TTPPA -2021 中药注射剂体外抗氧化活性评价 DPPH法

T/TPPAXXX-XXXX中药注射剂体外抗氧化活性评价DPPH法1本标准规定了中药注射剂体外抗氧化活性评价DPPH法的基本原则和要求。本标准适用于具有自由基清除能力的中药注射剂体外抗氧化活性的评价。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T33087仪器分析用高纯水规格及试验方法GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定GB/T12810实验室玻璃仪器玻璃量器的容量校准和使用方法JJG646移液器检定规程GB/T27418测量不确定度评定与表示RB/T030化学分析中测量不确定度评估指南GB/Z19027GB/T19001的统计技术指南3术语和定义下列术语和文件适用于本文件。3.1中药注射剂traditionalChinesemedicineinjection中药注射剂是指在中医理论指导下，采用先进的制备工艺，从中药或天然药物的单方或复方中提取有效物质制成的可供注人体内的制剂。3.2自由基freeradical任何包含未成对电子的原子或原子团。3.3氧化oxidation分子或原子团失去电子(或称氧化态增加)的过程。3.4抗氧化antioxidant某些物质可以通过直接作用于自由基，或通过间接消耗掉可生成自由基的物质，而达到有效抑制自由基氧化的反应。3.5遮光shading2T/TPPAXXX-XXXX指用不透明的容器进行包装，使其不被照射，例如用棕色容器、黑色包装材料包裹或置于暗箱。3.6半抑制浓度halfmaximalinhibitoryconcentration，IC50,使DPPH控制溶液吸光度变化量为0.500时，对应的供试品溶液或阳性对照溶液的浓度。3.7相对抗氧化活性Relativeantioxidantactivity，RAA单位浓度供试品溶液使DPPH控制溶液吸光度下降与单位浓度阳性对照溶液使DPPH控制溶液吸光度下降的比值。3.8回归分析regressionanalysis将所关心的特性（通常称为“响应变量”）的性能与潜在的原因（通常称为“解释变量”联系起来。这样一种关系可通过科学、经济、工程等学科的模型作出规定，或经验地得到。目的是帮助理解响应变差的潜在原因，并解释每个因素对该变差所起的作用有多大。通过统计将响应变量的变差与解释变量的变差联系起来，以及将预期和实际响应变量之间的偏差减至最小达到最佳拟合可做到这一点。3.9相关系数correlationcoefficient，R根据样本数据计算的度量两个变量之间线性关系强度的统计量。3.10判定系数coefficientofdetermination，R2回归平方和占总平方和的比例，它是对估计的回归方程拟合优度的度量。4原理2,2-联苯基-1-苦基肼基（简称DPPH）是一种较为稳定的、以氮为中心的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在517nm附近有强吸收。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使DPPH乙醇溶液光吸收减弱。DPPH乙醇溶液褪色程度与其接受的电子数呈线性关系，由此可评价供试品清除自由基的能力，即用半抑制浓度（IC50）评价抗氧化活性的大小，并通过与阳性对照（L-抗坏血酸）抗氧化活性的比较，得到相对抗氧化活性（RAA），以评估不同供试品（如品种、批次等）间抗氧化活性。5环境、仪器、设备及耗材5.1对实验室环境的要求5.1.1实验室的温度控制在25±2℃;5.1.2实验室的相对湿度要控制在45%~55%；5.1.3实验室的照度，一般试验区域不应小于300Lx；对于称重、分析等区域照度不应低于500Lx。3T/TPPAXXX-XXXX5.2对仪器、设备及耗材的要求5.2.1仪器设备电子分析天平（感量0.01mg/0.1mg可调节移液器（20~100μl精度0.02μl、0~200μl精度0.2μl、100~1000μl精度1μl、0.5~5ml精度0.005ml和1~10ml精度0.01ml等全波长酶标分析仪（波长范围200~900nm，吸光度值精确至0.001容量瓶（5±0.02ml、10±0.02ml、25±0.03ml、50±0.05ml和100±0.08ml等超纯水仪；漩涡混合器（转速600-3200rpm）；超声波清洗器（40KHz）；暗箱等。5.2.2主要耗材96孔微孔板（96孔透明平底聚苯乙烯微孔板，带盖，孔容积360µL，建议工作容积75-200µL）；按扣盖聚丙烯微量离心管（2ml、5ml）；微孔滤膜（0.45μm）；移液器吸头（20~100μl、0~200μl、100~1000μl、0.5~5ml和1~10ml）；一次性注射器（2ml、5ml）；铝箔等。6试剂和试药除有另外说明外，所用试剂均为分析纯。6.1乙醇（Ethanol）别名：酒精,乙醇线性分子式：CH3CH2OHCASNo.：64-17-5分子量：46.07ECNo.：200-578-6BeilsteinNo.：1718733等级：液相色谱级（gradientgradeforliquidchromatography）6.22,2-联苯基-1-苦基肼基（2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl）别名：2,2-二苯基-1-苦基肼,DPPH,1,1-二苯基-2-苦肼基自由基EmpiricalFormula(HillNotation)：C18H12N5O6CASNo.：1898-66-4分子量：394.32ECNo.：217-591-84T/TPPAXXX-XXXXBeilsteinNo.：18460816.3L-抗坏血酸（L-AscorbicAcid）别名：维生素C,抗坏血病因子,L-维生素CEmpiricalFormula(HillNotation)：C6H8O6CASNo.：50-81-7分子量：176.12ECNo.：200-066-2BeilsteinNo.：84272等级：认证标准物质（certifiedreferencematerial）、药品二级标准（pharmaceuticalsecondarystandard）6.4供试品（Samples）指需要测定抗氧化活性的中药注射剂或注射剂。6.5仪器分析用高纯水（Ultrapurewaterforinstrumentalanalysis）除另有说明，本方法所用水应符合GB/T33087规定的仪器分析用高纯水规格要求。7测定步骤7.1空白空白溶液的制备色谱乙醇。7.2DPPHDPPH溶液的制备取DPPH标准物质适量，精密称定，加色谱乙醇适量，混合均匀，即得（遮光保存）。DPPH控制溶液的制备精密量取DPPH溶液适量，加入色谱乙醇适量，使其浓度约为60μg/ml混合均匀，即得。测定其吸光度，其吸光度范围为0.70~0.90。说明DPPH溶液和DPPH控制溶液均应现用现配。记录DPPH控制溶液配制中DPPH溶液与色谱乙醇的配制比例，该比例将应用于阳性对照反应溶液和供试品反应溶液的配制过程。7.3阳性对照5T/TPPAXXX-XXXX阳性对照溶液的制备精密称取L-抗坏血酸适量，加高纯水，分别制成每1ml含L-抗坏血酸5~20μg的系列溶液，混合均匀，即得。阳性对照本底溶液的制备精密量取相同体积的上述浓度水平的阳性对照溶液（与DPPH控制溶液的中色谱乙醇的加入体积相同）置于离心管底部，分别精密加入色谱乙醇（与DPPH控制溶液的中DPPH溶液的加入体积相同），混合均匀，置于暗箱反应，即得。阳性对照反应溶液的制备精密量取相同体积的上述浓度水平的阳性对照溶液（与DPPH控制溶液的中色谱乙醇的加入体积相同）置于离心管底部，分别精密加入DPPH溶液（与DPPH控制溶液的中DPPH溶液的加入体积相同），混合均匀，置于暗箱反应，即得。7.4供试品供试品溶液的制备精密称取/量取供试品适量，加高纯水，分别制成一系列供试品溶液，至少制备由高到低的5个不同浓度水平（其浓度水平之比可以参考为1.50：1.25：1.00：0.75：0.50）。供试品本底溶液的制备精密量取相同体积的上述浓度水平的供试品溶液（与DPPH控制溶液的中色谱乙醇的加入体积相同）置于离心管底部，分别精密加入色谱乙醇（与DPPH控制溶液的中DPPH溶液的加入体积相同），混合均匀，置于暗箱反应，即得。供试品反应溶液的制备精密量取相同体积的上述浓度水平的供试品溶液（与DPPH控制溶液的中色谱乙醇的加入体积相同）置于离心管底部，分别精密加入DPPH溶液（与DPPH控制溶液的中DPPH溶液的加入体积相同），混合均匀，置于暗箱反应，即得。7.5吸光度测定精密吸取上述空白溶液、阳性对照本底溶液、供试品本底溶液、DPPH控制溶液、阳性对照反应溶液和供试品反应溶液各200μl，分别加入至96孔微孔板底部，盖上盖板，移入全波长酶标分析仪，测定其517nm处的吸光度。7.6说明如供试品为稀溶液或所含抗氧化活性物质浓度较低，可采取相应的方法（包含但不局限于如下方法：浓缩蒸发、液液萃取、固相萃取、固相微萃取、沉淀法、交换等富集方法）将供试品进行富集后再进行试验。富集过程不应造成供试品中抗氧化活性物质种类和总量的损失，不引入新的干扰物质，并确保经富集后的供试品/供试品溶液与DPPH溶液混合后能够均匀分散。如供试品中含有干扰物质，如干扰物质在517nm处有强吸收或对供试品/供试品溶液与DPPH溶液混合后的均匀分散不利，可采取相应的方法（包含但不局限于如下方法：沉淀、6T/TPPAXXX-XXXX溶剂萃取、离子交换、层析、挥发、蒸馏、固相萃取、膜分离等分离方法）将供试品进行分离后再进行试验。分离过程不应造成供试品中抗氧化活性物质种类和总量的损失，不引入新的干扰物质，并确保经分离后的供试品/供试品溶液与DPPH溶液混合后能够均匀分散。L-抗坏血酸易溶于水，可溶于乙醇，因此以高纯水作为溶剂进行配制，且可确保其反应溶液的均匀分散。DPPH在可溶于乙醇，不溶于水，因此反应溶液的配制中应尽量控制水的比例，以满足供试品能够均匀分散即可。如供试品为固体或半固体，也可称采用分别精密称定后置于容量瓶中，再分别加入一定体积的DPPH溶液（供试品反应溶液）/色谱乙醇（供试品本底溶液），定容至刻度后进行测供试品反应溶液的吸光度建议控制在0.1~0.8之间，且相邻浓度反应溶液的吸光度差值较为均匀。应确保DPPH控制溶液、阳性对照本底溶液、阳性对照反应溶液、供试品本底溶液和供试品反应溶液的反应时间（配制完成至移入全波长酶标分析仪进行测定）的一致。8结果计算8.1计算吸光度变化量关于吸光度变化量的计算公式：∆A阳=（A控–A空） ∆A供=（A控–A空） 式中：∆A阳—阳性对照反应溶液吸光度变化量，即反应溶液中的活性物质捕获DPPH自由基而使反应溶液的吸光度较同浓度DPPH控制溶液吸光度下降的量A阳本—阳性对照本底溶液在517nm处吸光度A阳—阳性对照反应溶液在517nm处吸光度∆A供—供试品反应溶液吸光度变化量，即反应溶液中的活性物质捕获DPPH自由基而使反应溶液的吸光度较同浓度DPPH控制溶液吸光度下降的量A供本—供试品本底溶液在517nm处吸光度A供—供试品反应溶液在517nm处吸光度A控—DPPH控制溶液在517nm处吸光度A空—空白溶液在517nm处吸光度8.2回归分析和半抑制浓度（IC50）的计算7T/TPPAXXX-XXXX8.2.1阳性对照将阳性对照反应溶液浓度作为解释变量（C阳吸光度变化量(∆A阳）作为响应变量，绘制散点图（即以吸光度变化量作为阳性对照反应溶液浓度的函数作图，即C阳—∆A阳图根据散点图的提示（观察是否呈线性再用最小二乘法进行线性回归。必要时，吸光度变化量(∆A阳）可经数学转换，再进行线性回归计算，或者可采用描述阳性对照反应溶液浓 度—吸光度变化量（C阳—∆A阳）关系的非线性模型。应列出回归方程或非线性模型、相关系数（R）和/或判定系数（R2）、残差平方和、线性图（或其他数学模型）。将吸光度变化量(∆A阳）取值设定为0.500，代入回归方程，计算求得阳性对照反应溶液浓度取值（或代入所建立的模型，预测阳性对照反应溶液浓度取值即半抑制浓度（IC50阳计算结果保留三位有效数字。一元线性回顾的回归方程如式3，其半抑制浓度（IC50阳）的计算式如式4。∆A阳=a阳C阳+b阳直线回归 IC50阳=适用于直线回归 式中：∆A阳—阳性对照反应溶液吸光度变化量，即反应溶液中的活性物质捕获DPPH自由基而使反应溶液的吸光度较同浓度DPPH控制溶液吸光度下降的量；响应变量C阳—阳性对照反应溶液浓度（单位：μg/ml解释变量；由于反应溶液的制备采取了阳性对照溶液与DPPH溶液混合的方法，因此反应溶液浓度应按阳性对照溶液浓度分别乘以系数计a—回归方程解释变量系数b—回归方程常量（截距）IC50阳—阳性对照的半抑制浓度（单位：μg/ml即当∆A阳=0.500时对应的阳性对照反应溶液浓度8.2.2供试品将供试品反应溶液浓度作为解释变量（C供吸光度变化量(∆A供）作为响应变量，绘制散点图（即以相应信号作为供试品反应溶液浓度的函数作图，即C供—∆A供图根据散 点图的提示（观察是否呈线性再用最小二乘法进行线性回归。必要时，吸光度变化量(∆A供）可经数学转换，再进行线性回归计算，或者可采用描述供试品反应溶液浓度—吸光度变化量（C供—∆A供）关系的非线性模型。应列出回归方程或非线性模型、相关系数（R）和/或判定系数（R2）、残差平方和、线性图（或其他数学模型）。将吸光度变化量(∆A供）取值设定为0.500，代入回归方程，计算求得供试品反应溶液浓度取值（或代入所建立的模型，预测供试品反应溶液浓度即半抑制浓度（IC50供计算结果保留三位有效数字。一元线性回顾的回归方程如式5，其半抑制浓度（IC50供）的计算8式如式6。∆A供=a供C供+b供IC50供=直线回归适用于直线回归T/TPPAXXX-XXXX式中：∆A供—供试品反应溶液吸光度变化量，即反应溶液中的活性物质捕获DPPH自由基而使反应溶液的吸光度较同浓度DPPH控制溶液吸光度下降的量；响应变量C供—供试品反应溶液浓度（单位：μg/ml解释变量；由于反应溶液的制备采取了阳性对照溶液与DPPH溶液混合的方法，因此反应溶液浓度应按供试品溶液浓度分别乘以系数计a—回归方程解释变量系数b—回归方程常量（截距）IC50供—供试品的半抑制浓度（单位：μg/ml或μl/ml即当∆A供=0.500时对应的供试品反应溶液浓度8.2.3相对抗氧化活性（RAA）根据相对抗氧化活性（RAA）的定义可得式7，为了便于计算，减小误差，统一取吸光度变化量为0.500时浓度进行计算，得式8；计算结果以百分数形式，保留三位有效数字。∆A供/C供RAA供=×∆A供/C供∆A阳/C阳RAA供=×100%……式8式中：C阳—吸光度变化量为∆A阳时对应的阳性对照反应溶液浓度（单位：μg/ml）C供—吸光度变化量为∆A供时对应的供试品反应溶液浓度（单位：μg/ml）∆A阳—阳性对照反应溶液吸光度变化量，即反应溶液中的活性物质捕获DPPH自由基而使反应溶液的吸光度较同浓度DPPH控制溶液吸光度下降的量∆A供—供试品反应溶液吸光度变化量，即反应溶液中的活性物质捕获DPPH自由基而使反应溶液的吸光度较同浓度DPPH控制溶液吸光度下降的量IC50阳—阳性对照的半抑制浓度（单位：μg/ml）IC50供—供试品的半抑制浓度（单位：μg/ml或μl/ml）9结果报告9.1空白溶液吸光度空白溶液吸光度测定的意义在于扣除实验的背景噪声（如溶剂吸光度、96孔微孔板吸光度等干扰），该吸光度参与过程计算，应纳入结果报告。9T/TPPAXXX-XXXX9.2本底溶液吸光度本底溶液吸光度测定的意义在于扣除不同浓度供试品溶液的背景噪声（不同浓度供试品溶液的吸光度等），该吸光度参与过程计算，应纳入结果报告。如阳性对照（L-抗坏血酸）本底溶液和供试品本底溶液在517nm的吸光度与空白溶液的吸光度基本相同（|A空–A阳本|≤0.005；|A空–A供本|≤0.005），在进行多批次检测中可不制备阳性对照本底溶液和供试品本底溶液，以空白溶液吸光度（A空）替代阳性对照本底溶液吸光度（A阳本）和供试品本底溶液吸光度（A供本），吸光度变化量的计算可简化为：（A阳–A阳本）≈A控–A阳……式7（A供–A供本）≈A控–A供……式89.3DPPH控制溶液吸光度因DPPH控制溶液吸光度参与吸光度变化量的计算，应纳入结果报告。9.4反应溶液吸光度阳性对照反应溶液和供试品反应溶液吸光度，应纳入结果报告。9.5反应起始时间和反应时长因中药注射剂（或注射用提取物体）所含成分复杂、空间结构多样，使得不同中药注射剂