DB21-T 2742-2017饲料中动物源性成分-貂源性组织成分定性检测方法PCR 方法

ICS65.120

B46

备案号：58400-2018DB21

辽宁省地方标准

DB21/T2742—2017

饲料中动物源性成分—貂源性组织成分定

性检测方法PCR方法

AnimalderivedingredientsinFeed-qualitativedetectionofminktissuederived

ingredientswithPCRmethod

DB21/T2742—2017

饲料中动物源性成分—貂源性组织成分定性检测方法PCR方法

1范围

本标准规定了检测饲料中貂源组织成分的聚合酶链式反应检测方法。

本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和单一饲料中貂源性成分的检测。

本方法的貂源性成分检测限为0.5%（w/w）。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T14699.1饲料采样

GB/T19495转基因产品检测

GB/T20195动物饲料试样的制备

SN/T1193基因检验实验室技术要求

3原理

利用氯仿抽提法或使用等效的基因组DNA提取试剂盒提取DNA，以提取的DNA为模板进行PCR扩

增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；PCR产物用限制性内切酶酶切后电泳和测序进行确证。

4试剂和材料

除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂；实验用水为灭菌双重蒸馏水；所有实验室使用的试剂等

级应为不含DNA和DNA酶的分析纯试剂，试剂的选购、验收、储存应符合规定。

4.1引物

根据Primer6软件设计，貂源性成分扩增产物为622bp，检测用引物（对）序列为：

F：5’-TTAGTAGCTCATAACGCCTTG-3’

R：5’-CGTGAGTATGTTCTTGGTTAG-3’

根据合成引物的标示浓度，用双重蒸馏水配制成10μM。

4.2BstXⅠ限制性内切酶。

4.3PCRMastermix（或DNA聚合酶、dNTP等PCR用试剂）。

4.4基因组DNA提取试剂盒或其他替代试剂。

4.5裂解缓冲液：250mmol/LSDS，使用前加入蛋白酶K至100mg/mL。

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4.6TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0。

4.7胶回收试剂盒或其他替代试剂。

4.8电泳缓冲液：Tris54g，硼酸27.5g，0.5mol/LEDTA（pH8.0）20mL，加蒸馏水至1000mL；使用

时10倍稀释。

4.9琼脂糖：分子生物学级别。

4.10溴化乙锭贮存液（10mg/mL）或荧光染料替代品。

4.11DNA分子量标准品（100bp-1000bp）。

5仪器设备

5.1分析天平：感量为0.01g和0.0001g。

5.2台式离心机：离心力12000r/min。

5.3水浴锅：温度可调范围为28℃-95℃，误差为±0.5℃。

5.4PCR仪。

5.5电泳仪。

5.6凝胶成像仪。

5.7核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计（可测量微量样品）。

6测定程序

饲料中貂源性成分测定程序见图1。

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试样

配合饲料浓缩饲料肉骨粉饲料单一饲料

磨碎、过筛

DNA提取

DNA浓度及纯度测定

PCR扩增及电泳检测

酶切及电泳检测

PCR扩增产物胶回收及测序

图1饲料中貂源性成分测定程序图

7操作步骤

7.1制样

按GB/T14699.1规定采集试样后，按GB/T20195规定，取有代表性的样品1kg，四分法缩减，取约

200g，经粉碎，全部过0.45mm孔筛，混匀装入磨口瓶中备用。

7.2模板提取

称取50mg试样于1.5mL离心管中，加入200μLTE，混匀；加入400μL裂解液，加400μL三氯甲烷，

混匀；10000r/min离心5min，取上清液；加0.8倍体积异丙醇，沉淀；10000r/min离心5min，弃上清液；

70%乙醇洗涤一次，晾干；加入50μLTE，溶解沉淀。

也可采用等效的基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取DNA。

7.3核酸浓度及纯度检测

提取的DNA采用紫外分光光度计在260nm和280nm处检测其吸光值，紫外分光光度法检测核酸浓度

的最佳范围是2μg/mL-50μg/mL，OD值应在0.05-1.0区间内。1OD260=50μg/mL双链DNA，用水稀释，调

整DNA浓度至20µg/mL。用于PCR反应的DNA溶液OD260/OD280比值一般不低于1.8，如低于1.8则重新进

行DNA的提取。

7.4PCR扩增

7.4.1PCR反应体系

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按表1的体系进行PCR反应液的配制。

表1PCR反应体系

成分鉴定体系

PCRMasterMix25μL

上游引物(10μM)0.5μL

下游引物(10μM)0.5μL

DNA模板100ng±50ng

ddH2O调整体系体积至50μL

7.4.2PCR扩增参数

按表2的条件进行PCR反应。

表2PCR反应条件

反应预变性扩增延伸

循环数1301

温度/℃9595487272

时间5min30s30s45s5min

7.4.3质控样品

检测过程中分别设阳性对照和空白对照。

在貂源性成分的鉴定中，以貂肉粉末作为阳性对照。PCR过程中，以水作为空白对照。

7.4.4PCR扩增产物电泳检测

取1.5g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL，

制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5μl-10μLPCR扩增产物点样。9V/cm恒压

电泳，直到指示剂迁移至凝胶尾部。凝胶成像仪下观察电泳结果并记录。

7.4.5限制性内切酶酶切反应

酶切反应体系为20µL，具体见表3，酶切条件根据说明书操作，电泳分析。

表3酶切反应体系

成分体积/µL

10×Buffer2

限制性内切酶BstXⅠ2

PCR产物7

ddH2O9

7.4.6PCR扩增产物测序

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7.4.6.1PCR扩增产物回收

采用经验证的胶回收试剂盒进行电泳后的PCR目的片段回收，按照试剂盒使用说明书回收DNA。

7.4.6.2PCR扩增产物测序

将特异性条带进行琼脂糖凝胶回收，纯化并委托测序，测序结果见附录A。

7.5结果表述

7.5.1PCR扩增产物电泳检测结果

貂源性成分扩增产物为622bp，序列参考附录A，图谱见附录B。貂源性成分的PCR产物被BstXⅠ酶

切为107bp和515bp两个片段，图谱见附录B。

7.5.2结果判定

PCR产物为阳性，同时酶切结果符合附录B、测序结果同源性达到99%判为含有貂源性成分，表述为

检出貂源性成分；PCR产物为阴性者，不需要再进行酶切和测序鉴定，判为不含有貂源性成分，表述为

未检出貂源性成分。

8检测过程中防止交叉污染的措施

参考GB/T19495.2《操作过程中避免交叉感染》和SN/T1193《基因检验实验室技术要求》执行。

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AA

附录A

（资料性附录）

貂源性成分PCR产物测序结果

CAGTGATAAAAATTAAGCCATGAACGAAAGTTTGACTAAGCCATGTTAACACCAAGAGTTGGTA

AATTTCGTGCCAGCCACCGCGGTCATACGATTAACCCAAATCAATGGGCCAACGGCGTAAAACG

TGTTAAGGACTATACAACACTAAAGTTAAAATTTAACCAGGCCGTAAAAAGCTACTGTTAATACA

AAACAAACCACGAAAGTGACTTTACCACTTCCGACAACACGATAGCTGAGATCCAAACTGGGAT

TAGATACCCCACTATGCTCAGCCCTAAACATAAATAATTCACATAACAAAATTACTTGCCAGAGA

ATGTTAAAGCAATAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTACATCCCTCTAGAGGAGCCT

GTTCTATAATCGATAAACCCCGATAAACCTCACCACTTCTAGCTAAATCAGTCTATATACCGCCA

TCTTCAGCAAACCCTTAAAAAGGAAGAAAAGTAAGCACAATAATGATACATAAAAAAGTTAGGT

CAAGGTGTAACCCAGAAGTGGGAAGAAATGGGCTACATTTTCTAACCAAGAAAATACTCACA

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BB

附录B

（资料性附录）

貂源性成分扩增产物及酶切凝胶电泳图

图B.1貂源性成分扩增产物及酶切凝胶电泳图

（LaneM：DL1000；Lane1：貂源性成分的扩增产物；Lane2-3：貂源性成分PCR产物酶切结果）

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