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文档简介

大肠杆菌质粒DNA的提取实验目的学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法掌握质粒DNA制备的方法和原理实验原理

质粒DNA的提取分为三个步骤:培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁,十二万基硫酸钠(SDS)可使细胞壁裂解,经溶菌酶和阴离子去污剂(SDS)处理后,细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上,离心时易被沉淀出来,而质粒DNA则留在上清液中,将上清液用乙醇溶液沉淀洗涤后,可得到质粒DNA。实验材料、仪器与试剂材料:大肠杆菌DH5α仪器:

1.5mL塑料离心管(又称Eppendorf离心管)微量加样器台式高速离心机恒温摇床冰箱

实验材料、仪器与试剂试剂:PH8.0的G.E.T缓冲液:内含50mmol/LEDTA、25mmol/LTris-Hcl用前加溶菌酶4mg/mLPH4.8的乙酸钾溶液:内含60mL5mmol/LKAc、11.5mL冰醋酸、28.5mL蒸馏水,该溶液中钾离子浓度为3mmol/L,醋酸根离子浓度为5mmol/L

实验材料、仪器与试剂酚-氯仿混合液(体积比1:1)酚需在160℃重蒸,加入抗氧化剂8-羟基喹啉,使其体积分数为0.1%,并用Tris缓冲溶液平衡两次。向氯仿中加入异戊醇,使氯仿-异戊醇体积比为24:1

TE缓冲溶液(PH值8.0)内含10mmol/LTris-Hcl、1mmol/LEDTA,令含RNA酶20ug/mL0.2mol/LNaoH溶液(内含1%SDS)70%乙醇溶液/无水乙醇实验过程1.培养细菌扩增质粒:

将带有质粒DNA的大肠杆菌接种在LB液体培养基中,37℃过夜培养2.收集菌体及裂解细菌:取液体培养菌液1.5mL置于EP管中,10000r/min离心1min,去上清。加入150uLG.E.T缓冲液,充分混匀,室温放置10min(溶菌酶在碱性条件下不稳定,必须在使用时重新配置,使用EDTA是为了除去细胞壁上的钙离子,使溶菌酶更易与细胞壁接触)。加入新配置的0.2mol/LNaoH溶液(内含1%SDS)加盖,倒置2-3次,使之混匀。冰浴5min(SDS能使细胞膜裂解,并使蛋白质变性)。3、分离纯化质粒DNA加入150uL冷乙酸钾溶液,加盖后倒置数次使其混匀,冰浴15min。10000r/min离心15min,将上清倒入另一支干净的离心管中。(乙酸钾能沉淀SDS和SDS与蛋白质的复合物,冰浴15min是为了使沉淀完全。如果上清经离心后仍浑浊,应混匀后再冷却至0℃并重新离心处理)。向上清液中加入等体积酚-氯仿混合液,震荡混匀,以10000r/min离心2min,将上清转至新的离心管中(用酚与氯仿的混合液除去蛋白,其效果比单独使用酚或氯仿更好)向上清中加入2倍体积无水乙醇,混匀。室温放置2min后,离心5min倒去上清乙醇溶液,把离心管倒置在吸水纸上吸去液体。加入0.5mL70%乙醇溶液,震荡并离心,倒去上清,干燥,溶于TE缓冲溶液中,-20℃保存实验注

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