高效液相色谱和液相色谱

高效液相色谱和液相色谱-电喷雾质谱联用法鉴定辛硫磷在鲫鱼肝微粒体中代谢产物及途径刘荣飞;刘幸;刘晓宇;范雯婷;赵冬冬;石旺荣;朱雨田;李宏【摘要】采用差速离心法制备鲫鱼肝微粒体,选择已经建立的肝微粒体系统进行体外孵育,研究有机磷杀虫剂辛硫磷在鲫鱼肝微粒体中的代谢.产物经乙酸乙酯萃取2次,取出有机相于40工下旋转蒸发至近干，加lmL甲醇，经高效液相色谱(HPLC)分离测定,液相色谱-电喷雾质谱联用(LC-ESI/MS)鉴定其分子结构,发现了3种代谢产物(M1:二乙基硫代磷酸；M2:四乙基二硫代焦磷酸；M3:辛氧磷)，据此推断辛硫磷在鲫鱼肝微粒体(细胞色素P450酶系)的作用下进行了脱硫氧化、水解反应•从而可推断辛硫磷在鲫鱼肝微粒体中的代谢途径和代谢特点,为进一步研究其体内代谢和代谢酶奠定基础.％Thelivermicrosomeswerepreparedbydifferentialultracentrifugationfortheinvestigationofinvitrometabolismofphoxim.Themetaboliteswereextractedtwicefromthereactionsolutionwithethylacetate,removetheorganicphasetorotaryevaporatorbyneardrynessat40°C,thenconstantvolumeby1mLmethanol,separatedanddeterminedbyHPLC,andthenidentifiedbyHPLC-MS(ESI).Threemajormetabolites(M1:O,O,O',O'-tetraethyldithiopyrophosphate,M2:diethylthiophosphateandMs:phoxom)indicatedthatphoximunderwentdesulfur-oxidationandhydrolysisincruciancarplivermicrosomes.Therefore,thisstudydeducedthemetabolicpathwayandmetaboliccharacteristicofphoximinlivermicrosomesofcruciancarpandlaidasolidfoundationforfurtherstudyofitsmetabolismandmetabolicenzymes.期刊名称】《分析化学》年(卷),期】2013(041)006【总页数】6页(P893-898)【关键词】辛硫磷;鲫鱼;肝微粒体;体外代谢;液相色谱-电喷雾质谱联用【作者】刘荣飞;刘幸;刘晓宇;范雯婷;赵冬冬;石旺荣;朱雨田;李宏【作者单位】华中农业大学食品科技学院,武汉430070;华中农业大学食品科技学院,武汉430070;华中农业大学食品科技学院,武汉430070;华中农业大学食品科技学院,武汉430070;华中农业大学食品科技学院,武汉430070;华中农业大学食品科技学院,武汉430070;华中农业大学食品科技学院,武汉430070;华中农业大学食品科技学院,武汉430070【正文语种】中文引言自20世纪80年代起，我国有机磷农药工业进入了高速发展的阶段。由于有机磷农药具有高效、广谱、低毒、抗性发展缓慢、价格低廉等特点，在防治农业生产害虫大爆发时发挥了极其重要的作用[1]。但与此同时，其污染效应也扩展到整个生态系统。曾有报道指出，在农药的使用过程中，仅有1%左右的农药作用于靶生物，其余残留于土壤或通过地表径流进入水环境，从而对土壤生物和水生生物造成危害，导致生态平衡被破坏[2]。我国农药生产总量中有机磷农药仍然是主要的农药品种，占杀虫剂总量的70%[3]。有机磷农药主要是使乙酰胆碱酯酶(AChE)活性中心的丝氨酸羟基磷酰化，从而使其丧失水解乙酰胆碱的能力，造成乙酰胆碱大量蓄积，引起胆碱能神经和部分中枢神经功能的过度兴奋，继而转入抑制和衰竭，产生中毒症状，同时其代谢产物的毒性作用有可能比母药更大［4，5］。辛硫磷，又名肟硫磷、倍腈松、腈肟磷，化学名O,O-二乙基-0-(苯乙腈酮肟)硫代磷酸酯，分子式为C12H15N2O3PS。由于其具有高效、广谱、安全及对人畜低毒的特点，因而在我国被广泛用于农业生产中，在水产养殖业也被用作渔药。因而通过研究其在水产品中的代谢产物及途径，可明确其对水产品的危害程度，对保障水产品安全具有积极意义。迄今，关于有机磷农药在水产品中的代谢研究鲜见报道。目前，有机磷农药残留检测方法主要有色谱法和快速检测法两大类。色谱法是目前农药残留主要的检测方法，包括气相色谱法(GC)［6］和气相色谱-质谱联用法(GC-MS)［7］、高效液相色谱法(HPLC)和高效液相-质谱联用法(HPLC-MS)［8］等。其特点是检测时间略长，但准确度和精密度高，可为有机磷农药残留提供执法依据。王耀等［7］采用GC-MS法测定了咸鱼中的多种有机磷农药残留;张云等［8］建立了同时检测水产品中7种有机磷农药残留量的HPLC-MS法，样品经酸化的乙酸乙酯提取，酸性氧化铝净化后进样分析，外标法定量。快速检测法包括免疫分析技术、酶抑制法等。这两类方法各有所长，在实际操作中应根据具体情况选用。本研究选择鲫鱼作为淡水养殖鱼类的代表，选择辛硫磷作为有机磷农药代表，进行体外孵育，采用HPLC和LC-ESI/MS法对代谢产物进行分离和鉴定，旨在阐明其在肝微粒体中的代谢途径和代谢特点，为进一步研究其体内代谢和代谢酶奠定基础。虽然之前利用该方法探究代谢机理有类似的研究,Roy等［9］研究了杀螟松在小鼠肝脏中的代谢，用HPLC和IR技术鉴定和检测代谢产物及其浓度，发现注射杀螟松24h后，小鼠肝脏中有3种主要代谢产物，并且发现注射不同浓度的杀螟松其代谢的途径也不同。Kitamura等［10］比较了倍硫磷和其代谢产物倍硫磷亚砜在鲷鱼、金鱼和小鼠体外的代谢，并且测定了3种生物的肝微粒体酶活活性，结果表明，鲷鱼和金鱼肝微粒体酶活活性低于小鼠，倍硫磷和倍硫磷亚砜在细胞色素P450作用下可以相互转化。但有关有机磷农药，尤其是辛硫磷，在水产品中的代谢产物的研究相对较少，CYP450与有机磷农药的效应关系也可为后续研究有机磷农药在水生生物体内的代谢调控机制奠定基础。实验部分仪器与试剂HimacCP80WX型超高速冷冻离心机（日本Hitachi公司）;高效液相色谱（美国Waters公司）;1100Series液相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）;UV-1700紫外分光光度计（日本岛津公司）;722型分光光度计（天津市普瑞斯仪器有限司）;ML204型电子分析天平（MettlerToledo公司）。辛硫磷标准品（分析纯，德国Dr.Ehrenstorfer公司）;甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；还原型辅酶口（NADPH,纯度＞98.0%,Roche公司）;三羟甲基氨基甲烷（Tris，纯度〉99.9%，国药集团化学试剂有限公司）；蔗糖、乙酸乙酯、三氯乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。肝微粒体的制备采用差速离心法［11-13］。暂养鲫鱼禁食过夜后，击打头部将其处死，解剖取出肝脏，去除脂肪和结缔组织，用0.9%生理盐水反复漂洗除去红细胞，用滤纸吸去多余液体后称重，转入手动玻璃匀浆器，按1：4（w/V）的比例加入蔗糖-Tris-HCl缓冲液（pH7.4），置于冰浴中制成匀浆。将匀浆物通过一层纱布过滤转入预冷离心管中，于高速冷冻离心机中，在2-4°C下，13000g离心20min，弃除上清液上层漂浮脂质;取出其余上清液转移至离心管，在2-4C条件下，10500g离心60min，弃上清液，沉淀即为微粒体组分。将微粒体用KCl-Tris-HCl缓冲液(pH7.4)悬浮，每克肝加悬浮液1mL混合后，分装于冻存管中，-20°C冰箱保存备用。辛硫磷与肝微粒体的孵育微粒体(2g/L)和1mmol/LNADPH在0.9mLKCI-Tris-HCI缓冲液中预反应2min，再加100pmoI/L辛硫磷开始反应120min，反应总体积1.2mL。不含NADPH或农药为空白组。反应用0.3mL三氯乙酸(15%,w/V)终止。加入3mL乙酸乙酯和1mLNaCI(3%,w/w)，对产生的代谢产物进行提取，室温下在振荡器上剧烈振荡3min，在4C条件下3000r/min离心10min。取出有机相，用3mL乙酸乙酯对水相进行再次提取，同样条件下离心，取出有机相于40C下旋转蒸发至近干;残渣用1mL甲醇溶解，过0.45pm滤膜，供HPLC和LC-MS分析。色谱-质谱条件HypersilODSC18色谱柱(250mmx4.6mmx5pm,依利特公司);检测波长:254nm;流速:1.0mL/min;进样量:10pL;柱温:40°C。流动相:水(A)-甲醇(B),采用梯度洗脱:0~22min,49%B;35min,70%B;55min,70%B;60min,49%B;70min，49%B。ESI离子源，正离子模式，喷射电压:3500V,喷射压力:40psi;干燥气流速:10L/min;干燥气温度:325°C;扫描质量范围:m/z50~800。3结果与讨论3.1辛硫磷在肝微粒体中代谢物的分离辛硫磷在鲫鱼肝微粒体中代谢产物的HPLC分析结果如图1所示，与空白对照组(不含辛硫磷或者不含NADPH)进行比较，色谱图中保留时间42.704min的色谱峰对应的组分为辛硫磷，保留时间13.390,17.205和24.213min的色谱峰对应的组分分别为辛硫磷在鲫鱼肝微粒中代谢的可能产物M1,M2和M3。3.2辛硫磷在肝微粒体中代谢物的鉴定LC-MS集合了HPLC的高分离效能与MS的强结构鉴定功能，具有灵敏度高、选择性好、分析快速、方便等优点，目前已成为一种优越的结构鉴定工具。表1显示LC-MS分析得到辛硫磷在鲫鱼肝微粒中代谢产物的结构。ESI-MS是一种软电离技术，采用正离子模式，对极性物质主要形成质子化的分子离子峰，多数情况下不会出现碎片。图2为辛硫磷在鲫鱼肝微粒中代谢产物的总离子流图。3.2.1代谢物M1的结构鉴定代谢物M1的MS，MS2和其裂解途径如图3所示。在ESI离子源作用下，m/z171,经初步碰撞诱导电离，首先裂解去一个乙基(-C2H5)，产生［M+H-29］+碎片离子峰(m/z143)；接着进一步裂解，去一个乙基(--C2H5)，产生m/z115的碎片离子峰。结合辛硫磷的结构及其裂解途径，因此可推断M1为二乙基硫代磷酸。图1辛硫磷代谢物形成的HPLC色谱图Fig.1RepresentativeHPLCchromatogramofmetabolitesofphoximformeda.空白组(不含辛硫磷);b.空白组(不含还原型辅酶口);c•鲫鱼肝微粒与NADPH孵育。a.control(nophoxim);b.Control(nonicotinamideadeninedinucleotidephosphate(NADPH));c.CruciancarplivermicrosomeswereincubatedwithNADPH.3.2.2代谢物M2的结构鉴定代谢物M2的MS,MS2和其裂解途径如图4所示。m/z=323，而有文献已报道鉴定了分子量是322的辛硫磷光解产物为四乙基二硫代焦磷酸［14］。进一步的结合代谢物M2的MS2，在ESI离子源作用下，裂解去一个乙基(-C2H5)产生［M+H-29］+碎片离子峰(m/z295)，裂解去一个乙氧基(-OC2H5)，产生m/z277碎片离子峰，从中间的P-O键断裂产生m/z171碎片离子峰，并且M2存在与辛硫磷相同的碎片离子m/z143，因此可推断M2为四乙基二硫代焦磷酸。表1辛硫磷在鲫鱼肝微粒中代谢物的分子量和结构分析Table1Moleculeweightsandstructuralidentificationofphoximmetabolitesincruciancarplivermicrosomes代谢物Metabolites保留时间Rt(min)准分子离子[M+H]+(m/z)二级碎片MS/MS(m/z)结构IdentificationM114.3171143,115二乙基硫代磷酸DiethythiophosphateM217.2323295,277,173,143四乙基二硫代焦磷酸TetraethyldithiopyrophosphateM324.2283225,129辛氧磷Phoximoxon图2辛硫磷在鲫鱼肝微粒中代谢产物的总离子流图Fig.2Totalioncurrentchromatogramofphoximmetabolitesincruciancarplivermicrosomes3.2.3代谢物M3的结构鉴定代谢物M3的MS,MS2和其裂解途径如图5所示，分子量为282，比辛硫磷的分子量少16Da，表明有可能是辛硫磷的脱硫氧化产物。而有文献已报道辛硫磷在昆虫体内进行脱硫氧生成辛氧磷，分子量为282[15]。为了进一步对代谢物M3鉴定，结合其MS2图，在ESI离子源作用下，经初步碰撞诱导电离，裂解去2个乙基(-C2H5)产生[M+H-58]+碎片离子峰，并且代谢物M3存在与辛硫磷相同的碎片离子m/z129。因此可推断M3为辛氧磷。图3代谢物M1的MS⑻和MS2(b)图及其可能的裂解途径(c)Fig.3MS(a),MS2(b)spectraandproposedfragmentationpathways(c)ofmetaboliteM1图4代谢物M2的MSI(a)和MS2(b)图及其可能的裂解途径(c)Fig.4MS(a),MS2(b)spectraandproposedfragmentationpathways(c)ofmetaboliteM23.3辛硫磷在鲫鱼肝微粒体中代谢物HPLC-MS分析在解析电喷雾质谱图时，通过加合离子可有效地确定分子离子峰的质荷比[16]。根据分子离子峰与氢离子所形成的分子加合离子峰，可确定出辛硫磷代谢产物M1，M2和M3分子离子峰的质荷比。在上述3种化合物中，典型的质谱碎裂方式有：(1)从分子离子(M)中脱去乙基(M-C2H5:m/z=M-29)、乙氧基(M-OC2H5:m/z=M-58);(2)P-0键之间的离子碎裂，在辛硫磷代谢产物M2中，对应的离子碎片为m/z171;(3)N-O键之间的离子碎裂，在辛硫磷代谢产物M3中，对应的离子碎片为m/z129。产物M1是辛硫磷水解后的产物，根据其MS2图显示有m/z143和115的两个碎片离子峰，结合辛硫磷的结构和裂解途径，推断出M1为二乙基硫代磷酸;产物M2是M1缩合掉一分子水所得到的四乙基二硫代焦磷酸，相关文献已报道了该产物是辛硫磷的光解产物，这可能是因为鲫鱼肝微体P450酶系有同样的催化作用。产物M3是辛硫磷发生脱硫氧化形成的产物，辛硫磷在ESI质谱中分子离子的主要碎片离子为m/z171,143，129，115(基峰)，而化合物M3分子离子的主要离子碎片为m/z225和129(基峰);但两者的共同之处在于离子碎裂发生在N--O键之间，主要原因是该种方式的断裂产生的正离子内能较低，稳定性较高。图5代谢物M3的MS⑻和MS2(b)图及其可能的裂解途径(c)Fig.5MS(a)，MS2(b)spectraandproposedfragmentationpathways(c)ofmetaboliteM3图6辛硫磷在鲫鱼肝微粒体中可能的代谢途径Fig.6Proposedmetabolicpathwayofphoximincruciancarplivermicrosomes辛硫磷在鲫鱼肝微体中的代谢途径根据以上HPLC-MS分析结果推测，辛硫磷在鲫鱼肝微粒体P450酶系的作用下的转化过程如图6所示。有机磷农药在生物体内往往经历吸收、分布、转化和排泄4个基本过程，转化速率以及形成的代谢物类型取决于生物体的种类，这构成了有机磷农药选择性的代谢基础。微粒体中细胞色素P450酶系在转化阶段起着非常重要的作用。已知细胞色素P450酶系能够催化氧化、还原和水解等多种反应[17]。通过这些反应，生物体将外源化学物质转化成毒性增强或减弱的其它化合物。边文杰等[18]报道了毒死蜱、对硫磷和马拉硫磷均能在鱼类肝细胞色素P450的作用下进行脱硫代谢生成相应的氧化产物。本研究结果表明，辛硫磷在鲫鱼肝微粒体细胞色素P450的作用下进行了脱硫氧化和水解反应，但P450酶系与有机磷农药的相关分子作用机理有待进一步的研究同时对于体内代谢而言，占主导地位的反应种类尚不清楚。从代谢产物分离的结果分析，代谢辛硫磷的P450酶系活力不高，是否与鱼种类、辛硫磷或者反应及提取条件有关尚不清楚，有待进一步探索。References【相关文献】HEHong-Wu.ChineseJ.WorldPesticides，2008，30:29－33贺红武.世界农药，2008，30:29－33SHENGuo-Xing，YANGuo-An.ChineseJ.AdvanceinEnvironmentalScience，1999，7:131－140沈国兴，严国安.环境科学进展，1999，7:131－140GAOYan-Wei.ChineseJ.AnhuiAgriculturalScienceBulletin，2008，13:130－131高艳卫.安徽农学通报，2008，13:130－131FukutoTR.J.EnvironmentalHealthPerspectives，1990，87:245KachamR，KaranthS，BaireddyP，LiuJ，PopeC.J.ToxicologyandAppliedPharmacology，2006，210:142－149YINGXing-Hua，ZUXia，HUMin-Jun，ZHUZhi-Wei，MINJie，SHIJian-Hua.JournalofInstrumentalAnalysis，2009，28(10):1185－1188应兴华，徐霞，胡敏骏，朱智伟，闵捷，施建华.分析测试学报，2009，28(10):1185－1188WANGYao，LIUShao-Bin，XIECui-Mei，ZHANGHan-Xia，LUWei-Hua.ChineseJ.Anal.Chem.，2011，39(1):67－71王耀，刘少彬，谢翠美，张汉霞，卢伟华.分析化学，2011，39(1):67－71ZHANGYun，LIYao-Ping，LIMin-Xin，HUANGMin-Hua，FUAi-Hua，ZHENGJie.ChineseJournalofAnalysisLaboratory，2009，28:191－194张云，李耀平，李敏新，黄闽花，傅爱华，郑洁.分析试验室，2009，28:191－194RoyS，KumarR，SharmaCB，PereiraBJ.BiodegradationandBioaccumulationofFenitrothioninRatLiver.BiomedicalChromatography，2004，18:132－136KitamuraS，S