2019干细胞生物学真题

一、名词解释〔共２０题，每题２分〕1、干细胞：是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞，是个体发育和组织再生的根底。2、干细胞自我更新：指干细胞通过对称或者不对称分裂产生至少一个保存干细胞特性子细胞的过程，自我更新能够维持干细胞具有多分化的潜能，对于组织特异性干细胞而言，自我更新是维持其终生具有分化潜能的根底。3、IPSCinducedpluripotentstemcells：借助基因导入技术将某些特定因子导入动物或人的体细胞，同时可选择性地在培养液参加特定的小分子物质〔如wnt3a〕，将体细胞重编程为多潜能干细胞。此类细胞在克隆形态、生长特征、外表标记物、基因表达模式、表观遗传学特征、拟胚体形成、畸胎瘤形成和嵌合体形成等方面与ESC相似。有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制；它可以分化成三胚层所有的细胞，进而形成身体的所有组织和器官，在器官再生、修复和疾病治疗方面极具应用价值。4、PGC：(primordialgermcell)是产生雄性和雌性生殖细胞的早期细胞，通常比其周围的其他细胞大，细胞内碱性磷酸酶、酯酶及糖原都呈阳性，易和其他细胞区分。分布：多数脊椎动物原肠胚期的原始生殖细胞分布于肠道、卵黄囊或尿囊基部的内胚层细胞间。迁移：在发育中借变形运动或进入血流而沿肠壁迁移，或进入背肠系膜，最终到达正在发育的生殖嵴处，并和生殖嵴的中胚层细胞共同组成睾丸或卵巢。分化：原始生殖细胞在未进入生殖嵴之前，既可分化为精原细胞，又可分化为卵原细胞，这种分化是由其和不同的生殖嵴细胞的结合所决定的。5、减数分裂：性细胞分裂时染色体只复制一次，细胞连续分裂两次，染色体数目减半的一种特殊分裂方式，是保证物种染色体数目稳定的机制。减数分裂的结果是：成熟生殖细胞中的染色体数目比原始生殖细胞的减少一半。6、肿瘤干细胞：肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞。肿瘤干细胞对肿瘤的存活、增殖、转移及复发有着重要作用。肿瘤干细胞通过自我更新和无限增殖维持着肿瘤细胞群的生命力；肿瘤干细胞的运动和迁徙能力又使肿瘤细胞的转移成为可能；肿瘤干细胞可以长时间处于休眠状态并具有多种耐药分子而对杀伤肿瘤细胞的外界理化因素不敏感，因此肿瘤往往在常规肿瘤治疗方法消灭大局部普通肿瘤细胞后一段时间复发。7、小肠类器官：是指原生动物的细胞质分化形成的、执行着类似于高等动物的某些器官的功能的结构。2011年，HansClevers等首先报道了成人小肠类器官的构建方法，培养及分化的人小肠类器官分别具有小肠上皮组织隐窝和绒毛区域细胞的特征，即同时包括活泼的肠干细胞群和一群终末分化的细胞，重现了体内成熟的肠上皮系统。小肠类器官与小肠上皮组织在细胞组成和形态结构上高度相似，并具有良好的短肽吸收和离子转运功能。人小肠类器官的培养条件与小鼠小肠类器官不同，除了参加根本生长因子外(EGF,Noggin，R-Spondin-1,Wnt-3a)，还需要添加一些激素和维生素类物质，如胃泌素(gastrin)和烟酰胺(Nicotinamide)，可以延长类器官的存活时间。人小肠类器官呈现出芽状结构，增殖的干细胞处于出芽部位。小肠类器官可以长期培养与扩增，需参加DAPT等小分子，那么可以诱导肠干细胞分化为各种终末分化结肠上皮细胞。人小肠类器官模型的建立，有望推动小肠生理与疾病根底研究的开展并且在药物开发、个体化治疗、基因治疗以及再生医学等方面具有巨大的应用前景。8、成体干细胞：存在于已分化组织中的未分化细胞，一类源自于出生后机体组织的细胞，它们具有自我复制和分化产生其起源组织所有细胞类型的能力，但不能产生其他组织的细胞，替代衰老和死亡的细胞,提供稳定的内环境，维持机体功能的稳定，如毛囊干细胞。9、四倍体补偿：四倍体补偿实验〔Teraploidcomplementation〕：人或者动物都是二倍体，在胚胎发育到2细胞阶段的时候，可用电融合的方法使两个细胞融合为一个细胞，获得四倍体胚胎，四倍体胚胎是不能正常发育的，但是可以形成胎盘；如果将一种多能干细胞注入四倍体囊胚，可以获得一个完整的动物个体，那证明移进去的干细胞是多能性〔pluripotent〕干细胞。由于四倍体胚胎只能发育为胚外组织，因此将外源干细胞注入四倍胚胎后所获得的杂合个体，其体内的所有细胞将全部来自于外源的干细胞。因而这一技术也被认为是衡量干细胞多能性(Pluripotency)的黄金标准。10、Ｙａｍａｎａｋａ四因子：2006年日本京都大学ShinyaYamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究。他们把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。11、渐冻症：肌萎缩侧索硬化〔ALS〕也叫运动神经元病〔MND〕，是上运动神经元和下运动神经元损伤之后，导致包括球部〔所谓球部，就是指的是延髓支配的这局部肌肉〕、四肢、躯干、胸部腹部的肌肉逐渐无力和萎缩。早期病症轻微，易与其他疾病混淆。患者可能只是感到有一些无力、肉跳、容易疲劳等一些病症，渐渐进展为全身肌肉萎缩和吞咽困难。最后产生呼吸衰竭。12、治疗性克隆：〔therapeuticcloning〕治疗性克隆指把患者植体细胞移到去核卵母细胞中形成重组胚，把重组胚体外培养到囊胚，然后从囊胚内别离出ES细胞，获得的ES细胞使之定向分化为所需的特定细胞类型(如神经细胞，肌肉细胞和血细胞〕，用于替代疗法。最终目的是用于干细胞治疗，而非得到克隆个体。运用克隆技术获得人体早期胚胎，但目的不是将胚胎培育成人，而是为了提取全能型的胚胎干细胞，然后在适宜的条件下，使其发育成为人体的任何一个器官，包括大脑、肌肉、血液和神经，这些器官组织将用于医疗。13、谱系追踪／示踪：发育过程中干细胞沿着特定的谱系分化，通过永久标记一个细胞，来追踪这个细胞和它的子代细胞的技术。14、正向／反向遗传学:正向遗传学(forwardgenesis)：从表型到基因型。通过大规模随机诱变，使基因发生突变，产生发育异常的突变个体，然后从突变个体的表型寻找突变基因〔基因筛查，研究突变表型及确定突变基因，是传统遗传学手段〕。反向遗传学(reversegenesis)：从基因型到表型。即通过DNA重组等技术有目的地、精确定位地改造基因的精细结构以确定这些变化对表型性状的直接影响。15、NaivePSC:Naïve〔幼稚的〕pluripotency主要指小鼠的胚胎干细胞，用LIF或2i都可以维持小鼠的Naviepluripotency，可以体外无线增值、表达多能性标志、体外分化为三胚层、形成畸胎瘤、形成嵌合体和生殖系转移、四倍体互补实验中形成完整个体。而人的naïvepluripotentstemcell的培养体系需要参加的因子现在仍有争议，但这些培养基都用了2i,MEKi,GSK3i,大局部培养基还用了hLIF，长出的人的多能干细胞的形态与小鼠的相似，将这些人naïvePSC注入到小鼠囊胚中在E10.5可见参与了小鼠胚胎的发育形成嵌合鼠。16、内皮造血转化：在脊椎动物的发育过程中，最早一批的造血干祖细胞(HSPCs)由血管内皮细胞(ECs)转分化而来的过程，这一过程也被称为EHT(endothelialtohematopoietictransition)。目前只知道EHT是在一类具有造血潜能的内皮细胞(hemECs)内发生，但其中的分子机制却并未研究清楚17、条件敲除:通过染色体位点特异性重组酶系统Cre-LoxP和FLP-frt来实现的，可以使靶基因的表达或缺失发生在实验动物发育的某一阶段或某一特定的组织器官，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。二、简答题〔共６题，每题５分〕造血干细胞龛目前有几种答：造血干细胞(hematopoieticstemcell,HSC)位于骨髓的造血微环境即龛(niche)中,它们与龛内特定的细胞相互作用以调节其自我更新和定向分化。胚胎期：AGMniche，造血干细胞的维持和再生潜能。胎盘——造血干细胞发育的胚胎外龛。胎肝——干细胞扩增的重要环境。成人造血干细胞龛有两种：成骨龛和血管龛,其中成骨龛维持静态的HSC微环境,而血管龛调控HSC的增殖、分化和发动等行为。2、正常干细胞＆肿瘤细胞间充质干细胞主要生物学特性①形态学：贴壁生长②具强大的自我更新和多向分化潜能：在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种中胚层细胞的能力；③具免疫调节功能：通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反响，从而发挥免疫重建的功能；④具来源方便，易于别离、培养、扩增和纯化，屡次传代扩增后仍具有干细胞特性；⑤外表抗原不明显，异体移植排异较轻，配型要求不严格⑥〔特殊〕低免疫原性、自身所固有的一定程度的免疫抑制性〔免疫调节能力〕：它可以通过抑制淋巴细胞的增值、抑制抗原提呈细胞分化成熟及功能发挥、抑制CTL细胞形成，增加调节性T细胞比例等多种途径发挥免疫调节作用。标记滞留实验的原理、应用干细胞的细胞周期通常是缓慢或静止的,只在组织替换丧失的细胞时启动,且其细胞分裂呈不对称性,即可以永久的保存比拟古老的DNA链(永生化链)[5]。LRC技术即利用干细胞的慢周期性和不对称分裂特性,利用BrdU在细胞的S期取代胸腺嘧啶嵌入基因组DNA的特点标记细胞,在追踪期内,短暂扩增细胞(transitamplifyingcell,TAC)四次细胞分裂将导致BrdU衰减至不可识别,而干细胞那么可以长时间保存细胞标记,因此可以被追踪、定位,被称为LRCs[6]。胚胎造血、成体造血有何作用胚胎期造血：1.卵黄囊造血：原始造血的主要功能是产生瞬时造血细胞以满足胚胎的直接需求，包括产生原始红系祖细胞，用于氧合；胚胎巨噬细胞，用于组织重塑和防御；原始巨核细胞，用于维持血管。然而，第一波造血并不产生淋巴样细胞或造血干细胞。2.第二波造血：以红髓祖细胞和淋巴祖细胞的出现为标志。3.第三波造血：在胚胎的AGM区产生造血干细胞，之后迁移到胎肝，在那里它们可以产生造血系统的所有类型的细胞。成体造血：〔1〕骨髓造血：出生后在正常情况下，骨髓是唯一产生红细胞、粒细胞和血小板的场所，也产生淋巴细胞和单核细胞。〔2〕淋巴器官造血：在骨髓内，造血干细胞分化出淋巴干细胞，其再分化成T、B淋巴祖细胞〔3〕髓外造血：病理状态下补偿造血。神经系统主要细胞类型神经系统分为中枢神经系统CNS〔脑、脊髓〕，周围神经系统PNS〔神经、神经节、神经末梢〕。CNS包含神经元和神经胶质细胞〔Glia〕，神经元中有许多亚型，神经胶质细胞含少突神经胶质细胞、星形神经胶质细胞。此外，也存在有小胶质细胞和室管膜细胞。PNS包含施万细胞和位于脊神经节内的卫星细胞。三、问答题〔共５提，每题６分〕1、一个成功干细胞治疗应该具备哪些因素？干细胞的剂量、耐受性〔干细胞自身状态〕、治疗路径②宿主的niche状态、疾病状态、其他治疗2、间充质干细胞发挥免疫调控的作用及机制有哪些？3、怎样发现调节成体干细胞自我更新能力的内部调控因子？首先，在基因文库中，进行相关基因的筛选其次，使用RNAi技术或者CRISPRCAS9对相关基因进行脱靶/敲除，研究该基因的缺失对更新的影响。正向遗传学？4、怎样用实验手段来检测一个细胞是否具有发育多潜能性？①体外培养无限增殖：一般来说可以连续传达30代以上，就可以认为是无限传代②体外培养分化：体外培养观察该细胞能否分化成三个胚层的所有细胞〔外胚层、中胚层、内胚层〕③畸胎瘤形成：将该细胞注射到皮下，能够形成畸胎瘤，畸胎瘤内包含三个胚层所有细胞④嵌合体形成：将该细胞注射到受体囊胚中，形成嵌合体动物，具有生殖系遗传特性⑤四倍体补偿tetraploidcomplementation：将发育到2细胞阶段的早期胚胎通过电激等方法将2细胞融合，发育形成四倍体囊胚。然后将该细胞注射到该四倍体囊胚中，可以形成一个完整动物体。因为四倍体胚胎不能正常发育，只能形成胚外组织即胎盘，所以该个体的所有细胞全部来源于该细胞。〔黄金标准！〕⑥外表markers的检测：如Oct4、Sox2、Nanog、SSEA1等5、视网膜黄斑性病变的根本实验流程、意义？实验流程：1、纳入病例：患有新生血管性老年性黄斑变性〔AMD〕的患者，接受过其他方法治疗但没有应答，比方抗VEGF药物眼内注射但最正确矫正视力没有好转甚至逐渐下降。2、用非整合附加载体将新生血管性AMD患者的皮肤成纤维细胞重编程为iPSC，并将它们分化成RPE细胞3、评估将诱导多能干细胞〔iPSC〕分化产生视网膜色素上皮〔RetinalPigmentEpithelium，RPE〕细胞的可行性：比方观察是否形成单层细胞结构，细胞形态特征是否与典型的RPE细胞形态特征一致。4、衡量RPE质量和平安性：1〕进行全基因组甲基化谱分析和基因表达分析，评价这些iPSC衍生的RPE细胞是否表现出与RPE组织一致的DNA甲基化和基因表达谱，基因表达水平。2〕使用免疫缺陷小鼠〔非肥胖的糖尿病/Shi-scid/IL2rγnull

[NOG]小鼠〕检测RPE细胞的潜在致瘤性；要在这些小鼠中没有观察到肿瘤生成。3〕全基因组测序检测单核苷酸变异，蛋白质编码区没有检测到大段的de

novo插入、缺失或DNA拷贝数改变。4〕证实质粒DNA没有整合到基因组DNA中。5、对患者进行了包括视网膜下新生血管膜切除及自体来源iPSC生成RPE细胞移植的手术。术后观察插入部位是否出血，移植片边缘是否卷曲，有无移植物排斥反响或新生血管膜复发的迹象。观察术后1年移植片完整性，最正确矫正视力，是否存在囊样黄斑水肿。意义：老年性黄斑变性〔age-relatedmaculardegeneration，AMD〕是在兴旺国家老年人群中威胁视力的最普遍视网膜疾病之一。新生血管性AMD与黄斑的视网膜下间隙脉络膜新生血管膜异位发育相关。视网膜色素上皮〔RPE〕是支持其上层光感受细胞及下层脉络膜血管系统的单层细胞，病程中发生了RPE的物理破坏和功能障碍。目前治疗AMD的手段包括玻璃体内注射抗血管内皮生长因子〔VEGF〕药物，激光光凝术，手术切除，以及光动力疗法，效果不佳，视力的恢复有限，视网膜和脉络膜也不能防止萎缩。为了克服这些问题，90年代曾进行来自