免疫学及免疫学检验学+题库答案及免疫荧光检测

一、名词解释第1章概论免疫学：免疫分子：补体：临床免疫学：第2章抗原抗体反应抗原抗体反应：抗原抗体反应特异性可逆性比例性抗原抗体反应的等价带（zoneofequivalence）最适比（optimalratio）带现象（zonephenomenon）第3章免疫原和抗血清的制备免疫原(immunogen)半抗原免疫佐剂多克隆抗体(polyclonalantibody,pcAb)第5章凝集反应凝集反应直接凝集反应间接凝集反应明胶凝集试验第6章沉淀反应沉淀反应絮状沉淀试验免疫浊度测定凝胶内沉淀试验单项扩散试验双向扩散试验免疫电泳技术对流免疫电泳火箭免疫电泳免疫电泳免疫固定电泳第19章补体检测及应用补体免疫溶血法补体结合试验第22章感染性疾病与感染免疫检测感染第23章超敏反应性疾病及其免疫检测超敏反应Ⅰ型超敏反应Ⅱ型超敏反应Ⅲ型超敏反应Ⅳ型超敏反应第24章自身免疫性疾病及其免疫检测自身耐受自身免疫自身免疫病自身抗体抗核抗体第25章免疫增殖性疾病及其免疫检测免疫增殖性疾病免疫球蛋白增殖病本周蛋白血清区带电泳免疫电泳免疫固定电泳第26章免疫缺陷性疾病及其免疫检验免疫缺陷病获得性免疫缺陷综合征第27章肿瘤免疫与免疫学检验肿瘤免疫学肿瘤抗原肿瘤标志物第28章移植免疫及其免疫检测移植主要组织相容性复合体移植排斥反应移植物抗宿主反应(GVHR)血清学分型法二、填空题。第1章概论推动现代生命科学前进的三架战车：分子生物学、免疫学、细胞生物学。免疫学的发展历史可分为三个时期：经验时期、免疫学科形成时期、现代免疫学时期。为保持机体内环境稳定，免疫系统的三大生理功能分别是：免疫防御、免疫自稳、免疫监视。免疫应答的过程主要分为：识别阶段、活化阶段、效应阶段免疫系统的组成包括三部分，分别是：免疫器官、免疫细胞、免疫分子。补体的三条激活途径分别是：经典途径、甘露糖结合凝集素途径、旁路途径。第2章抗原抗体反应在抗原抗体反应中，主要的结合力有：静电引力、范德华力、氢键、疏水作用力。在抗原抗体反应中，主要的特点有：特异性、可逆性、比例性、阶段性。第3章免疫原和抗血清的制备组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备过程中，常用的方法有：反复冻融法、超声破碎法、自溶法、酶处理法、表面活性剂处理法（任写出二种均可得分）。在免疫原和抗血清的制备过程中，可溶性抗原的纯化方法：超速离心法、选择性沉淀法、凝胶过滤法、离子交换层析法、亲和层析法等（任写出二种均可得分）。在免疫原和抗血清的制备过程中，纯化抗原的鉴定的内容主要有：蛋白含量测定、分子量测定、纯度鉴定、免疫活性鉴定。在免疫原和抗血清的制备过程中，抗血清的鉴定内容有：抗体特异性的鉴定、抗体效价的鉴定、抗体纯度的鉴定、抗体亲合力的鉴定。第5章凝集反应在凝集反应中，间接凝集反应的类型主要有：正向间接凝集反应、反向间接凝集反应、间接凝集抑制反应、协同凝集反应。抗球蛋白试验，又称Coombs试验，是检测抗红细胞不完全抗体的一种方法。第6章沉淀反应免疫电泳技术类型主要包括：对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫电泳、免疫固定电泳。第14章免疫细胞的分离及其表面标志检测技术在外周血单个核细胞分离实验中，对分离介质的基本要求有：对细胞无毒、基本等渗、不溶于血浆或分离物质、有一定密度。在淋巴细胞分离过程中，其中的单核细胞去除方法有：贴壁黏附法、吸附柱过滤法、磁铁吸引法、Percoll分层液法。第15章免疫细胞功能检测技术在免疫细胞功能检测技术方面，针对T细胞功能检测方法有：T细胞增殖试验、T细胞分泌功能测定、T细胞介导的细胞毒试验、体内试验。第19章补体检测及应用第22章感染性疾病与感染免疫检测目前公认的肝炎病毒至少有5种：甲型肝炎病毒（HAV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、丁型肝炎病毒（HDV）、戊型肝炎病毒（HEV）。在乙肝病毒检测的过程中，主要检测的五项指标有：HBsAg、抗HBs、抗HBc、HBeAg、抗HBe。在先天性感染中，临床上将以上4种病原菌称为“TORCH”，为产前检查的重点项目，分别是：弓形体、巨细胞病毒、风疹病毒、单纯疱疹病毒。第23章超敏反应性疾病及其免疫检测根据免疫反应的速度和组织损伤的机制不同，将超敏反应分为四种类型，分别是：第I型（速发型超敏反应）、第II型（细胞毒或溶细胞型超敏反应）、第III型（免疫复合物型超敏反应）、第IV型（延缓型或迟发型超敏反应）。第24章自身免疫性疾病及其免疫检测在抗核抗体（ANA）检测方法中，常见的ANA荧光图形有：周边型（核膜性）、均质性、斑点性、核仁型、着丝点型。第25章免疫增殖性疾病及其免疫检测在免疫增殖性疾病中，常见的单克隆免疫球蛋白病有：多发性骨髓瘤、原发性巨球蛋白血症、重链病、轻链病、良性单克隆免疫球蛋白病。在免疫增殖性疾病中，免疫球蛋白异常增生常用的免疫检测方法有：血清区带电泳、免疫电泳、免疫固定电泳、血清免疫球蛋白定量、本周蛋白的检测。第26章免疫缺陷性疾病及其免疫检验在免疫缺陷性疾病中，常见的免疫缺陷病一般特征包括：反复感染、恶性肿瘤、伴发自身免疫病、遗传倾向、多系统病变。在免疫缺陷性疾病中，原发性免疫缺陷性疾病主要有：原发性B细胞缺陷病、原发性T细胞缺陷病、原发性联合免疫缺陷病、原发性吞噬细胞缺陷病、原发性补体系统缺陷病。在免疫缺陷性疾病中，继发性免疫缺陷性疾病主要有：继发性T细胞功能缺陷、继发性低丙球蛋白血症、继发性吞噬细胞功能缺陷、继发性补体缺陷。第27章肿瘤免疫与免疫学检验在常见肿瘤标志物中，胚胎抗原类肿瘤标志物主要有：甲胎蛋白、癌胚抗原。在常见肿瘤标志物中，酶类肿瘤标志物主要有：前列腺特异性抗原（PSA）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、α-L-岩藻糖苷酶测定（AFU）。在常见肿瘤标志物中，激素类肿瘤标志物主要有：人绒毛膜促性腺激素(hCG)、降钙素（calcitonin,CT）。在常见肿瘤标志物中，蛋白质类肿瘤标志物主要有：β2-微球蛋白(β2M)、铁蛋白。第28章移植免疫及其免疫检测在移植免疫实验中，排斥反应类型主要包括四种，分别是：超急性排斥反应、急性排斥反应、慢性排斥反应、移植物抗宿主反应(GVHR)。常见的组织或器官移植有：肾脏移植、肝脏移植、心脏移植与心肺联合移植、骨髓与其他来源的干细胞移植。三、单项选择题免疫应答是一个复杂的连续过程，依次分为哪几个阶段（A）A.识别阶段、活化阶段、效应阶段B.效应阶段、识别阶段、活化阶段C.活化阶段、效应阶段、识别阶段D.活化阶段、识别阶段、效应阶段抗原抗体反应形成明显沉淀物的最佳条件为（C）A.抗体略多于抗原B.抗原略多于抗体C.抗原抗体比例合适D.抗体显著多于抗原用已知抗原（或抗体）检测相应的抗体（或抗原），是根据抗原抗体反应的（A）A.特异性B.比例性C.可逆性D.阶段性弗氏不完全佐剂的组成包括（B）A.液状石蜡、羊毛脂、卡介苗B.液状石蜡、羊毛脂C.液状石蜡、卡介苗D.羊毛脂、卡介苗沉淀反应中的钩状效应是因为（B）A.抗体过量B.抗原过量C.pH浓度过高D.pH浓度过低细胞活力测定常用的简便方法是（B）A.伊红染色B.台盼蓝染色C.HE染色D.美蓝染色正常人外周血T淋巴细胞转化率为（C）A.<40%B.40%～50%C.60%～80%D.80%在CH50试验中，溶血程度和补体含量之间的关系为（B）A.直线B.S形曲线C.抛物线D.正态分布曲线正常血清中，补体含量最高的是（C）A.C1B.C2C.C3D.C4发生III型超敏反应性疾病的始动环节是（B）A.大分子免疫复合物沉积在毛细血管基底膜B.中等大小分子免疫复合物沉积在毛细血管基底膜C.小分子免疫复合物沉积在毛细血管基底膜D.补体激活用免疫荧光法检测ANA有多种核型，不正确的是（D）A.周边型B.均质型C.斑点型（或颗粒型）D.原生质型血清中检测到M蛋白不提示下列疾病（D）A.多发性骨髓瘤B.巨球蛋白血症C.重链病或轻链病D.肾病本-周蛋白的本质是（B）A.尿中微球蛋白B.尿中游离的免疫球蛋白轻链C.尿中游离的白蛋白D.尿中游离的管型物多发性骨髓瘤属于哪种细胞异常（C）A.T细胞B.B细胞C.浆细胞D.单核细胞血清中免疫球蛋白含量缺乏，一般应考虑何种病（C）A.轻链病B.重链病C.免疫缺陷病D.免疫增殖病切除胸腺的新生动物的淋巴结中缺乏何种细胞？（B）A.B淋巴细胞B.T淋巴细胞C.粒细胞D.巨噬细胞沉淀反应中抗体过量的现象称为（A）A.前带B.后带C.等价带D.带现象弗氏完全佐剂的组成包括（A）A.液状石蜡、羊毛脂、卡介苗B.液状石蜡、羊毛脂C.液状石蜡、卡介苗D.羊毛脂、卡介苗直接Coombs试验检测的抗体是（A）A.结合在红细胞表面的IgGB.游离的IgGC.结合在红细胞表面的IgMD.游离的IgM单项扩散试验出现双环的沉淀线是因为（D）A.两种抗原B.两种抗体C.抗体为多克隆抗体D.抗原为性质相同的两个组分扩散率不同Ficoll液单次密度梯度离心后外周血细胞分布由上至下依次为（C）A.单个核细胞、血小板和血浆、粒细胞、红细胞B.血小板和血浆、粒细胞、单个核细胞、红细胞C.血小板和血浆、单个核细胞、粒细胞、红细胞D.血小板和血浆、单个核细胞、红细胞、粒细胞淋巴细胞转化为淋巴母细胞后，其形态学特征为（B）A.细胞大小由大变小B.出现核仁1～4个C.胞浆内空泡逐渐消失D.细胞伪足消失溶血空斑试验用于检测下列何种细胞的功能（B）A.T细胞B.B细胞C.NK细胞D.吞噬细胞Boyden小室常用于测定（B）A.白细胞吞噬功能B.中性粒细胞趋化功能C.白细胞杀伤功能D.淋巴细胞抑制功能在溶血反应中检测试剂中，加入少量钙、镁离子的目的是（C）A.使反应液保持等渗B.抑制补体的活性C.有助于补体激活D.维持反应液的pH值乙型肝炎感染后最早出现的病毒标志物是（A）A.HBsAgB.HBeAgC.HBcAgD.抗-HBs新生儿溶血症发生的条件是（C）A.母亲Rh（+）、胎儿Rh（+）B.母亲Rh（+）、胎儿Rh（-）C.母亲Rh（-）、胎儿Rh（+）D.母亲Rh（-）、胎儿Rh（-）造成系统性红斑狼疮病人免疫损伤的主要机制是（C）A.I超敏反应B.II超敏反应C.III超敏反应D.IV超敏反应人类MHC位于第几对染色体上（C）A.第12对染色体短臂B.第12对染色体长臂C.第6对染色体短臂D.第6对染色体长臂HLA交叉配型的目的是（B）A.检测供者血清有无抗受者HLA抗体B.检测受者血清有无抗供者HLA抗体C.检测供者淋巴细胞表面的HLA抗原D.检测受者淋巴细胞表面的HLA抗原四、简答题第1章概论T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞的主要功能分别是什么？在临床免疫学与免疫检验中，现代免疫学检验技术包括哪些方法？第2章抗原抗体反应抗原抗体反应有哪些影响因素？什么是标记免疫技术？标记免疫技术按检测现象可分为哪些类型？第3章免疫原和抗血清的制备常用的细胞破碎方法有哪些？连接半抗原的载体有哪些？制备半抗原性免疫原的方法有哪些？免疫佐剂有哪些种类?其作用机制是什么？动物采血有哪些方法？抗血清的鉴定包括哪些内容？第5章凝集反应什么叫直接凝集反应？什么叫间接凝集反应？它们之间有何不同？叙述抗球蛋白试验的类型、特点以及临床应用?第6章沉淀反应单向扩散试验的概念和应用？平板法双向免疫扩散试验的概念和应用？免疫固定电泳的概念及临床应用？抗原性质分析出现哪三种结果现象？结果解释？第14章免疫细胞的分离及其表面标志检测技术外周血单个核细胞分离，其分离介质的基本要求是什么？外周血单个核细胞悬液富含淋巴细胞，但又混杂有单核细胞、红细胞和血小板，请问去除单核细胞的方法有哪些？第15章免疫细胞功能检测技术T细胞功能检测内容有哪些？B细胞功能检测内容有哪些？NK细胞活性测定方法有哪些？在检测T细胞的功能时，可选择T细胞增殖试验，请回答其基本原理？第19章补体检测及应用在补体总活性测定中，一般采用CH50测定法，请说明其基本原理。在单个补体成分的测定中，一般采用免疫溶血法，请简述其概念及原理。请简述补体结合试验的概念、实验原理及结果解释？第22章感染性疾病与感染免疫检测请列出目前公认的肝炎病毒种类？乙型肝炎的诊断标志物主要检测指标有哪些？在临床中，乙肝病毒检测常见的指标（俗称：两对半）有哪些？什么叫先天性感染？常见的病原菌“TORCH”只要只的是哪些病毒？第23章超敏反应性疾病及其免疫检测试比较Ⅰ～Ⅳ型超敏反应特点?使用青霉素可能引起哪些类型超敏反应？简述其发病机制。答：青霉素临床应用时有可能引起的超敏反应类型有：I、II、III、IV型。（1）I型超敏反应：指青霉素过敏性休克，其发病机制是青霉素本身并无免疫原性，其降解产物为半抗原，与体内蛋白质结合而产生免疫原性，刺激机体产生特异性IgE，使机体处于致敏状态。当机体再次使用青霉素时，可发生过敏性休克。（2）II型超敏反应：指青霉素过敏性血细胞减少症，其发病机制是青霉素降解产物能与血细胞膜蛋白或血浆蛋白结合获得免疫原性，从而刺激机体产生抗体。这种抗体与和药物结合的红细胞、粒细胞和血小板作用，引起药物性溶血性贫血、粒细胞减少症和血小板减少性紫癜。（3）III型超敏反应：指使用大剂量青霉素等药物可引起类似血清病样的反应，其发病机制是因为患者体内已产生特异性抗体，而大剂量药物尚未完全排除，两者结合形成中等大小免疫复合物所致。（4）IV型超敏反应：指青霉素引起的接触性皮炎，其发病机制是青霉素小分子半抗原与体内蛋白质结合成完全抗原，使T细胞致敏。当机体再次接触青霉素时，可发生接触性皮炎。血清病与血清过敏性休克分属哪型超敏反应？比较发病机制。第24章自身免疫性疾病及其免疫检测自身免疫病都具有哪些共同特性？什么叫自身抗体，其主要特点有哪些？第25章免疫增殖性疾病及其免疫检测在免疫增殖性疾病中，常见的单克隆免疫球蛋白病有哪些？在免疫增殖性疾病中，免疫球蛋白异常增生常用的免疫检测方法有哪些？第26章免疫缺陷性疾病及其免疫检验请列出免疫缺陷病的一般特征？原发性免疫缺陷性疾病有哪些？继发性免疫缺陷病有哪些？什么叫获得性免疫缺陷综合征？其临床特点及典型特征是什么？第27章肿瘤免疫与免疫学检验什么叫肿瘤抗原，其产生的可能机制有哪些？什么叫肿瘤标志物，理想的肿瘤标志物具有哪些特性？第28章移植免疫及其免疫检测什么叫移植排斥反应，根据排斥反应发生的时间、免疫损伤机制和组织病理改变，如何进行分类？常见的组织或器官移植有哪些？排斥反应的免疫监测包括哪些方面？免疫荧光技术（检测抗核抗体（ANA）的实验方案）

荧光免疫技术是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂，用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定。荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两大类。荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流式细胞仪进行自动分析检测，称为流式荧光免疫技术。荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定等。本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(ANA)为例进行实习。抗核抗体(antinuclearantibody，ANA)又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNA、可提取的核抗原(ENA)和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。抗核抗体实验原理

以小鼠肝细胞或某些培养细胞(如Hep-2)作抗原片，将病人血清加到抗原片上。如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。试剂与器材

1．抗原片现多用商品试剂。如需自行制备，方法如下：(1)肝印片制备：取4-8周龄小鼠，断颈杀死后，剖腹取肝。将肝脏剪成平面块，用生理盐水洗去血细胞，用滤纸吸干渗出的浆液。将切面轻压于载玻片上，使其在载玻片上留下薄层肝细胞。冷风吹干，乙醇固定，冰箱可保存1周。(2)Hep-2细胞抗原片制备：Hep-2细胞是建株的人喉癌上皮细胞。经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片，用洗涤洗去培养基。干燥后，用无水乙醇固定。(3)肝切片制备：取小鼠肝组织作冰冻切片，厚4μl。-30℃保存备用。

2．异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人IgG抗体(FITC-抗人IgG抗体)有商品供应，临用时按效价稀释。

3．0.01mol/LpH7.2PBS

4．缓冲甘油取甘油9份加PBS1份。

5.待测血清、阳性和阴性对照血清临床标本筛选获得。

6．器材荧光显微镜、孵箱、有盖湿盒、染色缸、吸管、试管等操作方法

1．准备：检查加样板，生物载片恢复室温，标记。

2．稀释：PBS-Tween缓冲液稀释血清，设阴阳性对照。

3．加样：加样板放于泡沫塑料板上，加25μl稀释后血清，至加样板的每一反应区，避免气泡。加完所有标本后开始温育。

4．温育：将生物薄片盖于加样板的凹槽里，反应开始，室温温育30分钟。

5．冲洗：用烧杯盛PBS-Tween缓冲液流水冲洗生物薄片，然后立即将其浸入盛有PBS-Tween缓冲液的小杯中至少1分钟。不必混摇。

6．加样：滴加20μl荧光素标记的抗人球蛋白（结合物）至一洁净加样板的反应区，完全加完方可继续温育。荧光素标记的抗人球蛋白用前需混匀并以PBS-Tween缓冲液稀释。

7．冲洗：用烧杯盛PBS-Tween缓冲液流水冲洗生物薄片，然后立即将其浸入盛有PBS-Tween缓冲液的小杯中至少1分钟。不必混摇。

8．封片：将盖片直接放于泡沫塑料板凹槽中，滴加甘油/PBS至盖片：每反应区约10μl。从PBS-Tween缓冲液中取出1张生物薄片，用纸擦干背面和四边。还要擦拭反应区间隙。将生物薄片面朝下放在已准备好的盖玻片上，立即查看并调整使盖片嵌入载片的凹槽中。然后继续下1张。结果判定荧光显微镜下观察

1．细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性。抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，否则为阴性。阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。

2．根据细胞核着染色荧光的图像，可区分为：

①均质型：细胞核呈均匀一致的荧光；

②周边型(核膜型)：细胞核周围呈现荧光；③斑点型(颗粒型)：细胞核内呈现斑点状荧光；

④核仁型：核仁部分呈现荧光。

⑤混合型：两种以上核染色；

⑥应用细胞片做抗原片可检出着点型(ACA)注意事项

1．PBS-Tween缓冲液在4℃下可存放两周。

2．根据每次实验的标本量决定需要稀释的FITC标记的抗人球蛋白的量，稀释后可在4℃下可存放1周。

3．血清或FITC标记的抗人Ig应滴加至加样板上，不能直接滴到载片上。

4．载片盖到加样板上后，确保反应区与液滴完全接触后，才开始记时温育。

5．冲洗载片时水流要缓慢，以免冲洗掉基质。载片上的反应区应保持湿润，不要将载片风干。

6．封片进不可用力挤压盖玻片，以免损坏基质。可左右挪动盖玻片以使其正确嵌入载片凹槽里。

7．封片介质含有荧光稳定剂，应保存在2-8℃。封好的载片可于4℃长期保存。实验讨论

方法评价

间接免疫荧光技术是检测ANA最常用的方法。该方法简便、敏感，且可根据核染色形态确定核抗原的类型。鼠肝印片细胞分布不均匀，多有重叠，冲洗时易丢失。Hep-2细胞具有核大、有丝分裂旺盛、核内细胞器较明显、具备人源性抗原的特征，对诊断和鉴别不同类型的自身免疫病十分有利。

检测抗核抗体(ANA）的实验方案ANA简介抗核抗体（antinuclear

antibodies，ANAs）经典定义：针对细胞核成分的一大组抗体谱。抗核抗体新概念（FANA）传统定义：顾名思义是指抗细胞核抗原成分的自身抗体的总称®狭义定义现代定义：是指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称。对ANA的理解已不再局限于核成分，而是指抗核酸(nucleicacid)和核蛋白（nucleoprotein)抗体的总称®广义定义靶抗原分布：

细胞核

细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期抗核抗体检测方法检测细胞内抗原自身抗体“金标准”－IIFANA检测方法进展：仅限于IIF改良法（底物选择、制备方法）试图将ELISA发推广为最基本的筛选方法未获成功复制细胞抗原全部成分极其困难®抗原存在的相对浓度、自然抗原决定簇的二级结构及高级结构荧光染色模型可初步判断相应抗体性质范围或确定抗体特异性IIF法：HEp-2细胞底物（90%以上实验室采用）

#完整的ANAs抗原谱（细胞核、浆、骨架、周期）

#可预测分析ANA靶抗原范围

#经验性强ELISA法：采用高度纯化抗原或全细胞抗原

#抗原谱有限（十余种）

#

假阴性结果

#操作简单快速其他方法：金标法、比浊法

ANA靶抗原多核苷酸：双链DNA、单链DNA、RNA组蛋白：H1，H2A，H2B，H3，H4，H2A-H2B复合物核浆的核糖核蛋白:U1-nRNP、Sm、SS-A(Ro)、SS-B(La)、Ku、Mi-1、Mi-2、核点、增殖性细胞核抗原…核仁抗原：Scl-70、U3-nRNP/原纤维蛋白、RNA多聚酶I、PM-Scl(PM-1)、7-2-RNP(To)、4-6-S-RNA、核仁形成中心（NOR）…核膜抗原：板层素（层粘连蛋白）着丝点：着丝点蛋白……ANA检出率与年龄和性别有关与个体的免疫稳定性相关使用足够敏感的方法，每个人都可检测出一些ANA。_________天然ANA_________生理性自身免疫维持机体内环境的生理稳定。滴度较低，亲和力弱，大多为IgM型。ANA检测方法

初筛抗核抗体：IIF最佳基质：联合生物薄片(HEp-2细胞/猴肝冰冻组织)区分抗核抗体的靶抗原：ELISA、印迹法和免疫印迹法ANA初筛IFT：HEp-2细胞/灵长类肝脏

完整的抗原谱（细胞核及细胞浆）

可预测靶抗原

协助检测其它项目（如ANCA、ENA）ELISA：采用高度纯化的抗原初筛ANA

抗原谱有限

操作简单快速

采用滴定平板技术进行间接免疫荧光实验为了使实验操作标准化，欧蒙开发了滴定平板技术?:滴加标本或标记抗体至加样板的反应区，然后将生物薄片载片盖在加样板表面的凹槽里，这时，载片上的所有生物薄片均与液滴接触，反应同时开始。系统的几何结构决定了液滴的位置和高度。因为液体被局限在一封闭的空间里，所以不再需要传统的“湿盒”。并且可在一致的反应条件下同时温育任何数量的标本。准备：检查加样板是否反应区亲水而周边疏水？如果不是，可用湿纸巾擦拭，必要时可使用家用洗涤剂或ExtranMA01（默克公司），再用水彻底冲洗。需要消毒时，可于3％的SekuseptExtra（汉高公司）中浸泡1小时。只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。不要触及生物薄片。按照要求用记号笔对玻片进行标记。稀释：

按照试剂盒使用说明稀释血清标本。每次实验均需加入阳性和阴性对照。对照血清使用前必须混匀。加样：在加样板的每个反应区加入稀释血清，避免产生气泡。滴加完所有待测标本后才开始温育（一次最多200份）。使用聚苯乙烯加样板。加样体积:10µl/反应区(3x3mm)25µl/反应区(5x5mm)70µl/反应区(7x9mm)温育：将载片盖在加样板对应的凹槽里，反应即开始。确保每个标本均能够与生物薄片相接触，而标本之间不相互接触。室温温育30分钟。清洗：用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。冲洗1秒钟小杯内浸洗5分钟加样：将荧光标记的抗人免疫球蛋白（酶结合物）加入洁净加样板的每个反应区。完全加完所有的二抗后，方可继续温育（最多可加50个载片）。使用连续加样器。加样前应使用加样器混匀。为节约时间，可在第一步温育的同时滴加酶结合物至另一个加样板的反应区中。加样体积:10µl/反应区(3x3mm)20µl/反应区(5x5mm)60µl/反应区(7x9mm)温育：从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载片，5秒钟内用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。注意：为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙。检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一张。从现在开始，注意避免阳光直射载片。室温温育30分钟。清洗：

用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。可在每150ml磷酸盐缓冲液中加10滴(150µl)伊文氏蓝进行复染。冲洗1秒钟小杯内浸洗5分钟封片：

在盖玻片上滴加甘油/PBS。使用聚苯乙烯封片板。从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间隙。将载片的生物薄片朝下置于准备好的盖玻片上，立即检查盖玻片是否放入载片的凹槽里，如有必要，需调整位置，正确放置。然后再进行下一个载片的操作。封片体积:10µl/反应区(3x3mm)10µl/反应区(5x5mm)20µl/反应区(7x9mm)结果判断：荧光显微镜下观察荧光。具体操作荧光工作台的布置清洗载片的擦拭封片

ANA的结果间接免疫荧光法的独特优势

(一种基质–可筛查上百种不同的抗体

)

用HEp-2细胞检测自身抗体ANA荧光模型

核均质型核仁型

核颗粒型

胞浆型

ANA确认实验（1）

IFT:

-HEp-2细胞/灵长类肝脏：特殊的荧光模型

如着丝点、核膜型、核糖体P蛋白、肌动蛋白

ELISA:

-ANA分项(含ENA谱):包被高度纯化抗原

斑点法/印迹法

-ENA谱:采用各种高度纯化的抗原ELISA：抗ENA谱

印迹法：抗ENA谱

印迹法：抗ENA谱免疫印迹法

ANA确认实验（2）Westernblot:HEp-2细胞提取物-

定性-

适宜特别需要（如区分靶抗原Ro52或Ro60）-

检测目前无法纯化的靶抗原的抗体（如PM-Scl、Ku）结

论

初筛实验：

免疫荧光技术(HEp-2细胞/灵长类肝脏）

ELISA

（纯化的多种核抗原）

确认实验：

ELISA

印迹法

斑点法

WesternblotANA谱与相关疾病

相关疾病的ANA谱

ANA的各种荧光模型、靶抗原及相关性高滴度的ANA仅出现在自身免疫性疾病中

自身免疫性疾病

ANA阳性率（％）

系统性红斑狼疮

活动期

95－100

非活动期

80－100

药物诱导的红斑狼疮

100

混合性结缔组织病

100

类风湿性关节炎

20－40

进行性系统性硬化症

20－50

多发性肌炎及皮肌炎

85－95

干燥综合征

30－50

慢性活动性肝炎

70－80

溃疡性结肠炎

70－80

其它风湿病

26

SLE抗核抗体的检出率

靶抗原

检出率（%）

dsDNA

30-90Sm

5-30核糖体P蛋白

5-15周期蛋白I（PCNA）

3ssDNA

70-95组蛋白

40-80U1-nRNP

15-40SS-A

20-60SS-B

10-20Ku

5-10心磷脂、b2-GP1

20-40抗细胞抗体荧光模型(immunofluorescentpattern)常见的荧光染色模型有6种：核均质型（homogeneous

pattern，H）核颗粒型（Granuloguspattern，S）核仁型（nucleous

pattern，N）核膜型（membranous

pattern，M）着丝点型（centromert

pattern，ACA）胞浆型（cytoplasmic

pattern，ACYA）

HEp-2细胞/灵长类肝脏：核均质型

ssDNA/dsDNA

靶抗原：单链、非天然DNA（嘌呤和嘧啶硷基对）

双链、天然DNA（脱氧核糖核酸结构）相关性：

ssDNA

类风湿

80.8%

SLE

40.0%

干燥综合征

44.0%

皮肌炎

12.3%

类风湿性关节炎

51.7%

献血员

6.8%

SLE

30%-90%抗dsDNA：绿蝇短膜虫

组蛋白靶抗原：组蛋白H1、H2A、H2B、H3、H4

（主要抗原H1和H2B）功能：

形成核小体

相关性：药物诱导性LE:100%（唯一的标志抗体）

SLE：

40%-80%

其它风湿性疾病：

少见

HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗RNP/SmU1-nRNP靶抗原：与U1-nRNA连接的3个蛋白分子（70K、A和C蛋白）功能：切割pre-mRNA相关性：MCTD:

95%-100%

SLE:

15%-40%抗Sm抗体

靶抗原：与U1-、U2-、U4-、U5-或U6-nRNA

连接的6种不同蛋白分子

（coreproteinsB,B´,D,E,F,G）功能：切割pre-mRNA相关性：SLE:

5%-30%HEp-2细胞/灵长类肝脏:抗核糖体P蛋白抗核糖体P蛋白抗体抗原：核糖体的亚单位(60S),3个蛋白分子组成:P0、P1、P2（38、19、17kDa）。

在碳末端具有相似的免疫反应表位。功能：蛋白合成易位过程中的辅蛋白相关性：SLE：5%-15%

原发性干燥综合征的抗体谱靶抗原

阳性率（%）SS-A

40-95SS-B

40-95ssDNA

40-95HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗SS-A/SS-B抗SS-A抗体靶抗原：与Y1,Y3,Y4或Y5型RNA连接的2个蛋白（52kDa和60kDa）功能：

调节mRNA的转译活性相关性：干燥综合征：40%-95%

SLE:

20%-60%

抗SS-B抗体靶抗原：与小分子RNA（U6-RNA,pre-tRNA）结合的磷脂蛋白（48kDa）功能：

RNA多聚酶III的辅蛋白相关性：干燥综合征：40%-95%

SLE:

10%-20%

进行性系统性硬化征的抗体谱

靶抗原

阳性率（%）

着丝点

80-95

Scl-70

25-75

ssDNA

30-60

原纤维蛋白

5-10

RNA聚合酶

4

PM-Scl（重叠综合征）

3

NOR-90（核仁形成区）

少见

Ku（多肌炎型重叠综合征）

1-7HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗着丝点抗体抗着丝点抗体靶抗原：连接动粒（着丝点）上的4个蛋白分子：A-、B-、C-、D-蛋白，分子量（17、80、140、50kDa)

主要的靶抗原：着丝点B蛋白（与IIFT相关性：100%）功能：与纺锤体纤维连接相关性：硬皮病：18%局限性硬化征(CREST综合征):80%-95%HEp-2细胞/灵长类肝脏：抗Scl-70抗Scl-70抗体靶抗原：DNA拓扑异构酶I（100kDa）功能：DNA复制和翻译过程的辅蛋白相关性：硬皮病：25%-75%HEp-