质粒DNA的微量制备及电泳检测

专业：姓名：专业：姓名：学号：日期：2013年6月4日地点：生物实验中心310装订线课程名称：生物化学实验指导老师：成绩：__________________实验名称：质粒ＤＮＡ的微量制备及电泳检测实验类型：同组学生姓名：无一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得实验目的1、学习并掌握质粒DNA的提取原理和方法2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作3、学习并掌握对电泳检测结果的初步分析实验原理质粒是一种染色体（核质体）外的寄生性的自主复制子，存在于细菌等细胞中，为双链闭环的DNA分子，大小在1-200kb（千碱基）之间，具有自主复制和转录功能,能表达例如抗性、菌毒素等细胞非必需的遗传信息，但其复制和转录必须要利用依赖宿主细胞（细菌）基因组DNA编码的一些酶和蛋白质。质粒能够自发的或人为的在细胞间转移，因此是基因工程技术中将外源基因导入受体细胞的重要载体。细菌DNA和质粒DNA形状上均为双链环形，但二者的分子量相差较大，细菌DNA的分子量在D左右，而质粒DNA的分子量在---D左右。提取纯化质粒的过程中，细菌DNA大多数断裂成线状分子，而质粒DNA则多数仍为双链环状，从而可以将二者分开。2.从细菌细胞中抽提质粒DNA分为三个步骤：细菌培养使质粒大量扩增；收集和裂解细胞,并去掉细菌碎片和核质体DNA；进一步除去蛋白、脂类、RNA等杂质，分离和纯化质粒DNA。本实验采用碱裂解法来分离纯化质粒DNA：在EDTA存在下，经过SDS处理使细胞膜裂解，从而使菌体充分裂解，利用在碱性条件下（NaOH），使核质体DNA与质粒DNA的变性；加入乙酸钾，在中性条件下，核质体DNA与质粒DNA又存在复性的差异，质粒DNA很快得以复性，而细菌核质体DNA分子难以复性，核质体DNA会缠绕附着在细胞膜碎片上通过离心被沉淀下来，质粒DNA则留在上清液内；上清液中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量核质体DNA以及脂质类杂质等，可通过碱性酚-氯仿-异戊醇混合液的抽提去除；含有质粒DNA的上清液用无水乙醇或异戊醇沉淀，这是由于当加入无水乙醇时，其会夺去核酸周围的水分子，使其失水而易于聚合。一般用2倍体积的乙醇或1倍体积的异丙醇沉淀DNA和RNA。获得较纯的质粒DNA。４.碱性SDS法的分离原理：当溶液的pH值调节到大于12时，双链DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA的双链便分离成单链；而超螺旋状态的质粒DNA仅仅是部分氢键被破坏，并且只发生部分双链解离成单链的变化。当再将溶液的pH值调回中性时，单链DNA互相缠绕并且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋地质粒发生复性反应后仍然是小分子，通过离心的方法将两者分开。５.实验过程步骤原理图如下：溶菌酶SDS细菌破细胞壁破细胞膜（含质粒）NaOH（细菌DNA和质粒DNA均通过变性成为线状分子）冰醋酸细菌DNA与变性蛋白和细胞碎片缠绕在一起（不能复性)离心质粒DNA经复性后变为共价闭合环状沉淀：细菌DNA、细胞碎片等酚：氯仿上清：质粒DNA、RNA、可溶性蛋白等离心下层：酚、氯仿中层：变性蛋白无水乙醇上清（水层）：质粒DNA、RNA等离心上清：可溶性杂质等RNase沉淀：质粒DNA、RNA等质粒DNA６.DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定:核酸是一种两性电解质（碱基、磷酸），在pH8.0下，核酸带负电荷，电泳时向正极移动，根据核酸分子所带电荷的多少，分子的大小及构型的差异，可用电泳的方法对核酸进行分离和鉴定。DNA分子在琼脂糖凝胶中有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在碱性溶液中（pH8.3缓冲液）带负电荷，它在电场作用下向正极泳动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即具有不同的相对分子量的DNA片段泳动速度不同，并能区分出不同的区带。DNA片断在凝胶中当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）染色后，在紫外光下可见橙红色带，并可确定DNA片断在凝胶中的位置。７.影响DNA泳动速率（迁移率）的因素有：⑴DNA分子质量的影响：双链DNA分子迁移的速率与DNA分子量对数成反比。分子量越大，迁移率越小。⑵DNA构型的影响：超螺旋DNA＞线状DNA＞开环DNA⑶胶浓度的影响：浓度越低，相同核酸分子迁移越快，一般常用的凝胶浓度为1％～2％；⑷电场强度的影响：电场强度愈大，带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，（一般5V/cm）（电场强度）。而对于大片段电泳，甚至用0.5～1.0V/cm电泳过夜。进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。⑸EB：溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。⑹电泳缓冲液的影响:核酸电泳常采用TAE、TBE、TPE三种缓冲系统，但它们各有利弊。TAE价格低廉，但缓冲能力低，必须进行两极缓冲液的循环。TPE在进行DNA回收时，会使DNA污染磷酸盐，影响后续反应。所以多采用TBE缓冲液。在缓冲液中加入EDTA，可以鳌合二价离子，抑制DNase，保护DNA。缓冲液pH常偏碱性或中性，此时核酸分子带负电，向正极移动。⑺碱基组成与电泳温度的影响:一般影响不大８.质粒DNA不同构型在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速度：环形双链DNA分子有三种构型。第一种是共价闭合环状DNA(coalentlyclosecircularDNA，cccDNA)，它的两条链都保持完整的环状结构，通常呈超螺旋构型，迁移速度最快；第二种是开环DNA(opencircularDNA，ocDNA)，它的双链中的一条保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切口两条核苷酸链中只有一条保持完整的环形结构，即OC构型，迁移速度最慢；第三种是线状DNA，这种质粒的双链断裂呈线状,通称L构型。这三种构型的同一种质粒在琼脂糖凝胶中电泳时，出现不同的迁移速率，走得最快的是超螺旋构型，其次是线性构型，最慢的是开环构型。质粒在琼脂糖凝胶中电泳结果出现：一条带是最好的（超螺旋构型），二或三条带也是正常的。主要仪器设备恒温培养箱37℃；恒温摇床37℃；高压灭菌锅；超净工作台；台式离心机；振荡器；微量移液枪(10，20，200，1000ul)；枪头（10，20，1000ul）及枪头盒；离心管1.5ml及离心管架；制冰机；冰箱；干式恒温器37℃、50℃；微波炉；电泳仪及电泳槽；紫外检测仪。实验试剂及其用途1、实验材料含重组质粒菌种2、实验试剂⑴LB液体培养基⑵氨苄青霉素：100mg/ml⑶溶液Ⅰ【溶液Ⅰ：葡萄糖：增加溶液的黏度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒DNA。EDTA：络合掉Mg等二价离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。Tris·HCl：使溶菌液维持溶菌作用的最适pH范围。】⑷溶液Ⅱ【溶液Ⅱ：SDS：解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。NaOH：破坏氢键，使DNA分子变性。】⑸溶液Ⅲ【溶液Ⅲ：中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA复性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。高盐的3mol/LNaAc或者5mol/LKAc(本实验中所用为KAc）有利于变性的大分子核质体DNA以及K/Na离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。】⑹酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）【酚／氯仿/异戊醇：酚:一种强烈的蛋白质变性剂，能非常有效地去除蛋白质，同时抑制了核酸酶的降解作用。氯仿:有强烈的溶脂倾向，可以溶解细胞膜，同时溶解去除脂质类杂质，此外具有使蛋白质变性并分相的作用。异戊醇:减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。】⑺无水乙醇【乙醇或异丙醇——可以沉淀核酸，当加入乙醇时，其会夺去核酸周围的水分子，使其失水而易于聚合。一般用2倍体积的乙醇或1倍体积的异丙醇沉淀DNA和RNA。】⑻70%乙醇【70％的乙醇——用于洗涤核酸沉淀，其目的是去除盐及挥发性较小的异丙醇。】⑼TE缓冲液（pH8.0）⑽RNaseA（1mg/ml）【RNaseA——用于消化质粒DNA溶液中的残余RNA。】⑾0.5×TBE缓冲液（pH8.0）⑿琼脂糖⒀6×加样缓冲液⒁1mg/ml溴化乙锭（EB）五、实验步骤（一）、细菌培养质粒DNA大量扩增挑单菌落（有Amp抗性）接种于5ml含Amp的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。（二）、收集细菌,碱裂解液提取质粒DNA，纯化质粒DNA操作：1、取1.5ml的过夜培养菌液加入1.5ml离心管中，8000r/min离心1min。2、弃上清液，将管倒置于吸水纸上，使液体尽可能流尽。3、将菌体沉淀加100ul溶液Ⅰ，振荡悬浮菌体，冰浴放置5～10min。（振荡是为了破细胞壁，故动作比较剧烈，之后步骤中的颠倒混匀需要动作比较轻柔，以免破坏了DNA的结构）4、加200ul溶液Ⅱ，盖紧管盖，快速温和颠倒离心管数次，确保离心管内溶液混匀使之变清，冰浴５min。5、加150ul溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒数次使之混匀，冰浴放置5min。6、12000r/min离心8min，将上清液转至另一干净离心管，加入等体积（大约为450ul）的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），振荡混匀，12000r/min离心8min。（离心后，中间分层出若白色物质较多，因再加入一定量的酚氯仿混合液进行一次离心，直至中间分层处白色物质几乎看不见，说明蛋白质已完全变性，防止DNA的水解酶会将质粒DNA分解掉，以至于得不到电泳的结果）7、上清液移入另一干净离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，混匀后置于-20℃冰箱中20min。（核酸在2/3的乙醇中不溶，所以应加入两倍体积无水乙醇，可多不可少）8.12000r/min离心8min，弃上清液，将溶液管口倒置于吸水纸上，使液体尽可能流尽。9、加入1ml70﹪乙醇洗沉淀一次（动作要轻），弃70﹪乙醇溶液，将管口倒置于吸水纸上，使液体尽可能流尽，50℃干燥5min。10、将沉淀溶于50ulTE缓冲液（pH8.0，含20mg/LRNaseA）中，置37℃恒温器中保温30min后，取质粒DNA样液做琼脂糖凝胶电泳鉴定。（三）琼脂糖凝胶电泳1、制胶（1.0％琼脂糖凝胶）在胶模上架好梳子。称取1.0g琼脂糖，置于250ml锥形瓶中，加100ml0.5×TBE电泳缓冲液，加热熔化至无颗粒状琼脂糖，待其冷却至50～60℃后，加入EB，使其终浓度为0.5mg/L，摇匀后立即倒入准备好的胶模中，待胶凝固后，放入电泳槽中，倒入适量0.5×TBE（刚好淹过胶面），拔去梳子备用。（注：EB为诱变剂、致癌物，接触凝胶必须戴手套操作）2、加样取6ul纯化的质粒DNA样品，与1ul6×电泳加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中（注：勿划破或戳穿加样孔，勿带入气泡）。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要换枪头以防互相污染。注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。3、电泳加完样后，盖上电泳槽盖，立即接通电源，使电压调到100V，恒压电泳。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前缘约2cm时，停止电泳（约需30～60min）。4、观察和拍照取出胶块置于紫外灯下观察，DNA存在处可显示出肉眼可辨的橘红色荧光带，再用成像仪进行拍照，以便于分析。（注：紫外光对眼睛有害，观察时戴上防护镜或眼镜，或隔着玻璃或有机玻璃观察）。实验结果及分析质粒ＤＮＡ电泳方向点样孔质粒ＤＮＡ电泳方向点样孔从结果中可以看出，只有一条区带，说明只有一种构型的DNA----超螺旋构型。