门脉高压症药物治疗的疗效评价及相关气体分子的研究

门脉高压症药物治疗的疗效评价及相关气体分子的研究石河子大学硕士学位论文门脉高压症药物治疗的疗效评价及相关气体分子的研究姓名张永申请学位级别硕士专业内科学指导教师郑勇2021-05摘要目的通过超声定位直接测量肝硬化患者生理状态下的门静脉压力评价心得安单硝酸异山梨醇酯依姆多单用或者连用治疗门脉高压症的疗效为临床门脉高压症的治疗提供可靠临床资料并比拟门静脉及外周静脉血中HSNOCO的含量的变化2材料和方法1研究对象本课题将收集肝硬化门脉高压症患者30例男15例女15例以上患者均未发生过上消化道出血及未行食道胃底静脉套扎术肝硬化门脉高压症诊断标准和治疗方案均依据内科学第七版教材第十四章?肝硬化?制定的标准进行2．给药方法采用自身个体治疗前后对照研究给药方法将病人随机分为三组即心得安组单硝酸异山梨醇酯组及两者联用组心得安组初始计量为10mg一日三次口服如患者心率未降低25可逐渐增加计量直至到达要求单硝酸异山梨醇酯组初始计量为60mg一日一次口服如患者出现难以耐受的头痛那么给予30mg一日一次口服联合用药组给予心得安10mg一日三次口服加依姆多30mg一日两次口服3测压方法本试验采用超声引导下经皮经肝门静脉穿刺测压的方法测量门静脉压力并在测压过程中留取患者门静脉血4血浆中气体分子的测量采用双抗体夹心法测量门静脉及外周静脉血中NOCOHS的含量2结果1病例收集上述30例患者中心得安组及联合用药组各有2例患者因经济及个人原因未行第二次测压单硝酸异山梨醇酯组有2人因不能耐受的疼痛调整用药2门静脉压力测定心得安组与单硝酸异山梨醇酯多比拟差异无统计学P005联合用药组与单硝酸异山梨醇酯组比拟差异有统计学意义P005联合用药组与单用心得安组比拟差异无统计学意义P0053血浆中气体分子的测量药物治疗前与药物治疗后门静脉血及外周静脉血中NO浓度比拟心得安组NO含量降低而其他两组升高药物治疗前与药物治疗后门静脉血及外周静脉血中CO浓度比拟三组均降低药物治疗前与药物治疗后门静脉血及外周静脉血中HS浓度比拟三组均升高2结论1在肝硬化门脉高压症治疗中单用心得安或依姆多均可有效降低肝硬化患者门静脉压力P＜005但小局部患者单用依姆多门静脉压力无明显变化I2在肝硬化门脉高压症治疗中联合用药的治疗效果优于单用依姆多P＜0053联合用药与单用心得安比拟门静脉压力降低的情况无明显统计学差异P0054HSNOCO等气体分子在肝硬化门静脉高压的形成及开展过程中具有重要的调节作2用5降低门静脉压力的药物在降低门静脉压力的同时可对患者体内NOCOHS合成与消2耗产生影响关键词心得安单硝酸异山梨醇酯门脉高压症一氧化氮一氧化碳硫化氢IIAnstractObjectivesUltrasoundpositioningdirectmeasurementofcirrhosisportalveinpressureunderthephysiologicalconditiontoobservethepropranololisosorbidemononitratealoneorinconjunctionInthetreatmentoftheeffectofportalhypertensionAndcomparetheportalandperipheralbloodH2SNOCOinthecontentchangeMaterialandMethods1ResearchobjectThissubjectwillcollectcirrhosisportalhypertensionpatients15cases30casesmalefemalein15patientspatientswerenotoccurringmorethanagastrointestinalbleedingandnotdoesophagealstomachbottomveinintraoperativeinfluenceCirrhosisportalhypertensiontreatmentdiagnosticcriteriaandseventheditiontextbooksarebasedoninternalenactedinchapter14"cirrhosisofthestandards2GivemedicinemethodBeforeandafterthetreatmentbytheirindividualcontrolledstudyGivemedicinemethodspatientswererandomlydividedintothreegroupsnamelypropranololgroupisosorbidemononitrategroupandcombinedtreatmentgroupPropranololgroupofinitialmeasurementof10mgthreetimesadayfororalsuchaspatientsnotreduceheartrateincreasegraduallymeasurement25untilrequirementsIsosorbidemononitrategroupoftheinitialmeasurement30mgonedaytwicefororalIfpatientsexperienceddifficulttotolerateheadachegives30mgadayonceorallycombinedtreatmentgroupgivepropranolol10mgthreetimesdailyoralplusisosorbidemononitrate30mgtwicedailyoral3PressuremeasuringmethodThetestusedultrasound-guidedpercutaneouspuncturebyhepatoportalpressuremeasuringmethodofportalveinpressuremeasurementAndpressuremeasuringprocessinpatientswithvenousreturndoor4MeasuringgasmoleculesinplasmaAdoptdoubleantibodyclipmethodmeasuringportalandperipheralbloodNOCOHSin2thecontentResults1CasescollectedTheabove30patientscenterisosorbidemononitrategroupandcombinedtreatmentgroupeachhavetwopatientsbecauseofeconomicandpersonalreasonsnotdothesecondmeasurepressureaccordingtotwopeoplesgroupbecausethepainmedicationcanttolerateadjustment2PortalveinpressuremeasurementPropranololgroupandisosorbidemononitrategroupwithoutstatisticsmorecomparativeIIIdifferencesP005combinedtreatmentgroupandisosorbidemononitrategroupcomparativedifferenceshavestatisticallysignificantP005combinedtreatmentgroupalonepropranololgroupcomparedwithdifferencewasstatisticallysignificantP0053MeasuringgasmoleculesinplasmaDrugtreatmentwithdrugsbeforebackdoorvenousbloodandperipheralbloodconcentrationofnitricoxideincomparisonpropranololgroupofnitricoxidecontentisreducedandtheelevatedtotheothertwogroupsDrugtreatmentwithdrugsbeforebackdoorvenousbloodandperipheralbloodconcentrationofCOcomparisonthreegroupsarereducedDrugtreatmentwithdrugsbeforebackdoorvenousbloodandperipheralbloodconcentrationincomparisonthreegroupsH2SisrisingConclusion1IncirrhosisportalhypertensiontreatmentaccordingtoIsosorbideMononitrateorpropranololallcaneffectivelyreducethepatientswithcirrhosisportalveinpressureP005ButsmallinpatientswithportalveinpressurealonemorethanTimnoobviouschange2IncirrhosisportalhypertensiontreatmentcombinationtherapyeffectisbetterthaninmorethanIsosorbideMononitratealoneP0053CombinationanddesignatespropranololcomparisonportalveinpressurereducingssituationisnotsignificantdifferenceP0054HSNOCOetcincirrhosisportalhypertensiongasmoleculesoftheformationand2developmentprocesswithimportantregulatoryrole5TheportalveinpressuredrugsnotonlycanreduceportalveinpressurebutalsocaneffectthegasmoleculargenerationandconsumptionsuchasNOCOHS2KeyWordsPropranololIsosorbidemononitratePortalhypertensionnitricoxidecarbonmonoxidehydrothionIV中英文对照PHTportalhypertension门静脉高压症EGVB食道胃底静脉曲张破裂出血HVPG门静脉压力梯度RCT随即对照试验GH生长激素WHVP肝静脉楔入压PBV门静脉PBF门静脉血流量CI门静脉淤血指数RI肝动脉阻力指数PIsplenic脾动脉搏动指数DPV门静脉主干内径DSV脾门处测脾静脉内径TAMX门静脉平均最大流速SCTPspiralCTportography螺旋CT门静脉血管造影MRA磁共振增强血管造影IVCP下腔静脉压力FHVP肝静脉游离压力WHVP肝静脉嵌塞压ISMN单硝酸异山梨酯NO一氧化氮CO一氧化碳HS硫化氢2NOS一氧化氮合酶nNOS神经型一氧化氮合酶eNOS内皮型一氧化氮合酶iNOS诱导型一氧化氮合酶OD光密度V学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果据我所知除文中已经注明引用的内容外本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果对本文的研究做出重要奉献的个人和集体均已在文中作了明确的说明并表示谢意研究生签名时间2021年05月10日学位论文版权授权书本人完全了解石河子大学有关保存使用学位论文的规定学校有权保存学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版有权将学位论文用于赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅有权将学位论文的内容编入有关数据进行检索有权将学位论文的标题和摘要汇编出版保密的学位论文在解密后适用本规定研究生签名时间2021年05月10日导师签名时间2021年05月10日门脉高压症药物治疗的疗效评价及相关气体分子的研究前言我国是慢性肝炎大国据不完全统计目前我国有慢性乙型肝炎患者3200万以上而乙肝携带者高达14亿多占全世界乙肝慢性携带者的近三分之一新疆地区是我国慢性肝炎肝硬化的高发地区肝硬化最终几乎都会引起门静脉高压症portalhypertensionPHT而门静脉高压可致食道胃底静脉曲张破裂出血esophagealandgastricvaricesbleedingEGVB其是晚期肝硬化患者死亡的主要原因之一首次出血后最初6周死亡率约为20而且出血后短期6周再出血发生率为3040晚期再出血率为3284平均为59[1]因此如何准确测量肝硬化患者门静脉压力的数值从而为有效的降低肝硬化患者的门静脉压力对预防各种并发症降低肝硬化患者的病死率具有重要的临床意义目前测量门静脉压力的方法大体上包括直接和间接测量两大类直接测压法包括非肝病病人外科手术时直接测定门静脉分支或是肠系膜上静脉压力胃网膜右静脉压力经脐静[2]脉插管测压等直接测压法等间接测量法包括经典的经肝静脉插管测定嵌塞肝静脉压WHVP彩超测量门脾静脉直径或血流变化磁共振血管造影螺旋CT门静脉成像等经典的门静脉导管术测量门静脉压力梯度HVPG是采用Seldinger法经颈静脉或股静脉插入气囊导管依次测定下腔静脉压力IVCP肝静脉游离压力FHVP肝静脉嵌塞压WHVP计算出肝静脉压力梯度HVPGHVPG代表门静脉的灌注压HVPGWHVP-FHVP实际上反映的是肝窦压而不是门静脉压力这些直接测压方法均存在着各种干扰因素的影响如手术时的应激麻醉药物的干扰麻醉时肌肉松弛后腹腔压力的变化等嵌塞肝静脉压测定虽不受上述因素的影响但实际上测定的[3]是肝窦压而不是门静脉压力间接测压发是通过公式等间接推断门静脉压力也不能准确代表门静脉压力故在临床实践中均有其局限性本课题组在长期临床工作中摸索出一套行之有效的B超导向下经皮经肝门静脉直接穿刺测压方法该方法只需局麻可排除手术应激以及麻醉对腹壁肌肉腹腔内压等的影响嵌塞肝静脉压测定需经肘股静脉插管至肝静脉并需在x线指导下进行操作较复杂相对费用较高耗时长而本组采用的方法耗时短易操作费用低廉测压针直接刺入门静脉肝内段读取门静脉压力数值排除了各种间接推算的误差所得数[3]据变异小稳定性好能够真实反映门静脉压力尽管目前治疗肝硬化门脉高压症存在多种联合用药方案如非选择性β受体阻滞22剂联合利尿剂非选择性β受体阻滞剂联合Ca拮抗剂以及Ca拮抗剂联合硝酸酯类[4]药物等实际临床工作中治疗门静脉高压的一线用药推荐心得安依姆多或两者连用心得安属于非选择性受体阻滞剂它一方面阻滞心脏受体使心率减慢心排出量1减少另一方面阻滞内脏血管受体使心脏血管a受体发挥血管收缩作用从而降低2门静脉压同时可减少奇静脉血流以降低食管静脉压力由于门脉高压发病机制复杂[5]单用心得安作用机制局限许多报道有13的患者疗效不明显且副作用较多硝酸酯类药物如单硝酸异山梨醇酯依姆多等通过释放NO直接松弛门静脉侧支1门脉高压症药物治疗的疗效评价及相关气体分子的研究降低循环阻力松弛动脉平滑肌使血压下降反射性地引起血管收缩减少门静脉血流同时扩张静脉系统使心脏前负荷下降刺激心肺压力感受器反射性地引起内脏血管收缩从而降低门静脉压力但这类药物可导致血容量缺乏严重低血压或严重肾功不全等不良反响故不推荐单用2021年3月杭州?肝硬化门静脉肝硬化食管胃静脉曲张出血防治共识?中指出对于肝硬化Child-PushAB级患者如果对普萘洛尔的反响[6]性差或根底心率低可联合应用血管扩张药但是目前的随即对照试验randomizedclinicaltrialRCT称联合用药在降低死亡率方面并不优于单用-受体阻滞剂并且联合用药更易出现低血压不良反响综上所述目前门脉高压症治疗中在单独使用心得安还是与硝酸酯类依姆多联用及其疗效方面仍存在争议既往的临床研究大都采用间接测压的方法评价心得安或者单硝酸异山梨醇酯治疗门脉高压症的疗效由于患者门静脉直径脾静脉宽度及门静脉血流量血流速度等只能间接表示患者门静脉压力的状况故间接测压法并不能准确评价药物的疗效[3]郑勇等曾在临床上采用B超引导下经皮经肝门静脉穿刺测量肝硬化患者门静脉压力20例肝硬化患者门静脉压力值为330±095kPa同时测得21例正常人门静脉压力为147±020kPa由于门静脉压力测量过程中患者处于局麻状态下为生理状态下的门静脉压力值此法具有平安性好数据稳定变异小且创伤小并具有可重复性等优势患者容易接受肝硬化发生时间质纤维增生导致肝脏血管床改建是门静脉高压形成的病理根底同时机体内扩血管物质的增多和血管对缩血管物质的敏感性下降维持了门静脉高压高动力循环状态现认为主要参与门静脉高压高动力循环的因子包括一氧化氮NO[7]一氧化碳CO内毒素肿瘤坏死因子内皮素ET等近年来越来越多的动物试验说明NOCOHS等血管活性物质在肝硬化形成过程中起着重要作用NO2CO等扩血管物质增多引起内脏和周围血管扩张导致高动力循环的发生加之外周血管对缩血管物质的敏感性降低最终导致门静脉高压NO是一种活性很强的自由基具有氧化复原特性内源性的NO是由左旋精氨酸通过一氧化氮合酶NOS的催化生成的其生理功能除可抑制血小板白细胞的粘附在中枢神经系统中起神经递质的作用以外最重要的作用就是强烈舒张内脏血管调节内脏血流量和血压有研究说明肝硬化时肝窦内皮细胞NO产生减少使星状细[8-9]胞收缩性增强从而使肝内血管阻力增加造成门静脉高压CO是继NO之后发现的血管舒张因子内源性CO多是由血红素氧合酶HO催化血红素分解产生其主要作用是保持门脉血管的松弛状态郑勇[10-15]等研究证明CO的过量产生可引起内脏血管过度扩张血管阻力下降血流量增加引起肝硬化门脉高压的高动力循环一旦一氧化碳的产生受抑就可造成肝窦收缩肝窦灌注下降肝内血管阻力升高肝硬化门静脉高压时CO过量产生一方面可以松弛肝血窦对抗血管阻力增加另一方面也可引起并加重门静脉高压的高动力循环HS是继NO和CO之后可以导致血管舒张的新型气体信号分子HS其舒张效应主要222门脉高压症药物治疗的疗效评价及相关气体分子的研究是通过血管平滑肌细胞上的KATP通道来调节其次是通过内皮细胞对钾离子的电导增加而实现的目前国内外研究主要集中在HS在各种原因引起的高血压肺动脉高压2神经系统感染及休克等病变中的作用HS作为重要的血管活性因子在门静脉高压2症的发病中也日益引起重视国内近期研究显示门静脉高压时内源性HS体系上调提2[16]示HS体系在门静脉高压的发病过程中可能发挥了重要作用2心得安依姆多在降低门静脉压力的同时是否对上述气体分子产生影响目前并无相关研究本研究旨在通过超声定位下直接测量用药前后肝硬化患者生理状态下的门静脉压力进一步准确评价心得安依姆多单用或者联用治疗门脉高压症的疗效并测定患者门静脉及外周静脉血中CONOHS的含量观察心得安或依姆多在治疗门脉高压2症的过程中对血中CONOHS的影响为肝硬化门脉高压各种并发症的预防提供理2论依据及可靠临床资料3门脉高压症药物治疗的疗效评价及相关气体分子的研究材料和方法一病例收集1研究对象本课题收集我院消化内科2021年11月至2021年5月期间的肝硬化门脉高压症患者30例男15例年龄4547±869岁女15例年龄5121±1156岁以上患者均未发生过上消化道出血2肝硬化病例纳入标准21入选标准a既往有慢性乙型或丙型病毒性肝炎病史或长期饮酒史导致酒精肝硬化伴有肝硬化临床表现和体征bB超或CT等影像学检查提示肝硬化及内镜检查发现食道胃底静脉曲张c有肝功能减退和门静脉高压的临床表现血清白蛋白下降白球比值倒置ALTAST胆红素均明显升高及凝血酶原时间延长等d肝组织活检检查见假小叶形成以上四项有一项或一项以上符合者都纳入22排除标准a年龄＜30岁或＞70岁者或以往接受过门静脉高压症的内镜下治疗如内镜下硬化或套扎b有心肺脑肾疾患或近日内有出血或一周内用过血管活性药物如心得安硝酸酯类药物Ca2拮抗剂利尿剂ARB或ACEI类者予以排除c严重肝脑病Child-push＞12分或伴有严重肝肝性脑病肝肾综合征合并肿瘤门静脉血栓形成d有受体阻滞剂禁忌证者哮喘窦缓心率＜50次收缩压＜85mmHgI度以上房室阻止心衰慢性阻塞性肺疾病糖尿病等e血凝分析结果异常不适合做肝穿刺者以上五项只要有一项就排除3Child-Pugh肝脏疾病严重程度记分与分级指标异常程度记分123肝性脑病无1～23～4腹水无轻中度以上血清胆红素μmolL342342～513513血清白蛋白gL3528～3428凝血酶原时间秒1415～1718注根据5项的总分判断分级A级58分B级911分C级1215分4门脉高压症药物治疗的疗效评价及相关气体分子的研究2主要实验仪器与试剂21主要仪器1电子天平MonoBloc公司产品AB204-E型2日本三洋MDF-382E型低温冰箱3低温高速离心机SIGMA公司产品949412-16K型425μl10μl200μl1000μl微量移液器德国eppendoff产品5一次性10μl200μl1000μl枪头PCR反响管离心管等为德国Axygen公司产品6彩色多普勒超声诊断仪为美国进口7穿刺针PTC针21G200mm为日本制造8酶标仪北京普析通用仪器有限责任公司9漩涡混匀器太长市科教器材厂出品WH-85122主要试剂1人一氧化氮NOELISA试剂盒酶标板CoatedWells96孔酶标抗体工作液Enzyme12mlConjugate10×标本稀释液SampleBuffer12ml20×浓缩洗涤液WashBuffer50ml标准品Standards300μM瓶2瓶底物工作液TMBSolution12ml第一抗体工作液Biotinylated12ml终止液StopSolution12mlAntibody上海西唐生物科技产品2人一氧化碳COELISA试剂盒酶标板CoatedWells96孔酶标抗体工作液Enzyme12mlConjugate10×标本稀释液SampleBuffer12ml20×浓缩洗涤液WashBuffer50ml标准品Standards250μM瓶2瓶底物工作液TMBSolution12ml第一抗体工作液Biotinylated12ml终止液StopSolution12mlAntibody上海西唐生物科技产品5门脉高压症药物治疗的疗效评价及相关气体分子的研究3人硫化氢HSELISA试剂盒2试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片482片96密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品90pgmL05ml×1瓶05ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液15ml×1瓶15ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液20ml×20倍×1瓶20ml×30倍×1瓶2-8℃保存上海西唐生物科技产品4蒸馏水市售5注射用水市售23主要试剂的配制NO试剂盒标准品液配制使用前参加1ml蒸馏水混匀配成300μM的溶液设标准管8管第一管加标本稀释液900ul第二至第八管参加标本稀释液500ul在第一管中参加300μM的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul移至第二管如此反复作对倍稀释从第七管中吸出500ul弃去第八管为空白对照10×标本稀释液用蒸馏水作110倍稀释例如1ml浓稀释液9ml蒸馏水洗涤液用重蒸水120稀释示例1ml浓缩洗涤液参加19ml的重蒸水CO试剂盒标准品液配制使用前参加1ml蒸馏水混匀配成250μM的溶液设标准管8管第一管加标本稀释液900ul第二至第八管参加标本稀释液500ul在第一管中参加250μM的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul移至第二管如此反复作对倍稀释从第七管中吸出500ul弃去第八管为空白对照10×标本稀释液用蒸馏水作110倍稀释例如1ml浓稀释液9ml蒸馏水洗涤液用重蒸水120稀释示例1ml浓缩洗涤液参加19ml的重蒸水二试验方法1给药方法将收集的符合纳入及排除标准的肝硬化病人随机分为三组即心得安组依姆多组及两者联用组心得安组初始计量为10mg一日三次口服逐渐增加剂量至心率下降20～256门脉高压症药物治疗的疗效评价及相关气体分子的研究或降至55～60次分为准依姆多组计量为60mg一日一次口服联合用药组给予心得安10mg一日三次口服加依姆多60mg一日一次口服患者服药过程中记录药物不良反响如出现哮喘心衰窦性心动过缓心率50次分I度以上房室传导阻滞等以上任何一种病症者那么停用心得安服用单硝酸异山梨醇酯依姆多出现难以忍受的头痛也需停药退出实验观察2测压方法目前临床门静脉测压的方法有多种一般分为间接测压与直接测压法两类本实验采用B超导向下经皮经肝门静脉穿刺测压21患者术前准备测压患者已完善血球分析血凝分析肝肾功电解质等相关检查近期未出血或一周内未用过血管活性药物如心得安硝酸酯类药物Ca2拮抗剂利尿剂ARB或ACEI类嘱患者术前禁食水6小时术前留取静脉血3ml在低温离心机内4℃4000rmin离心10min别离血浆-80℃冰箱保存22操作方法嘱受检者取平卧位用超四型B超专用穿刺探头定位尽量使穿刺针道与水平面垂直常规消毒铺消毒洞巾沿穿刺针道逐层麻醉局麻后用21G专用穿刺针在B超引导下垂直刺入门静脉肝内段拔出针芯留取门静脉血3ml静脉血在低温离心机内4℃4000rmin离心10min别离血浆-80℃冰箱保存连接装满注射用水的测压管并保持垂直待管中水柱稳定读取穿刺针尖到水面距离为门静脉压力值穿刺术完毕后静卧4～[17]6小时防止剧烈活动监测生命体征本试验30例试验者穿刺均一次操作成功术中未出现不适反响术后局部患者出现右上腹痛一般2-3天后可明显缓解测压针直接刺入门静脉肝内段读取门静脉压力数值可以排除各种间接推算的误差所以测得的数据变异小稳定性好22服药后测压各实验组按照分组给药本试验选择在心得安组心率降低25或心率控制在55-65次分1周后行二次测压主要原因1从依姆多的药代动力学可知一周内可到达稳定血药浓度依姆多的药代动力学单硝酸异山梨酯口服吸收迅速无肝脏首过效应有效血药浓度稳定持续时间长血浆蛋白结合率为13依姆多为单硝酸异山梨酯的缓释片持续时间达10h在给药4小时可达最大血药浓度2患者住院时间有限须在患者住院期间完成两次测压以免失访二次测压方法同前记录测量结果7门脉高压症药物治疗的疗效评价及相关气体分子的研究3技术路线符合标准的肝硬化患者30例完善术前相关检查B超引导下经皮肝穿测量门静脉压力并留取门静脉血及外周静脉血心得安组10例依姆多组10例联合用药组10例用药一周后再次测压并留取门静脉及外周静脉血检测门静脉及外周静脉血中NOCOHS含量2统计学分析4血液样本测定41血浆NO测定com原理本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法用抗人NO单抗包被于酶标板上标准品和样品中的NO与单抗结合参加生物素化的抗人NO形成免疫复合物连接在板上辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合参加底物工作液显蓝色最后加终止液硫酸在450nm处测OD值NO浓度与OD值成正比可通过绘制标准曲线求出标本中NO浓度com操作步骤1加样每孔各参加标准品或待测样品100ul将反响板充分混匀后置37℃120分钟2洗板用洗涤液将反响板充分洗涤4-6次向滤纸上印干8门脉高压症药物治疗的疗效评价及相关气体分子的研究3每孔中参加第一抗体工作液100ul将反响板充分混匀后置37℃60分钟41洗板同前5每孔加酶标抗体工作液100ul将反响板置37℃30分钟6洗板同前7每孔参加底物工作液100ul置37℃暗处反响15分钟8每孔参加100ul终止液混匀930分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值com含量计算以标准品255102030为横坐标OD值为纵坐标在坐标纸上作图画出标准曲线根据样品OD值在该曲线图上查出相应NO含量再乘以样本稀释倍数或者用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式将样品的OD值代入方程式计算出样品浓度42血浆CO测定com试验原理本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法用抗人CO单抗包被于酶标板上标准品和样品中的CO与单抗结合参加生物素化的抗人CO形成免疫复合物连接在板上辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合参加底物工作液显蓝色最后加终止液硫酸在450nm处测OD值CO浓度与OD值成正比可通过绘制标准曲线求出标本中CO浓度com操作步骤1加样每孔各参加标准品或待测样品100ul将反响板充分混匀后置37℃120分钟2洗板用洗涤液将反响板充分洗涤4-6次向滤纸上印干3每孔中参加第一抗体工作液100ul将反响板充分混匀后置37℃60分钟4洗板同前5每孔加酶标抗体工作液100ul将反响板置37℃30分钟6洗板同前7每孔参加底物工作液100ul置37℃暗处反响15分钟8每孔参加100ul终止液混匀930分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值com含量计算μM为横坐标OD值为纵坐标在坐标纸上作图画出标准曲线根据样品OD值在该曲线图上查出相应NO含量再乘以样本稀释倍数或者用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式将样品的OD值代入方程式计算出样品浓度43血浆HS测定2com试验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人硫化氢HS水平用纯化的人硫化氢2HS抗体包被微孔板制成固相抗体往包被单抗的微孔中依次参加硫化氢HS229门脉高压症药物治疗的疗效评价及相关气体分子的研究再与HRP标记的硫化氢HS抗体结合形成抗体-抗原-酶标抗体复合物经过彻底2洗涤后加底物TMB显色TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色并在酸的作用下转化成最终的黄色颜色的深浅和样品中的硫化氢HS呈正相关用酶标仪在450nm波2长下测定吸光度OD值通过标准曲线计算样品中人硫化氢HS含量2com操作步骤1标准品的稀释与加样在酶标包被板上设标准品孔10孔在第一第二孔中分别加标准品100μl然后在第一第二孔中加标准品稀释液50μl混匀然后从第一孔第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔再在第三第四孔分别加标准品稀释液50μl混匀然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉再各取50μl分别加到第五第六孔中再在第五第六孔中分别加标准品稀释液50ul混匀混匀后从第五第六孔中各取50μl分别加到第七第八孔中再在第七第八孔中分别加标准品稀释液50μl混匀后从第七第八孔中分别取50μl加到第九第十孔中再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉稀释后各孔加样量都为50μl浓度分别为60pgmL40pgmL20pgmL10pgmL5pgmL2加样分别设空白孔空白对照孔不加样品及酶标试剂其余各步操作相同待测样品孔在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl然后再加待测样品10μl样品最终稀释度为5倍加样将样品加于酶标板孔底部尽量不触及孔壁轻轻晃动混匀3温育用封板膜封板后置37℃温育30分钟4配液将3048T的20倍倍浓缩洗涤液用蒸馏水3048T的20倍倍稀释后备用5洗涤小心揭掉封板膜弃去液体甩干每孔加满洗涤液静置30秒后弃去如此重复5次拍干6加酶每孔参加酶标试剂50μl空白孔除外7温育操作同38洗涤操作同59显色每孔先参加显色剂A50μl再参加显色剂B50μl轻轻震荡混匀37℃避光显色15分钟10终止每孔加终止液50μl终止反响此时蓝色立转黄色1测定以空白空调零450nm波长依序测量各孔的吸光度OD值测定应在加终止液后15分钟以内进行com含量计算以标准品510204060为横坐标OD值为纵坐标在坐标纸上作图画出标准曲线根据样品OD值在该曲线图上查出相应NO含量再乘以样本稀释倍数或者用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式将样品的OD值代入方程式计算出样品浓度再乘以稀释倍数10门脉高压症药物治疗的疗效评价及相关气体分子的研究5统计学处理用SPSS130统计学软件处理数据数据采用样本均数±标准差表示应用配对资料的t检验P＜005为有显著性差异11门脉高压症药物治疗的疗效评价及相关气体分子的研究结果1病例收集情况上述30例患者中心得安组及联合用药组各有2例患者因经济及个人原因未行第二次测压依姆多组有2人因不能耐受的疼痛调整用药因病例收集时间较短今后继续收集病例以扩大样本量2三组门静脉压力测量结果观察结束三组患者门静脉压力变化情况三组间的两两比拟显示单用心得安组与单用依姆组多比拟差异无统计学P005联合用药组与单用单硝酸异山梨醇酯依姆多组比拟差异有统计学意义P005联合用药组与单用心得安组比拟差异无统计学意义P005如下表1所示表1门静脉压力测定结果样本均数±标准差组别用药前用药后门静脉压力差值mmH2O每组各8例门静脉压mmH2O门静脉压mmH2O心得安组32186±944123100±44949087±5374单硝酸异山梨醇酯组26000±400922713±47383286±2227联合用药组42575±1162129250±488413325±82363门静脉及外周静脉血中NO的检测及分析根据NO浓度计算公式计算NO浓度并做出标准曲线表图1NO标准曲线见图1直线方程为Y00520055X12门脉高压症药物治疗的疗效评价及相关气体分子的研究相对系数R209958表2门静脉血与外周静脉血之间NO浓度的比拟x±s心得安组N用药前NOumoL用药后NOumoL门静脉血NO16615±042516±032外周静脉血NO26554±054447±044分析表2结果显示患者治疗前后门静脉血NO浓度与外周静脉血中NO浓度的变化应用心得安治疗前后门静脉血及外周血中NO浓度变化差异有统计学意义P005说明使用心得安后肝硬化患者的门静脉血及外周血中NO浓度降低心得安在降低肝硬化患者门静脉压力的同时可影响肝硬化患者NO合成表3门静脉血与外周静脉血之间NO浓度的比拟x±s依姆多组N用药前NOumoL用药后NOumoL门静脉血NO16582±032624±033外周静脉血NO26505±027567±018分析表3结果显示患者治疗前后门静脉血NO浓度与外周静脉血中NO浓度的变化应用依姆多治疗前后门静脉血及外周血中NO浓度变化差异有统计学意义P005说明使用心得安后肝硬化患者的门静脉血及外周血中NO浓度升高依姆多在降低肝硬化患者门静脉压力的同时可影响肝硬化患者NO合成表4门静脉血与外周静脉血之间NO浓度的比拟x±s联合用药组N用药前NOumoL用药后NOumoL门静脉血NO16612±026670±033外周静脉血NO26511±035567±039分析表4结果显示患者治疗前后门静脉血NO浓度与外周静脉血中NO浓度的变化联合用药治疗前后门静脉血及外周血中NO浓度变化差异有统计学意义P005说明使用心得安后肝硬化患者的门静脉血及外周血中NO浓度升高联合用药在降低肝硬化患者门静脉压力的同时可影响肝硬化患者NO合成4门静脉及外周静脉血中CO的检测及分析根据CO浓度计算公式计算CO浓度并做出标准曲线图213门脉高压症药物治疗的疗效评价及相关气体分子的研究公式如下CO标准曲线见图2直线方程为Y02340087X相对系数R20998表5用药前后门静脉血与外周静脉血之间CO浓度的比拟x±s心得安组N用药前COumoL用药后COumoL门静脉血CO16327±035227±046外周静脉血CO26301±024207±016分析表5结果显示患者门静脉血CO浓度与外周静脉血中CO浓度的变化应用心得安治疗前后患者两者差异有统计学意义P005说明使用心得安后肝硬化患者的门静脉血及外周血中CO浓度降低心得安在降低肝硬化患者门静脉压力的同时可影响肝硬化患者CO合成表6用药前后门静脉血与外周静脉血之间CO浓度的比拟x±s依姆多组N用药前COumoL用药后COumoL门静脉血CO16329±021213±022外周静脉血CO26293±022187±023分析表6结果显示患者门静脉血CO浓度与外周静脉血中CO浓度的变化应用依姆多治疗前后患者两者差异有统计学意义P005说明使用依姆多后肝硬化患者的门静脉血及外周血中CO浓度降低依姆多在降低肝硬化患者门静脉压力的同时可14门脉高压症药物治疗的疗效评价及相关气体分子的研究影响肝硬化患者CO合成表7用药前后门静脉血与外周静脉血之间CO浓度的比拟x±s联合用药组N用药前COumoL用药后COumoL门静脉血CO16309±021203±023外周静脉血CO26298±024211±016分析表7结果显示患者门静脉血CO浓度与外周静脉血中CO浓度的变化联合治疗前后患者两者差异有统计学意义P005说明使用联合用药后肝硬化患者的门静脉血及外周血中CO浓度降低联合用药在降低肝硬化患者门静脉压力的同时可影响肝硬化患者CO合成5门静脉及外周静脉血中HS的检测及分析2根据HS浓度计算公式计算HS浓度并做出标准曲线图322公式如下HS标准曲线见图2直线方程为Y06170066X2相对系数R20999表8用药前后门静脉血与外周静脉血之间HS浓度的比拟x±s2心得安组N用药前HSumoL用药后HSumoL22门静脉血HS166354±3587054±2632外周静脉血HS267050±6427563±2832分析表8结果显示患者门静脉血HS浓度与外周静脉血中HS浓度的变化心得22安治疗前后患者两者差异有统计学意义P005说明使用心得安后肝硬化患者的15门脉高压症药物治疗的疗效评价及相关气体分子的研究门静脉血及外周血中HS浓度升高心得安在降低肝硬化患者门静脉压力的同时可影响2肝硬化患者HS合成2表9用药前后门静脉血与外周静脉血之间HS浓度的比拟x±s2依姆多组N用药前HSumoL用药后HSumoL22门静脉血HS166283±3637194±4202外周静脉血HS267106±3517810±4572分析表9结果显示患者门静脉血HS浓度与外周静脉血中HS浓度的变化依姆22多治疗前后患者两者差异有统计学意义P005说明使用心得安后肝硬化患者的门静脉血及外周血中HS浓度升高依姆多在降低肝硬