蚂蟥水提物调控Nrf2抗FeCl3诱导大鼠静脉血栓

-18-蚂蟥水提物调控Nrf2抗FeCl3诱导大鼠静脉血栓【摘要】目的：蚂蟥（WhitmaniapigraWhitman，W.pigra）是临床治疗血瘀证的传统动物类中药。实验室前期发现蚂蟥水提物（aqueousextractofdriedW.pigra，AEW）显著抑制静脉血栓（venousthrombosis，VT）形成。本论文旨在从Nrf2介导的抗氧化反应探讨AEW抑制VT形成的作用机制。方法：SD大鼠按体重随机分为6组：正常组、假手术组、模型组、AEW低剂量组（52mgcrudeW.pigra/kg）、AEW高剂量组（104mgcrudeW.pigra/kg）和华法林组（0.2mg/kg）。每组10只，雌雄各半。AEW和华法林连续灌胃给药5天，末次给药1小时后建立FeCl3损伤血管诱导的SD大鼠下腔静脉血栓模型，并进行颈总动脉采血及取材。称量血栓湿重（包含静脉壁和血栓）；HE染色观察组织病理变化；免疫荧光观察组织中活性氧簇（reactiveoxygenspecies，ROS）的累积；硫代巴比妥酸法检测组织中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；显色反应检测血清总抗氧化能力（totalantioxidantcapacity，T-AOC）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）活力以及还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（glutathione/glutathionedisulfide，GSH/GSSG）比值；免疫荧光和Westernblot检测组织Nrf2蛋白表达。结果：AEW显著降低栓重，减少组织中ROS累积和MDA含量，增强血清T-AOC以及SOD和CAT活力，升高血清GSH/GSSG比值，上调组织Nrf2蛋白表达。结论：Nrf2介导抗氧化反应减轻血管损伤是AEW抑制FeCl3诱导VT形成的分子机制。【关键词】静脉血栓；蚂蟥；水提物；氧化应激；Nrf2AqueousextractofWhitmaniapigraWhitmanpreventsFeCl3-inducedvenousthrombosisinratsviaactivationofNrf2-mediatedantioxidantresponse【Abstract】Objective:WhitmaniapigraWhitman(W.pigra)hasbeenwidelyusedasatraditionalChinesemedicineforthetreatmentofbloodstasissyndrome.OurpreviousstudyshowedthattheaqueousextractofdriedW.pigra(AEW)significantlyinhibitedvenousthrombosis(VT)inrats.Theaimofthepresentstudywastoexploretheunderlyingmechanismofthiseffect.Methods:SDratswererandomlydividedintosixgroups:normal,sham,model,lowandhighdosesofAEW(52and104mgcrudeW.pigra/kg)andwarfarin(0.2mg/kg)groups.AEWandwarfarinwereorallyadministeredoncedailyforfiveconsecutivedays.Onehourafterthefinaladministration,FeCl3-inducedinferiorvenacava(IVC)thrombosismodel,whichwascharacterizedbyvascularinjury,wasestablished.CarotidarterybloodandthrombosedIVCswerecollected.ThrombusweightwhichincludedthethrombusandassociatedIVCwallwasmeasured.ThehistopathologicalanalysisofIVCswasperformedthroughHEstaining.Reactiveoxygenspecies(ROS)accumulationintissueswasevaluatedbyimmunofluorescence.Malondialdehyde(MDA)contentintissues,andtotalantioxidantcapacity(T-AOC),activitiesofsuperoxidedismutase(SOD)andcatalase(CAT)andglutathione/glutathionedisulfide(GSH/GSSG)ratioinserumweredetectedbycommercialkits.ProteinexpressionofNrf2wasdeterminedbyimmunofluorescencestainingandWesternblot.Results:AEWsignificantlyreducedthrombusweight.AEWremarkablydecreasedROSaccumulationandMDAcontentintissues.AEWincreasedT-AOC,activitiesofSODandCAT,andGSH/GSSGratioinserum.AEWup-regulatedNrf2proteinexpression.Conclusion:AEWprotectedtheveinwallfromFeCl3-inducedoxidativestress,andthusalleviatedvascularinjuryandpreventedtheformationofthrombus.AEWmightbeapotentialtherapeuticagentforVT.【Keywords】Venousthrombosis;WhitmaniapigraWhitman;aqueousextract;oxidativestress;Nrf2前言静脉血栓（venousthrombosis，VT）是血液在静脉腔内异常凝结，导致静脉管腔阻塞及静脉血液回流障碍。据流行病学统计显示，VT是继冠心病和缺血性脑卒中之后，世界第三大血管疾病，每年欧洲地区每10万人中有104-183人发病，亚洲地区发病率稍低。VT可发生于全身各部位静脉，多发生在下肢深静脉引起深静脉血栓，若血块脱落随血液循环游走到肺部则引起致死性肺栓塞，为家庭及社会带来沉重负担。因此，早期预防、诊断及治疗是VT需要迫切解决的议题。目前，临床常见的治疗VT的药物有抗凝血药、抗血小板药和溶栓药，虽疗效确切但出血风险高。因此，寻找一种更为安全有效、作用温和的抗栓药物具有重要的现实意义。水蛭，主逐恶血、瘀血，月闭，具有活血化瘀通经之效，是临床治疗血瘀证的传统动物类中药。2015版《中国药典》收载的药用水蛭为水蛭科动物蚂蟥（WhitmaniapigraWhitman，W.pigra）、水蛭（HirudonipponicaWhitman）或柳叶蚂蟥（WhitmaniaacranulataWhitman）的干燥全体。其中，蚂蟥是我国临床上使用最多的水蛭品种。实验室前期发现蚂蟥水提物（aqueousextractofdriedW.pigra，AEW）显著抑制下腔静脉血栓形成，但具体分子机制仍有待深入探索。因此，本论文将建立三氯化铁（ferricchloride，FeCl3）损伤血管诱导大鼠下腔静脉血栓模型，通过检测血栓湿重、组织病理变化、组织中活性氧簇（reactiveoxygenspecies，ROS）的累积和脂质过氧化水平、血清抗氧化能力和组织中核因子E2相关因子（nuclearfactorE2-relatedfactor2，Nrf2）蛋白表达，从Nrf2介导抗氧化反应减轻血管损伤探讨AEW抑制FeCl3诱导VT形成的作用机制。概述1856年，德国病理学家RudolfVirchow最先提出血栓形成的经典三要素：血管内皮损伤、血流异常、血液高凝。近年研究表明，ROS和自由基可导致血管内皮细胞氧化损伤、老化、凋亡，启动促凝血反应引发血栓形成。Nrf2作为维持细胞内氧化还原稳态的中枢调节者，其激活可增强机体抗氧化能力，抵御氧化应激（oxidativestress，OS）损伤。可见，Nrf2介导的抗氧化反应对保护血管抑制VT形成具有重要作用。蚂蟥提取物具有良好的清除ROS和自由基的能力，但其抗氧化机制未深入阐明。下面将从VT形成的病理机制、VT治疗进展、FeCl3诱导动物VT模型及蚂蟥抗血栓研究等方面进行综述。1血管损伤与VT内皮是位于血管内表面的单层细胞，正常生理状态下，具有抗凝、促纤溶和维持血液流动性特性。内皮一旦受到损伤因素刺激，内皮结构或功能受损，进而启动一系列促血栓反应：内皮细胞活化快速分泌释放血管性血友病因子和组织因子促进血小板聚集，进而募集白细胞；增加黏附分子P/E选择素的表达，吸引白细胞移动、粘附至血管受损部位，促进炎症反应；减少某些抗血栓蛋白如内皮蛋白C受体的表达，抑制机体抗凝血途径；生成纤溶酶原激活物抑制剂-1和凝血因子V，增强受损血管局部血液凝固功能、抑制纤维蛋白溶解。可见，血管内皮损伤在血栓形成中起重要作用。1.1OS介导血管内皮损伤OS是指体内的ROS和自由基产生过多，氧化与抗氧化作用失衡，机体倾向于氧化，产生大量氧化中间产物，损伤组织。近年来研究表明，OS是血管内皮损伤的重要机制之一。正常生理状态下，机体的ROS总是处于不断产生和不断被超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）等抗氧化物清除的动态平衡中。当ROS产生过多并超过机体自身抗氧化能力时，机体内的抗氧化系统难以短时间内清除全部ROS，形成OS状态。此时，过多的ROS与一氧化氮（NitricOxide，NO）快速结合产生过氧亚硝酸盐，降低内皮细胞NO生物利用度并导致内皮功能障碍，引起血管内皮损伤。1.2Nrf2抗氧化信号通路Nrf2是一种转录因子，存在于机体的多种组织（如心、肝、脾、肾等）的细胞内，在机体抵抗OS损伤，维持细胞氧化还原稳态中发挥重要作用。机体处于正常生理条件下，细胞质中的Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Kelch-likeECH-associatedprotein1，Keap1）与Nrf2结合形成异二聚体，抑制Nrf2进入细胞核而无法发挥Nrf2的转录活性。当Nrf2与Keap1解离，游离的Nrf2即可进入细胞核内发挥作用，这是Nrf2激活的经典机制。机体处于OS状态时，Nrf2激活，转位进入细胞核与抗氧化反应元件（antioxidantresponsiveelement，ARE）结合形成Nrf2-ARE信号通路，启动下游抗氧化因子的表达，发挥抗氧化损伤作用[19]。目前已阐明Nrf2调控的下游抗氧化因子有：醌氧化还原酶1（NQO1）、血红素氧合酶1（hemeoxygenase1，HO-1）、谷胱甘肽s-转移酶（glutathioneS-transferase，GST）、SOD、CAT、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathioneperoxidase，GPx）和谷胱甘肽还原酶（glutathionereductase，GR）等。Ge等使用异丙酚后处理小鼠，发现小鼠肝脏中OS降低且Nrf2、HO-1表达增加，进而减轻小鼠肝脏缺血/再灌注损伤，保护肝细胞免受缺氧/复氧刺激引起的OS损伤。Ishikado等证明柳树皮提取物可通过激活人脐静脉内皮细胞和秀丽隐杆线虫中的Nrf2信号通路来缓解OS损伤。2中西医治疗VT研究概况2.1西医治疗目前西医治疗措施主要是药物治疗和手术取栓治疗。常用药物有抗凝血药、抗血小板药和溶栓药。抗凝药有肝素和华法林等，主要通过加强凝血过程中特定凝血因子的灭活而实现抗凝作用，但临床上容易引起患者血小板减少和出血等不良反应。抗血小板药有阿司匹林和氯吡格雷等，通过封闭血小板膜上的受体或抑制血小板血栓素A2合成，抑制血小板活化，阻止血栓形成。其治疗效果显著，但多禁用于于肝、肾功能损害的患者。溶栓药有阿替普酶和瑞替普酶等，将内源性纤溶酶原转化为纤溶酶，降解血块中的纤维蛋白，其溶栓效果肯定，安全性好，但昂贵的价格制约了其在临床上的普及推广。这三类药物抗栓作用确切，但均存在不同程度的出血风险及其他不良反应。2.2中医治疗中医理论中，VT属血瘀证“脉痹”的范畴，由气滞血瘀、气机不畅导致。目前中医对VT治疗主要从益气、活血和化瘀着手，将微观辨证与宏观辨证相结合，配合中药内服外治。与西医防治相比，中医中药防治作用温和，不良反应小，安全性高，突出了中医中药的独特优势。3FeCl3诱导动物VT模型研究现状近年来的VT研究常用下腔静脉完全结扎法、下腔静脉狭窄法、FeCl3腐蚀法和电解下腔静脉法制备动物模型。其中使用FeCl3外敷静脉管壁制备动物VT模型操作简便、重复性好，接近于临床自发性血栓的组织形态特征。据报道，3.5%FeCl3溶液能较好地诱导形成静脉血栓，可作为诱导静脉血栓的阈浓度。Joglekar等将饱和浸润20%FeCl3溶液的滤纸置于下腔静脉10min，撤去滤纸，血栓继续稳定形成45min制备出血小板/糖蛋白IP-IX/血管性血友病因子依赖性的闭塞性血栓。Wei等将棉片充分浸润于40%FeCl3溶液，贴敷于新西兰兔上矢状窦5min，随后注射凝血酶成功建立脑静脉窦血栓模型。可见，FeCl3溶液的浓度和外敷时间是成功建立VT模型的关键因素。本实验室前期发现，浸有10%FeCl3的滤纸外敷大鼠下腔静脉5min后，撤去滤纸，血栓继续稳定形成30min，所建立的VT模型稳定、死亡率低、成栓率高。目前，使用FeCl3外敷静脉管壁制备动物VT模型的确切作用机制仍存在争议，Schoenwaelder等发现在血管局部应用FeCl3溶液后，Fe3+离子被摄取并转移至内皮，通过胞吐作用进入血管腔不断积累。血管腔内较高浓度的Fe3+产生的氧化效应会引起内皮毒性及剥蚀作用，导致内皮破损不断积累。血管腔内较高浓度的Fe3+产生的氧化效应会引起内皮毒性及剥蚀作用，形成血栓。Ciciliano等发现FeCl3对内皮细胞活性影响呈浓度依赖性，且在血液中对血细胞和血浆蛋白的电荷依赖性聚集作用起重要作用。4蚂蟥抗血栓研究现状水蛭，最早记载于《神农本草经目》：“水蛭，味咸，平。主逐恶血、瘀血，月闭，破血瘕积聚，无子，利水道，生池泽”，具有活血化瘀通经之效，是治疗血瘀证的传统动物类中药。水蛭品种繁多，全世界约有400-500种，我国已发现89种。2015版《中国药典》收载的药用水蛭为水蛭科动物蚂蟥（WhitmaniapigraWhitman）、水蛭（HirudonipponicaWhitman）或柳叶蚂蟥（WhitmaniaacranulataWhitman）的干燥全体。其中，蚂蟥是我国临床上使用最多的水蛭品种。蚂蟥提取物的主要化学成分为蛋白质和多肽类大分子，临床应用及动物实验表明其具有显著的抗凝、抗血栓、抗血小板聚集和抗癌转移等药理作用。Liu等在蚂蟥干燥体中分离出名为WP-30的新型抗血栓肽，在体外可选择性抑制凝血酶诱导的血小板聚集，在体内抑制动静脉分流血栓形成。但目前对蚂蟥的研究主要集中在提取炮制工艺和入药成分上，鲜有探讨蚂蟥抑制血栓形成的具体分子机制。实验室前期在大鼠动-静脉旁路血栓、狭窄法诱导的下腔静脉血栓和FeCl3诱导颈动脉血栓模型中发现，AEW能抑制三种血栓形成，且抗VT形成的作用更为明显。有研究者发现，蚂蟥提取物具有良好的清除ROS和自由基的能力，但对于其抗氧化机制并未进行深入的研究和解释。因此，本论文将建立FeCl3损伤血管诱导大鼠下腔静脉血栓模型，从Nrf2介导抗氧化反应减轻血管损伤探究AEW抑制FeCl3诱导VT形成的作用机制。5小结VT形成与内皮损伤息息相关。FeCl3腐蚀下腔静脉，作为制备动物VT模型的方法，通过高价铁离子在静脉壁的不断蓄积和强氧化作用，导致内皮损伤而诱导血栓形成。Nrf2信号通路可启动下游抗氧化因子的表达，抵御氧化损伤。而OS缓解可保护血管内皮，抑制VT形成。蚂蟥提取物抗VT形成作用显著，且具有良好的清除ROS和自由基的能力。因此，本论文将基于Nrf2介导抗氧化反应减轻血管损伤探讨AEW抑制FeCl3诱导VT形成的作用机制，这与目前常用抗栓药物的作用机制明显不同，具有重要的研究价值，有助于我们进一步理解VT形成的机制，并为中药蚂蟥的临床应用提供基础实验依据。研究部分1实验材料1.1实验动物及喂养环境由广州中医药大学实验动物中心提供60只200-250gSPF级的SD大鼠，雄性雌性大鼠各30只。由广州中医药大学实验动物房提供本批实验大鼠合格的喂养环境。室内温度和相对湿度分别控制22-25℃和50-60%，12h照明/12h黑暗交替。1.2药物与试剂药品/试剂批号/货号厂家蚂蟥干体江苏省天下农农业科技发展有限公司华法林钠片18170102B上海信宜九福药业有限公司生理盐水140911A佛山双鹤药业有限公司速眠新注射液160623长沙拜特生物科技研究所有限公司戊巴比妥钠170108德国默克FeCl3•6H2O20131102-1广州化学试剂厂4%多聚甲醛P0099碧云天中性树胶20170824国药集团化学试剂有限公司OCT冰冻切片包埋剂4583日本樱花RIPA裂解液（强）CW2333S北京康为世纪PMSF（100mM）CW20221北京康为世纪甲醇20170912天津市富宇精细化工有限公司TrisFD2010弗德生物甘氨酸FD2040弗德生物SDSFD2040弗德生物1MTris-Hcl（pH=6.8）FD2070弗德生物1MTris-Hcl（pH=8.8）FD2080弗德生物Acrylamide/BisSolution29:1FD2060弗德生物TEMEDT0761Bio-Rad过硫酸铵FD2050弗德生物Tween-20FD0020弗德生物牛血清白蛋白（BSA）CCSS001401DMRCGlobalPrestainedProteinLadder26616美国赛默飞5×loadingbufferCW00275北京康为世纪ChemiluminescentHRPsubstrateP90720美国MilliporeBCA蛋白浓度测定试剂盒CW0014S北京康为世纪丙酮20150901广州化学试剂厂Triton-X-100T0694Amresco正常山羊血清CW0130S北京康为世纪DAPI染色液AR1176博士德生物技术有公司抗荧光衰减封片剂S2100北京索莱宝活性氧（ROS）测试盒E004南京建成丙二醛（MDA）测试盒A003-1南京建成总抗氧化能力检测试剂盒S0121碧云天超氧化物歧化酶（SOD）测试盒A001-3南京建成过氧化氢酶检测试剂盒S0051碧云天谷胱甘肽测试盒A061-1南京建成兔单克隆Anti-Nrf2抗体ab137550英国Abcam兔单克隆Anti-GAPDH抗体2118S美国CSTGoatanti-RabbitIgG(HRP)二抗7074S美国CSTGoatanti-Rabbit荧光二抗A23220美国Abbkine1.3实验仪器实验仪器型号厂家电子天平JJ3000常熟市双杰测试仪器厂分析天平EL204上海梅特勒-托利多仪器有限公司涡旋仪XW-80A海门市其林贝尔仪器制造有限公司组织脱水机STP120美国ThermoScientific组织包埋机A81010100美国ThermoScientific石蜡切片机HM340E美国ThermoScientific冷冻切片机CryoStarNX50HOVPD美国ThermoScientific全自动组织染色机A81500101美国ThermoScientific荧光显微镜BDS300重庆奥特光学仪器有限公司激光共聚焦显微镜ZeissLSM800withAiryscan上海卡尔蔡司全自动样品快速研磨仪JXFSTPRP-32上海净信公司台式冷冻离心机D3024R美国赛洛捷克公司数显恒温水浴锅HH-6金坛市医疗仪器厂酶标仪MultiskanGO美国ThermoScientific转移电泳仪电源DYY-7C北京六一生物科技有限公司双垂直电泳槽DYCZ-25D北京六一生物科技有限公司水平摇床WD-9045B北京六一生物科技有限公司化学发光成像系统Tanon-5200上海天能科技有限公司1.4实验耗材注射器、棉线、固定板、剃毛刀、碘伏、棉签、手术刀、手术剪、玻璃分针、Whatman滤纸、保鲜膜、手术镊、离心管、吸头、多种规格离心管、载玻片、粘附载玻片、盖玻片、吸水纸、免疫组化笔、PVDF膜等。2实验方法2.1AEW制备参照论文《水蛭提取物迟释给药系统研究》进行AEW的制备：50g蚂蟥干燥全体打粉，粗粉经水提后冷冻干燥得到14.16g的冻干粉（3.5g蚂蟥干粉/g冻干粉）。其提取流程如Figure1所示：Figure1PreparationofAEW.2.2动物分组及给药2.2.1动物分组遵循对照和随机原则，本实验随机将60只大鼠按体重分成6组：正常组、假手术组、模型组、AEW低剂量组（lowdoseofAEWgroup，AEW-L）、AEW高剂量组（highdoseofAEWgroup，AEW-H）和华法林组，每组雄性、雌性大鼠各5只。2.2.2给药剂量设计2015版《中国药典》中蚂蟥的人用剂量为1-3g/d。本研究选取人用剂量为1g/d。根据生药量相等折算，则AEW冻干粉的人用剂量为0.28g/d。根据等效剂量换算，AEW冻干粉的大鼠给药剂量为29.2mg/kg/d。人临床给予华法林的给药剂量为2.5-5mg/d，根据等效剂量换算得到大鼠的给药剂量范围为0.26-0.52mg/kg/d。为确保华法林的抗凝血作用及避免出血，结合文献及实验室前期预试，重新确定连续给药5天的华法林剂量为：0.2mg/kg/d。华法林钠片的平均片重为75.0mg，每片含华法林2.5mg，故大鼠给予华法林钠片的给药剂量为6.0mg/kg/d，灌胃体积为10mL/kg/d。试验组别给药途径给药类别给药剂量（mg/kg/d）给药体积（mL/kg/d）正常组灌胃蒸馏水10假手术组模型组AEW-L组AEW冻干粉溶液14.6AEW-H组29.2华法林组华法林钠溶液6.02.3溶液配制AEW-H溶液（2.92mg/mL）：精密称取146mg的冻干粉，溶于50mL蒸馏水即得。AEW-L溶液（1.46mg/mL）：精密量取16mLAEW-H溶液，溶于16mL蒸馏水即得。华法林钠溶液（0.6mg/mL）：精密称取18mg华法林钠片粉末，溶于30mL蒸馏水即得。10%FeCl3溶液：精密称取0.5gFeCl3•6H2O（含FeCl30.3g），加入3mL蒸馏水充分溶解即得。10%SDS溶液：精密称取0.2gSDS粉末，加入2mL蒸馏水充分溶解即得。10%过硫酸胺（APS）溶液：称取0.2gAPS粉末，溶于2mL蒸馏水即得。5X电泳缓冲液：分别将已准确称量好的15gTris粉末、72g甘氨酸粉末和5gSDS粉末依次装入1000mL容量瓶内，缓慢倒入蒸馏水加至刻度线，振摇使溶解充分即得。1X电泳缓冲液：精密量取200mL5X电泳缓冲液于1000mL容量瓶内缓慢倒入蒸馏水加至刻度线，振摇使溶解充分即得。10X转膜液：分别将已准确称量好的30gTris粉末、154g甘氨酸粉末和1gSDS粉末依次装入1000mL容量瓶内，缓慢倒入蒸馏水加至刻度线，振摇使溶解充分即得。1X转膜液：精密量取100mL10X转膜液和200mL甲醇于1000mL容量瓶内缓慢倒入蒸馏水加至刻度线，振摇使溶解充分即得。10XTBS缓冲液：分别将已准确称量好的24gTris粉末和80gNaCl粉末依次装入1000mL容量瓶内，缓慢倒入蒸馏水加至刻度线，振摇使溶解充分即得。1XTBST溶液：精密称取100mL10XTBS缓冲液于1000mL容量瓶内缓慢倒入蒸馏水加至刻度线，临用前再加入1mL吐温-20，振摇使溶解充分即得。5%BSA封闭液：精密称取2.5gBSA粉末，加入50mL1XTBST充分溶解即得。2.4FeCl3诱导大鼠下腔静脉血栓模型制备各组每天灌胃一次，连续灌胃5天。于末次给药后1h进行手术造模。术前12h，禁食不禁水。大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠（0.6mL/kg），肌肉注射速眠新（0.2mL/kg）。麻醉起效后大鼠腹部剃毛，仰卧位固定，腹部涂抹碘酒进行皮肤表面消毒。沿腹中线切开腹腔，朝手术者左侧方向轻微拨开腹腔脏器，充分暴露下腔静脉。玻璃分针仔细分开下腔静脉与腹主动脉约1.2cm，穿过保鲜膜（2cm×1.8cm），再在保鲜膜与下腔静脉间穿过浸满10%FeCl3溶液的Whatman滤纸（1.0cm×1.0cm）。滤纸包裹下腔静脉，再裹上保鲜膜以防FeCl3损伤周围组织。5min后抽出保鲜膜和滤纸，再让血栓稳定形成30min。假手术组以浸有蒸馏水的Whatman滤纸作为对照。正常组大鼠不进行任何处理。30min后，马上颈总动脉采血到不含抗凝剂的采血管。采血管常温静置30min后，1600×g、4℃离心10min，分离上清（即血清）并分装，-80℃保存，用于检测T-AOC、SOD和CAT活力以及GSH/GSSG比值。3指标检测3.1血栓湿重动物颈总采血后即可取栓。剪取滤纸包裹处的造模血管段，吸干残留血液，称量栓重（包含静脉壁和血栓）。取1/3组织OCT包埋后液氮速冻，-80℃保存用于ROS检测；1/3组织置于4%多聚甲醛溶液中固定48h以上用于组织病理学分析；剩余组织保存于-80℃，用于检测脂质过氧化水平和Nrf2蛋白表达。3.2组织病理学分析苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色法普遍应用于组织学、病理学等领域的临床、科研及教学，是目前观察分析各种组织生理、病理相关形态结构最常用的技术手段。实验步骤如下：（1）组织脱水：取出固定液中的组织，逐一放置于包埋盒中，开始脱水：甲醛（1h、60转）×2®70%酒精（1.5h、70转）®80%酒精（1.5h、70转）®96%酒精（1.5h、70转）®100%酒精×3（1.0h、70转）®二甲苯（1.5h、70转）®二甲苯（1.5h、60转）®石蜡（2h、60转）×2。（2）石蜡包埋。（3）石蜡切片机切片（4µm），贴附于载玻片上。（4）染色：染色前0.5h-1h置于60℃烘箱中熔蜡，同时使组织更加贴附以防染色过程中脱片。开始染色：二甲苯3min×3®100%酒精1min×2®95%酒精1min®75%酒精1min®流水1min®苏木精7min®流水1min®酒精分化3s®流水10min®95%酒精30s®伊红（醇溶）30s®95%酒精30s®100%酒精2min×2®二甲苯3min×2。（5）染色完成后，用吸头缓慢吸取并滴加数滴中性树胶于玻片，待中性树胶全部浸润组织，盖上盖玻片等待中性树胶完全凝固。（6）将完全干燥凝固后的组织切片置于显微镜下，观察组织的各项病理形态结构，拍照记录。3.3血栓组织中ROS检测取-80℃冰箱中OCT包埋的组织，冰冻切片机切片（6µm），贴附于粘附载玻片上。免疫组化笔紧贴组织四周画圆，组织表面均匀滴加20µLDCFH-DA稀释液，37℃烘箱避光孵育30min。PBS浸洗玻片3次（1min/次），吸水纸吸干PBS，荧光显微镜下观察并采集图像。3.4血栓组织中脂质过氧化水平检测丙二醛（malondialdehyde，MDA）是机体内细胞自由基与脂质发生过氧化反应所得的产物之一，作为标示组织细胞中脂质是否过氧化的重要依据，可根据所测得的丙二醛含量判别机体组织氧化损伤的程度[41]。检测步骤如下：将血栓组织放入EP管，置于离心机离心10min，设置参数为12000×g、4℃。离心后吸取上清液，硫代巴比妥酸法检测MDA含量。分别将乙酸和2-硫代巴比妥酸依次加入到含标准品和样本的EP管中，再将样板和标准品置于100℃水浴锅中进行反应，等待1h，直至溶液出现红棕色。MDA含量和红棕色深度呈正相关。将样品放入酶标仪中，设置检测光谱为532nm，测定其吸光度并通过吸光度计算组织中MDA含量。3.5血清中T-AOC检测取-80℃冰箱中冻存的血清，显色法检测血清T-AOC。ABTS在氧化剂作用下可被氧化成绿色的ABTS•+，在抗氧化物存在时ABTS•+的产生会受到抑制，在414nm处测定ABTS•+的吸光度即可计算样本的T-AOC。检测步骤如下：用移液枪准确吸取20µL过氧化物酶工作液，加入到总抗氧化能力检测试剂盒的全部包被微孔中。用移液枪准确吸取10µL蒸馏水于空白对照孔中，再依次准确吸取10µL不同浓度标准液于标准曲线检测孔，最后准确吸取10µL血清于样本检测孔，混匀。用移液枪准确吸取170µLABTS工作液于试剂盒全部微孔中，混匀。将试剂盒置于室温孵育，6min后放入酶标仪中，设置检测光谱为414nm，测定其吸光度并通过吸光度计算血清中T-AOC含量。3.6血清中SOD活力检测取-80℃冰箱中冻存的血清，WST-1法检测血清SOD活力。相关检测步骤以超氧化物歧化酶（SOD）测试盒说明书为准。3.7血清中CAT活力检测取-80℃冰箱中冻存的血清，显色法检测CAT活力。检测步骤如下：（1）用移液枪分别准确吸取10µL需要检测的血清、30µL过氧化氢酶检测缓冲液和10µL250mM过氧化氢溶液于1.5mL离心管中，每加入一种溶液立即充分混匀。空白对照吸取40µL过氧化氢酶检测缓冲液和10µL250mM过氧化氢溶液于另一离心管，立即充分混匀即可。将离心管置于25℃数显恒温水浴锅待其反应3min。准确吸取450µL过氧化氢酶反应终止液于两支离心管中，混匀，制备终止完全的反应体系。分别准确吸取40µL过氧化氢酶检测缓冲液和10µL终止完全的上述反应体系于第三支离心管，混匀。准确吸取第（3）步骤已混匀且终止完全的反应体系10µL于96孔板中，加入200µL显色工作液（稀释的过氧化物酶）。将孔板置于25℃数显恒温水浴锅中，等待30min孵育完全后，放入酶标仪中，设置检测光谱为520nm，测定其吸光度并通过吸光度计算血清中CAT活力。3.8血清中GSH/GSSG比值检测取-80℃冰箱中冻存的血清，利用DTNB（显色剂）的循环反应，检测总谷胱甘肽（totalglutathione，T-GSH）和氧化型谷胱甘肽（glutathionedisulfide，GSSG）的含量。谷胱甘肽还原酶可以将GSSG还原成GSH，而GSH可以和显色剂DTNB反应生成黄色产物。酶标仪检测405nm处的吸光度，计算血清中GSH/GSSG比值。具体操作步骤参照南京建成提供的谷胱甘肽测试盒说明书。3.9免疫荧光检测组织中Nrf2蛋白表达（1）取-80℃冰箱中OCT包埋的组织，冰冻切片机切片（6µm），贴附于粘附载玻片上。（2）玻片置于预冷的丙酮中固定15min，PBS浸洗玻片3次，3min/次。（3）免疫组化笔在组织四周画圆，吸取0.5%Triton-X-100缓缓滴于组织，待液滴覆盖组织后，将玻片放置在通风环境通透20min，期间维持室温。通透完全后吸取适量PBS浸洗玻片，每次3min，总共清洗3次。（4）待玻片浸洗完全，用吸水纸吸干浸洗液。吸取正常山羊血清滴加在玻片表面，将玻片放置0.5h进行封闭，期间维持室温。封闭完全后用吸水纸轻轻吸干玻片表面的封闭液，不洗。（5）用移液枪吸取Nrf2一抗（1:1000）于玻片，将玻片放入湿盒置于4℃环境16h。再吸取适量PBST浸洗玻片，每次5min，总共清洗3次。（6）清洗完毕后吸取适量荧光二抗（1:1000）于玻片，将玻片放入湿盒置于室温环境1h，再吸取适量PBST浸洗玻片，每次5min，总共清洗3次。（7）二抗孵育并清洗完毕后，吸取适量DAPI于玻片，置于暗处环境5min，再吸取适量PBST浸洗玻片，每次5min，总共清洗4次。（8）清洗完毕后吸取适量抗荧光衰减封片剂于玻片，盖上盖玻片，将盖玻片置于激光共聚焦显微镜下，观察并进行图像收集、汇总、处理。3.10Westernblot检测组织中Nrf2蛋白表达（1）组织提蛋白：取-80℃冰箱中冻存的组织，每1mg组织加10μL裂解液（RIPA:PMSF=100:1）。混合后放入全自动样品快速研磨仪匀浆2次，1min/次。将研磨后的匀浆放入离心管，置于台式冷冻离心机离心10min，离心机参数设置为12000×g、4℃，离心结束后吸取上清液。（2）测定蛋白浓度：具体操作步骤以BCA蛋白浓度检测试剂盒的说明书为准，得到的样品放入酶标仪中，设置检测光谱为562nm，测定其吸光度并通过吸光度计算蛋白浓度。（3）样本稀释并煮沸：用蒸馏水和1×loadingbuffer将蛋白稀释成终浓度为2.5µg/µL，夹防爆夹沸水中变性5min，分装保存于-20℃。（4）配胶：先配下层分离胶，注胶后用水压平，静置30min。倒去水加上层浓缩胶，并立即插入电泳梳，静置30min。配好的胶浸泡于蒸馏水中，4℃保存。（5）上样：上样体积均为20µL/孔，最终上样量为50µg/孔。（6）SDS电泳：加样结束后，打开转移电泳仪电源，将双垂直电泳槽调至80V直流稳定电压开始电泳；当溴酚蓝随着电泳移动至上、下层凝胶界面处，将80V电压调高至120V恒压继续电泳；当溴酚蓝电泳至凝胶底部时，结束电泳。（7）转膜：将配置好的1×转膜液倒入托盘中，取出凝胶放入托盘，剪切出含目的蛋白的凝胶区域，测量并记录该区域长宽数据；依据剪切的长宽数据裁剪出适宜大小的PVDF膜并放入甲醇中活化2-3min，按照黑底-海绵-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵-红底的顺序放好胶和膜，中间避免出现气泡。小分子蛋白（<70kDa）转膜条件为300mA恒流50min，大分子蛋白（>70kDa）转膜条件为300mA恒流120min。（8）洗膜：转膜结束后，将膜装入适当大小的盒子，倾倒TBST至完全浸没膜表面，将盒子放置在水平摇床5min，调节摇床为中速，该操作重复3次。（9）膜封闭：将盒子内剩余的TBST倾倒，加入5%BSA，将盒子放置在水平摇床1h，调节摇床为慢速，。（10）洗膜：倾倒TBST至完全浸没膜表面，将盒子放置在水平摇床5min，调节摇床为中速，该操作重复3次。（11）孵一抗：TBST稀释一抗Nrf2（1:1000）、GAPDH（1:2000），膜放入相应一抗中，4℃冰箱过夜（16h）。（12）洗膜：倾倒TBST至完全浸没膜表面，将盒子放置在水平摇床5min，调节摇床为中速，该操作重复3次。（13）孵二抗：5%BSA稀释兔二抗（1:3000），室温孵育，将盒子放置在水平摇床1h，调节摇床为中速。（14）洗膜：倾倒TBST至完全浸没膜表面，将盒子放置在水平摇床5min，调节摇床为中速，该操作重复3次。（15）显影：吸取适量发光液滴于膜上，将膜放入暗室的载物对焦平台，对准电动镜头，使用化学发光成像系统进行曝光和图像收集、汇总、处理。（16）灰度测定：ImageJ软件分析各蛋白条带的灰度值。4统计学分析实验数据采用SPSS20.0统计软件处理。所有数据以均数±标准误（mean±SEM）表示，ANOVA单因素方差分析进行统计学比较，P≤0.05为显著差异，P≤0.01为极显著差异。5实验结果5.1AEW降低栓重正常组和假手术组不形成血栓；模型组大鼠形成质地较松软的暗红色血栓，且静脉壁与血栓紧密粘连；AEW低剂量组大鼠形成的血栓有所减小，静脉壁与血栓仍紧密粘连；AEW高剂量组和华法林组大鼠形成的血栓均明显减小，静脉壁与血栓有粘连（Figure2A）。与正常组相比，假手术组并未出现显著的栓重差异。与假手术组相比，FeCl3显著诱导血栓形成，模型组栓重增加了261.5%（P<0.01）。与模型组相比，AEW高剂量组栓重降低了29.3%（P<0.01）（Figure2B）。Figure2Representativepicturesofharvestedtissues(A).EffectofAEWonthrombusweight(B)inratsofFeCl3-inducedIVCthrombosis.Datawereexpressedasmean±SEM,n=8forB.**P<0.01vs.shamgroup;##P<0.01vs.modelgroup;aP<0.05vs.AEW-Lgroup.5.2AEW减轻血管损伤正常静脉壁结构由外向内依次分为外膜、中膜及内膜。外膜主要为胶原纤维，内含神经纤维；中膜位于内膜和外膜之间，由平滑肌细胞层构成；内膜由单层的内皮细胞紧密排列而成，是三层中最薄的一层。与正常组相比，假手术组并未出现显著的血管壁形态差异（Figure3）。因此，后续指标检测不再设正常组。与假手术组相比，10%FeCl3严重损伤静脉壁，可见静脉内皮细胞的脱落和周围平滑肌细胞的深染。与模型组相比，AEW高剂量显著改善血管损伤（Figure3）。Figure3EffectsofAEWonthemorphologyofveinwallsinratsofFeCl3-inducedIVCthrombosis.I,intima;M,media;A,adventitia;E,endothelium;SMC,smoothmusclecell.HEstaining.Scalebar,10μm.5.3AEW减少组织中ROS累积和MDA含量与假手术组相比，FeCl3显著增多组织中ROS累积（Figure4A）和MDA含量（P<0.01，Figure4B）。与模型组相比，A