离种类1个~2个细胞时，用洁净的微

吸管吸取该水滴，冲入事先备好的培养液中进行培养。

8纯化培养

将分离筛选出来的藻种进行纯种或单种培养，使其增殖到保存藻种所需的细胞密度。

9种类鉴定

经纯化培养的藻种进行分类学鉴定，确定种类。

10保存藻种

按SC/T2047执行。

11藻种种质库的建立和管理

按SC/T2047执行。

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BAA

附录A

（资料性附录）

藻种分离筛和保存培养中常用培养基配方

A.1康威（Conwey）培养基（表A.1.1~表A.1.4）

表A.1.1康威（Conwey）培养基

添加物用量

FeCl3·6H2O1.3g

MnCl2·4H2O0.36g

H3BO333.6g

Na2EDTA45.0g

NaH2PO4·2H2O20.0g

NaNO3100.0g

微量元素溶液（见表A.1.2）1~10ml

纯水至1000ml

注：系浓缩培养液。每1000ml消毒（灭菌）海水加入1ml。

表A.1.2康威培养基—微量元素溶液

添加物用量

ZnCl22.1g

CoCl2·6H2O2.1g

CuSO4·5H2O2.0g

(NH4)6Mo7O24·4H2O2.1g

纯水至100ml

表A.1.3康威培养基—维生素溶液

添加物用量

维生素B1210mg

维生素B1200mg

生物素（维生素H）10mg

纯水至200ml

注：系浓缩液，单独使用，每1000ml消毒（灭菌）海水加入0.1ml。

表A.1.4康威培养基—硅酸钠溶液

添加物用量

Na2SiO3·5H2O40mg

纯水至100ml

注：系浓缩液，单独使用，每1000ml消毒（灭菌）海水加入2ml。培养硅藻时添加。

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CB

附录B

（资料性附录）

常见海洋浮游微藻种类的培养条件

B.1培养条件见表B.1

表B.1常见海洋浮游微藻种类的培养条件

温度（℃）光强（μmol/m2·s）盐度（‰）酸碱度

种类

适宜最适适宜最适适宜最适最适

亚心形扁藻7~3020~2820~400100~2008~8030~407.5~8.5

青岛大扁藻17~3222~30——60~120——30~357.5~8.5

塔胞藻5~3020~2820~400100~2008~8030~407.5~8.5

杜氏盐藻——20~3540~20080~160——60~707.0~8.5

小球藻10~3625~30——60~200淡水~45——6.0~8.0

微绿球藻10~3625~30——200左右4~36——7.5~8.5

球等鞭金藻

15~3525~3020~200120~18010~3020~307.5~8.5

OA—3011

球等鞭金藻

——13~18——160——257.5~8.5

8701

湛江等鞭金藻9~3525~3220~620100~22010~5023~357.5~8.5

小新月菱形藻5~2815~2060~16018~61.525~327.5~8.5

三角褐指藻5~2510~2020~16060~1009~9225~327.5~8.5

牟氏角毛藻10~4025~35