免疫组化的基本原理操作流程及注意事项

免疫组织化学的概念底物抗原一抗酶免疫组化原理根本原理：抗原抗体反响即让抗原与抗体特异性结合，再通过化学反响使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)对其进行定位、定性及定量的研究.免疫组织化学技术的开展历史1940年，Coons免疫荧光技术，冰冻切片1974年，Taylor石蜡组织免疫组化技术20世纪90年代，Avrameas建立酶标技术，即辣根过氧化物酶标记特点：特异性强

敏感性高

定位准确、形态与功能相结合

多克隆抗体〔PcAb)：利用抗原免疫动物后所获得的免疫血清中所提取的免疫球蛋白。1890年抗毒素的出现，标志着第一代抗体－多克隆抗体的产生。它的特异性相对低于McAb,但亲和力高。单克隆抗体〔McAb):通过杂交瘤技术制备出的只针对一种抗原决定簇的抗体。1975年抗绵羊红细胞抗体的出现，标志着第二代抗体－单克隆抗体的产生。它特异性及纯度都比较高，但产量较低。免疫组化图片其他方法图片〔WB法〕常用的免疫组织化学技术方法免疫荧光技术〔免疫荧光法〕免疫酶技术〔酶标抗体法、桥法、ABC法等〕免疫金属技术〔免疫铁蛋白法、免疫金染色法等〕免疫荧光法直接法：用荧光素〔FITC、TRITC等〕标记的特异性抗体直接与相应的抗原结合，检测抗原。优点：简单，时间短，特异性强。

缺点：灵敏度低，所需抗体量大

应用：肾穿荧光素抗体抗原间接法先用特异性的抗体1与标本上的抗原反响，再用荧光素标记的特异性抗体2〔间接荧光抗体〕与特异性抗体1相结合形成复合物。荧光素抗体1抗原抗体2补体法用特异性的抗体和补体的混合液与标本上的抗原反响，补体就结合在抗原抗体复合物上，在用抗补体的荧光抗体与之结合。双重免疫荧光法在同一个标本上检测两种不同抗原。即用两种不同抗体上分别标记不同颜色的荧光素，反响后每一种颜色表示一种抗原。免疫酶法原理与免疫荧光法根本相同，免疫酶法是将酶以共价键的形式结合在抗体上，制成酶标抗体，再借助酶对底物有特异行催化作用，生成有色的不溶性产物或者具有一定电子密度的颗粒，用于光镜或者电镜显示。能用于免疫组化技术的酶主要有3种：辣根过氧化物酶〔HRP〕最常用、最实用碱性磷酸酶〔AKP〕能防止内源性干扰葡萄糖氧化酶〔GOD〕其形成的色素容易扩散，且分子量大容易聚集免疫酶法分类直接法用酶标记的特异性抗体直接与标本中抗原反响结合，再与酶的底物作用产生有色产物，沉积在抗原抗体反响的部位，即可以对抗原进行定性、定位甚至定量研究。加底物酶一抗抗原间接法先用特异性抗体〔一抗〕与标本中相应抗原反响，再用特异性酶标抗体〔二抗〕与结合在抗原上的一抗反响，加底物显色。注意动物种属关系：比方标本是人组织，一抗要用其它动物抗人的抗体如鼠抗人，二抗就要为兔抗鼠或者羊抗鼠。优点：用一种酶标抗体就可以与多种特异性一抗配合而检查多种抗原，敏感性也大大加强。酶桥法用化学交联法将酶与抗体分子结合的技术改为酶与酶抗体免疫反响而结合的方法。防止了由于化学反响过程中对酶活性和抗体效价的不良影响。PAP法将酶和抗酶抗体制成复合物〔PAP〕取代酶桥法中的抗酶抗体和结合的酶，缩短一步。APAAP法利用桥抗体将AKP连接在第一抗体的结合部位，而AKP和抗AKP被制成复合物〔APAAP〕。免疫金银法〔IGSS〕免疫金法用胶体金标记的间接抗体或A蛋白与特异性抗体结合，在光镜下就可见红色反响物出现。要求抗体浓度高，结果也不敏感。免疫金银法在前法的根底上加含银的显影液，使金离子周围形成很多沉淀，在光镜下就可以看到棕黑色颗粒。从而提高敏感性，抗体浓度比前法也有一定下降。亲和免疫组织化学技术〔affinityimmunohistochemistry〕生物素〔维生素H，Biotin〕首先是从鸡蛋黄中别离出来的，广泛存在于动、植物中。分子量小约为244k，与卵蛋白有极强的亲和力，比抗原抗体的亲和力高100万倍！卵白素〔Avidin〕鸡蛋白中的一种碱性蛋白，性质稳定，与其它物质〔如荧光素和酶〕具有很高的亲和力。当与生物素结合后更加稳定，在很大pH范围类对许多蛋白酶都有耐受能力。过氧化物酶O〔peroxidase)可以使DAB显色。Envision法原理：用多聚螯合酶〔AP或者HRP〕标记二抗IgG，再与一抗结合。因为多聚螯合物上有大量的AP或者HRP分子，所以它比传统方法更加敏感，放大倍数更大〔比ABC法、SP法高几十倍〕。多聚物在人体内不存在，因此减少了非特异性，降低背景。免疫组化操作步骤：〔以DAKO试剂盒为例〕免疫组化质量控制实验前：

包括标本固定、脱水、切片、抗体选择、人员素质、实验室条件等等。实验中：

各个关键指标的控制如抗原修复、一二抗孵育时间及温度、抗体滴加、显色控制、对照等等。实验后：

专家对结果的评判，室间质评，CAP教育等等。固定标本的固定和组织处理固定液、固定时间：10%中性福尔马林；固定时间6-48H，细针

穿刺标本大于1H组织处理条件：浸蜡、烤片温度不能高于65℃固定：固定是为了保持细胞、组织的原有形态和结构。从免疫组化技术的角度，固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，而是要1>尽量减少或终止外源性酶和内源性酶的反响2>防止细胞的自溶，以免使抗原扩散至组织间质3>以保持组织的固有形态和结构4>保持组织或细胞的抗原性，不但要使抗原不导致失活，而且不使抗原发生弥散的现象这样才能在免疫组化染色时，不产生过深的背景，影响阳性结果的判断。

实践说明：固定时间过短、过长都会会导致阳性信号减弱或消失。标本固定的时间：常用中性甲醛的渗透速度是2mm/h，随着时间延长速度会逐渐减慢，增加浓度反而会降低渗透速度。一般手术标本用中性甲醛固定的时间以3～24h为佳。小组织固定时间大于3h，大组织固定时间应大于18h。抗原修复的重要性：

组织在用甲醛固定的过程中所形成的醛键可封闭抗原的决定族。甲醛在保存进程中会形成羟甲基，也可封闭抗原决定族。在组织固定过程中，甲醛与蛋白质发生交联，形成醛交联蛋白，这种化合物封闭了抗原，使之无法表达出来。所以在用石蜡切片做免疫组化时进行抗原修复暴露抗原是十分有必要的。抗原修复的几种方式：热修复〔高压法、微波法、水浴法〕酶消化〔胃蛋白酶、胰蛋白酶〕CD68、Vim、EGFR、CollagenIV等目前抗原修复最突出和最顽固的问题是修复不够各种热修复方法染色强度比较高压法>水浴法>微波法抗原修复液常用的有枸橼酸缓冲液〔pH6.0〕、EDTA缓冲液〔pH8.0～10.0〕高压修复具有压力稳定、受热均匀、阳性检出率和阳性强度高、背景着色少等优点.pH8.0—pH9.0的EDTA-Tris修复液修复4min胞核胞浆胞膜染色阳性均较强且不易脱片分析中每一种新抗体在应用于临床之前必须进行

实验验证严格执行实验室的SOP日常质控：抗原修复液的PH、抗原修复温

度等实验条件的质控实验对照：阳性、阴性组织对照及阴性试

剂对照抗体Received接收所有免疫组化试剂接收时均应标明接收日期，并在?免疫组化试剂登记表?上登记。Storage储存所有试剂均应在厂家指定或建议的温度下保存，储存试剂的冰箱应每天检查并记录温度。Usage使用所有试剂使用时均应标明开封日期，试剂应保证在有效期内使用，过期试剂应丢弃不用，并在?免疫组化试剂登记表?的“过期弃用时间〞中注明。Lable试剂标签试剂和溶液的标签应包括以下要素：内容及质量、浓度或效价；储存要求；实验室配制的日期；有效期。以上要素应记录在?试剂配制记录表?中。抗体存放新购进的浓缩型干粉样抗体需分成假设干份小剂量保存，防止反复冻融或开启造成抗体效价降低或污染。分装的抗体需标明名称、批号、分装日期、有效期。小剂量的浓缩抗体那么按照说明书的存储条件存放。缓冲液〔Buffer〕

每一批新购进或新配制的缓冲液〔包括修复液〕都要使用PH仪认真检测其PH值，检测结果要记录在?缓冲液校准表?中，缓冲液要定期检查溶液的PH值〔至少每周一次〕。特别是在日常质量控制中的某些抗体染色强度减弱原因不明，那么必须重新检测缓冲液的PH值。PH值不正确的缓冲液应弃去不用，重新配制合格的缓冲液，并在?缓冲液校准表?相应日期栏中注明其PH值及“弃用〞字样。免疫组化抗体的实验方法验证

免疫组化实验室将某种抗体用于病人的诊断之前，应对该抗体进行实验验证。对于一个新的抗体，应该摸索其染色条件，保证有足够的实验批次来检测其敏感性和特异性。验证实验1、通过比较实验确定抗体滴度、抗原修复的方法2、孵育时间以及缓冲液的类型、PH值等最适宜的实验条件，3、结果的可重复性4、同时通过屡次的重复性检测来确定该试剂的敏感性和特异性。这对于文献报道较少的抗体尤其重要。通过实验确立最正确的抗体滴度、抗原修复条件以及其它辅助试剂的类型、浓度。抗体的滴度参考厂家推荐的抗体滴度并在前后各加设定一个实验滴度，例如厂家推荐滴度为1：200：那我们的验证实验滴度就设为A1：100、B1：200、C1：400通过验证至少三个滴度梯度来观察阳性细胞染色强度及非特异性染色，确后确定最正确滴度。IHCanalysisforPCBPR277X2101study送检22个冰冻皮肤组织20个石蜡包埋组织合计21个病例，每个病例分别送检untreated、treated合计42个蜡块另送检三个正常皮肤组织蜡块，做阳性对照由上海诺华CNIBR提供。ReceiveantibodyandsamplesAnti-DSC1antibodyProducedinrabbitCat.No:HPA012891(Sigma)Lotnumber:A31773Anti-DSC2antibodyProducedinrabbitCat.No:HPA011911(Sigma)Lotnumber:R03475Anti-FLGantibodyProducedinrabbitCat.No:HPA030189(Sigma)Lotnumber:R28868Anti-TSLPantibodyProducedinrabbitCat.No:LS-B614(Lifespan)Lotnumber:LS13610RabbitisotypecontrolantibodyProducedinrabbitCat.No:AB-105-CLotnumber:UnknownAnti-Claudin-1antibodyProducedinrabbitCat.No:519000(LifeTechnologies)Lotnumber:985527AHumantissueblocks32021-08-282021-08-3122frozensamplesand20blocksamplesTitrevalidationFirstvalidationAntibodyConcentrationExperimenttitrePrimaryantibody,IgGDSC-10.575ug/ml1:2001:4001:8001:400FLG0.76ug/ml1:7501:15001:30001:1500DSC-20.3ug/ml1:501:1001:2001:100TSLP0.4ug/ml1:12501:25001:50001:2500Claudin-10.9ug/ml1:1501:3001:6001:300TitrevalidationSecondvalidationAntibodyConcentrationExperimenttitrePrimaryantibody,IgGDSC-10.575ug/ml1:8001:16001:32001:1600FLG0.76ug/ml1:30001:30001:30001:3000DSC-20.3ug/ml1:501:1001:2001:100TSLP0.4ug/ml1:5001:10001:20001:1000Claudin-10.9ug/ml1:6001:6001:6001:600ResultsoffirstvalidationAntibodyExperimenttitrePrimaryantibody,IgGDSC-11:200Positivestaininglocationisspecific,butnon-specificstainingcanbeobserved.Furtherdilutionissuggested1:400Positivestaininglocationisspecific,butnon-specificstainingcanbeobserved.Furtherdilutionissuggested1:800Positivestaininglocationisspecific,butnon-specificstainingcanbeobserved.Furtherdilutionissuggested1:400Nonon-specificstainingisobserved.FLG1:750Positivestaininglocationisspecific,butnon-specificstainingcanbeobserved.1:1500Positivestaininglocationisspecific,butnon-specificstainingcanbeobserved.1:3000Positivestaininglocationisspecific,andnonon-specificstainingisobserved.Cancontinuewiththestabilityvalidation1:1500Nonon-specificstainingisobserved.DSC-21:50Positivestaininglocationisnotspecific，otherblocksamplesissuggestedtobeusedforanothertry.1:100Positivestaininglocationisnotspecific，otherblocksamplesissuggestedtobeusedforanothertry.1:200Positivestaininglocationisnotspecific，otherblocksamplesissuggestedtobeusedforanothertry.1:100Nonon-specificstainingisobserved.TSLP1:1250Positivestainingisweek，titreissuggestedtobeadjusted.1:2500Positivestainingisweek，titreissuggestedtobeadjusted.1:5000Positivestainingisweek，titreissuggestedtobeadjusted.1:2500Nonon-specificstainingisobserved.Claudin-11:150Positivestaininglocationisspecific,butnon-specificstainingcanbeobserved.Furtherdilutionissuggested1:300Positivestaininglocationisspecific,butnon-specificstainingcanbeobserved.Furtherdilutionissuggested1:600Positivestaininglocationisspecific,andnonon-specificstainingisobserved.Cancontinuewiththestabilityvalidation1:300Nonon-specificstainingisobserved.StartwithclinicalsampleFrom2021-09-11,HEstaining,IHCstainingforDCS-1andFLGisperformed.Thestainedslidesisscheduledtobescorednextweek.那么选取十个不同个体的病例，〔特殊病种可酌情减少个体病例〕进行检测验证。工作液：3-5个病例乳腺癌：ERPRHER240个病例免疫组化验证实验的过程必须详实地记录，操作步骤应记录在?免疫组化抗体验证实验记录表?中。最后由病理主任或指定的病理医生应对验证?免疫组化抗体滴度及验证条件确定表?所有实验室使用抗体验证结束后统计其抗体厂家、克隆号、实验滴度、抗原修复方法、实验组织类型、阳性率等填写在?免疫组化验证实验抗体一览表?中。验证报告批次验证疫组化和特殊染色实验室每购进一批新抗体或特染试剂应用适当的控制方法与旧抗体或试剂进行实验并比较实验结果适当调整抗体的稀释度，以确保染色强度不发生太大改变。比较的结果及抗体稀释度的改变需经病理主任或指定的病理医生观察确认和审批，并记录在?批次抗体比较结果?中。新抗体才可以投入实验室常规使用。对照的重要性阴性对照是用确定不含有待测抗原的组织作为阴性对照组织。阳性对照是对照组织中含有的抗原。空白对照通常用PBS代替一抗做对照。我们在日常工作中设置阳性对照最关键，通常是用阑尾加扁桃体和肠癌来做阳性对照组织，因为这三种组织中含有多种组织成分如上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等，可以满足大局部需要。另外一些可以自设对照组织。最好是做成“春卷〞或者组织芯片作为对照。扁桃体Tonsil,应该包括上皮用于高分子Cytokaratin和cyclinD1,淋巴组织用于不同的白血球阳性对照结肠组织，作为cytokeratin20(结肠上皮),chromogranin(内分泌细胞),calretinin(ganglioncells)阳性对照甲状腺组织前列腺组织乳腺癌表达c-erbB2的组织胸腺瘤Thymoma,淋巴细胞丰富(B型胸腺瘤),含有丰富的不成熟T细胞,作为TdT,CD1,CD99的标志.胸腺瘤比正常成人胸腺好是因为前者含有规那么的实体组织,而后者有许多散在脂肪(adipose)细胞因此胸腺实质可能在某些切面看不到.脑组织,用脑切除或尸检材料肺组织,肝,使用HCC手术标本,选取肝硬化局部并且HBV阳性的标本.子宫肌层myometrium,可对ER,PR提供非常好的对照,因为染色通常是中度到弱,因此这个组织可以作为一个好的免疫组化敏感性指标.子宫肌层用于代替正常乳腺作为激素受体的对照是因为后者散在的纤维组织和正常的腺泡会产生多变的染色结果.人胎盘绒毛组织人胚胎羊膜作为包裹“春卷〞组织(从胎盘外表剥离出)，可以额外提供CA-125的阳性对照。实验室外部的质量评估CAP-MK评估实验室所用免疫组化试剂、方法的质量、稳定性及缺乏之处，通过与参评的外部实验室的比对提供改进工作的依据分析后免疫组化报告报告指南a、所有的免疫组化染色资料不管对诊断重要与否都必须报告b、报告还应该包括标本的类型及所用试剂，如抗体的克隆号等c、免疫组化报告要包括所有的染色结果，并解释所有的染色信息，如染色强度、面积及亚细胞分布即染色定位。现行染色强度的报告标准：强染色-4X或10X视野可见明显的阳性染色；弱染色-只在40X视野可见染色信号；染色阳性细胞百分数，以0-4+计数：除ER、PR、HER2、P53、Ki67外其他抗体适用0：即阴性，无阳性染色细胞存在；1+：阳性染色细胞1-25%；2+：阳性染色细胞26-50%；3+：阳性染色细胞51-75%；4+：阳性染色细胞76-100%。HER2对乳腺癌患者适用：0：无阳性染色细胞，为阴性；1+：＜10%的浸润性癌细胞出现弱的一致性的完整的细胞膜染色，或任何比例弱的、不完整的细胞膜染色，为阴性；2+：≥10%的浸润性癌细胞不一致性完整的、弱的细胞膜染色，或≤30%的细胞强的、完整的细胞膜染色，为不确定；3+：＞30%的浸润性癌细胞一致性的强的完整的细胞膜染色，为阳性。胃癌HER20：无阳性染色细胞，为阴性；1+：着色隐约可见；2+：弱-中等着色3+：强着色活检标本：≥

5个癌细胞手术标本：≥

10%的癌细胞肿瘤分类：肠型约30%

混合型约15%

弥散型约5%

印戒细胞癌多为阴性肿瘤部位：贲门、胃食管交界癌约30%，全胃癌约15%P53、Ki67适用：0：即阴性，无阳性染色细胞存在；1+：阳性染色细胞＜5%；2+：阳性染色细胞5-9%；3+：阳性染色细胞10-49%；4+：阳性染色细胞≥50%。以上分级标准参考CAPImmunohistochemistySurveyMK中的计分系统P53Ki67免疫组化的临床应用a、疾病诊断与鉴别诊断

b、预后判断

c、指导治疗

应用原那么

a：HE形态学为根底b：应用抗体做辅助诊断时尽可能应用抗体组合防止错误诊断c：注意人为的陷阱d：抗体组合要合理，在解释结果时，要对每一种抗体的染色结果做出合理、科学的解释e：免疫组化结果与HE形态学相矛盾时，应结合形态学结果综合判断，不能只应用免疫组化做诊断疾病的诊断与鉴别诊断确定细胞分化CK：大多数上皮分化的细胞、肌上皮分化的细胞、纤维母及肌纤维母细胞等Vimentin：大多数间叶分化的细胞、少局部上皮分化的细胞等LCA：淋巴造血细胞S100：神经嵴分化的细胞、局部上皮细胞器官特异性抗体

TG：甲状腺滤泡上皮细胞TTF-1:甲状腺、肺泡上皮PSA：前列腺Heppar-1:肝细胞GCDFP-15：乳腺SP-A&B：肺泡上皮病变组织细胞中某些成分的增加或缺失协助确定疾病的性质肌上皮细胞：P63、MHC、SMA等基内幕胞：34βE12、P63、CK5/6等细胞抗原表达的丧失：如T细胞P53、Ki67、Bcl-2等表达的异常，协助确

定某些病变的性质FL3:Ki67RFH:Ki67FL1:Ki67Follicularlymphoma〔Bcl-2immunostaining〕未知原发部位转移癌的诊断CK：有用的上皮性标记

但可表达于以下肿瘤

肉瘤-SS、ES、MHF

生殖细胞肿瘤-胚胎性癌、绒毛膜癌

黑色素瘤-特别是转移性

淋巴瘤CK7/CK20CK7+/CK20+CK7+/CK20-CK7-/CK20+C