高效液相色谱仪的维护

高效液相色谱仪的维护高效液相色谱仪的维护1.HPLC的日常操作条件：温度：10—30弋；相对湿度《80%;最好是恒温、恒湿，远离高电干扰、高振动设备。2．泵的保养：1） 使用流动相尽量要清洁；2） 进液处的沙芯过滤头要经常清洗；3） 流动相交换时要防止沉淀；4） 避免泵内堵塞或有气泡;3．进样器的保养：1） 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染；4．柱的保养：1）柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；2） 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净；3） 要注意流动相的脱气；4） 避免使用高粘度的溶剂作为流动相；5） 进样样品要提纯；6）严格控制进样量；7） 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品；8） 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；9） 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；5.检测器（UV）的保养：1） 紫外灯的保养：在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。2） 样品池要保养。高效液相色谱日常简易保养及维护1、流动相的抽作要求：高效液相级色谱醇，二次蒸馏水，缓冲盐一定要过滤；流动相脱气至关重要（可采用抽滤，超声波脱气等方法）2、吸滤头：特殊情况下可拆下滤头抽取以判断其中是否堵塞；亦可用注射器吸取流动相通过吸滤头打出以判断其是否堵塞。若有堵塞情况可用异丙醇超声波清洗；清洗不成功则需要更换。3、单向阀：如遇到泵压不稳或流动相不能抽取，则可能是单向阀出现问题，卸下用异丙醇超声波清洗，清洗时须按其安装的方向放置在小烧杯中，切记不可与安装方向倒置超洗！4、泵头：泵头漏液或出现其它故障一般要申请维修（如漏液，或更换柱塞杆及其密封垫等）5、过滤器：当色谱峰出现异常情况时，有可能是此部件被污染，拆下用异丙醇超洗或更换过滤垫片。6、排液阀：此处不能完全密封或漏液时一般是其中的垫片污染或磨损，可卸下后取出其垫片用异丙醇超声波清洗或更换垫圈。7、手动进样器：平时应注意用二次蒸馏水和甲醇在装载状态及进样分析状态清洗；如出现漏液现象，原因极可能为转子密封垫磨损或污染，一般须申请维修或更换配件。8、流通池：在色谱峰不正常时会可能是此部件补污染。可拆卸后取出其中的垫片用异丙醇超洗（可根据说明书进行操作或申请维修）。9、工作站：出现死机可重起计算机；不正常运行时，首先可更换电脑测试其硬件故障；或在本机上重新插拔接口、重新安装软件。泵压不稳1、泵头有气泡——流动相脱气/大流量冲洗泵/用注射器抽取流动动相2、单向阀故障——清洗若上述操作仍不能解决，可用异丙醇冲洗流动（无色谱柱冲洗，由手动进样器直接进检测器），流量为3-4ml/min,冲洗50分钟左右，然后重新安装色谱柱，更换流动相平衡，如此再不能解决泵压波动故障，可申请更换配件。色谱的保养：漏液处理：流路堵塞问题：缓冲盐的使用：流动相含有盐分时，做完实验后一定要进行流路冲洗；首先用水冲洗，打开排液阀用PURG键转换出原有含盐的流动相，然后关闭排液阀打开泵冲洗全部流路45分钟以上，如此更换流动相为水和甲醇混合液冲洗全部流路30分钟（此步骤一般可省去，根据实验而论），最后更换纯甲醇冲洗全部流路45分钟以上。泵头冲洗；用备件中的针头和针管分别用蒸馏水和纯甲醇冲洗3-5ml。如流动相不含盐，可对机器定期进行简单的冲洗维护，根据实验多少而定。手动进样器冲洗；同样用备件中的针管和专用冲洗针头对手动进样器的装载状态和进样状态分别进行冲洗3-4ml的蒸馏水，然后再冲洗3-4ml的纯甲醇。确保每次做完实验，所有流路中充满纯甲醇！色谱的保养：C18柱绝对不能进蛋白样品、血样，生物样品。要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。长时间不用仪器，应该将柱子取上用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相（如甲醇）保存，因为纯水易长霉。流路堵塞问题堵塞导致压力太大，按预柱j混合器中的过滤器j管路过滤器j单向阀检查，并清洗。清洗方法：①以民丙醇作溶剂冲洗②放在异丙醇中超声波清洗③用10%稀硝酸清洗如何选择保护柱？怎样选择保护柱，但又不影响分离分析？通常，在选择保护柱之前首先要考虑的是样品是否清洁，对于大部分分析工作者来说，一只1cm长的保护柱便能提供充分的保护作用。但是，如果样品非常不清洁，或工作中发现经常要更换1cm的保护柱，那么就应该选用2cm或3cm的保护柱，保护柱越长自然所装填的色谱填料就越多，则其保护性能越好，当然随着保护柱长度的增加，样品的保留时间也相应增加，一般来说，保护柱的内径与分析色谱柱的内径相同或相当即可。保护柱的填料装填方式也很重要，目前有薄膜装填法的保护柱，使用过程简单方便，而且可以在实验室中进行干装。但是，其最大的缺点是不经济，特别是针对中国的具体情况，一次性使用相对费用较高。另外，薄膜装填法的保护柱所装填的色谱填料有限，只能提供很有限的保护作用；不过也因为所装填的色谱填料较少，保护柱的长度也较短，所以对分析样品的保留时间的影响也很小。另一种保护柱结构其实质是缩短了色谱分析柱，设计方式上有直连式/手紧式或整体式。整体式设计是由色谱柱的生产厂商直接安装在色谱分析柱上的，必须与色谱分析柱一同订货，可以非常方便的使用，但不能被修改。直连式结构设计可以在任何时候由色谱工作者来安装连接，可以与任何品牌的色谱柱连接使用，而且可以根据不同的样品选择合适的保护柱长度。手紧式保护柱从结构上讲是与直连式保护柱一样，只是在连接时不用借助扳手等工具，直接用手上紧即可。另外从保护柱结构的角度看，保护柱结构又分为是否可以更换保护柱柱芯，现在大多数的保护柱均可以更换柱芯，可以降低保护柱的使用成本。大多数人是根据色谱分析柱的填料来选择保护柱的填料，正常情况下可以选择与分析色谱柱一样的色谱填料。但是，根据实际的分析工作，也可不必与分析色谱柱的填料完全匹配。对于选择保护柱的原则是：在满足分离分析要求的前提条件下，尽可能的选择较短的保护柱，尽可能选择对分离样品小一些保留性的填料。HPLC故障及排除方法（一） 保留时间变化柱温变化：柱恒温；等度与梯度间未能充分平衡：至少用10倍柱体积的流动相平衡柱缓冲液容量不够：用＞25mmol/L的缓冲液柱污染：每天冲洗柱柱内条件变化：稳定进样条件,调节流动相柱快达到寿命：采用保护柱（二）保留时间缩短流速增加：检查泵,重新设定流速样品超载：降低样品量键合相流失：流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向流动相组成变化：防止流动相蒸发或沉淀温度增加：柱恒温（三） 保留时间延长流速下降：管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡硅胶柱上活性点变化：用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱键合相流失：同前（二）3流动相组成变化：同前（二）4温度降低：同前（二）5（四） 出现肩峰或分叉样品体积过大：用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%样品溶剂过强：采用较弱的样品溶剂柱塌陷或形成短路通道：更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件柱内烧结不锈钢失效：更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品进样器损坏：更换进样器转子（五）鬼峰进样阀残余峰：每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗样品中未知物：处理样品柱未平衡：重新平衡柱,用流动相作样品溶剂（尤其是离子对色谱）4•三氟乙酸（TFA）氧化（肽谱）：每天新配，用抗氧化剂水污染（反相）：通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水（六） 基线噪声气泡（尖锐峰）：流动相脱气,加柱后背压污染（随机噪声）：清洗柱，净化样品，用HPLC级试剂检测器灯连续噪声：更换氘灯电干扰（偶然噪声）：采用稳压电源,检查干扰的来源（如水浴等）检测器中有气泡：流动相脱气,加柱后背压（七）峰拖尾柱超载：降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相峰干扰：清洁样品,调整流动相硅羟基作用：加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降彳氐流动相PH值，钝化样品同前（四）4：同前（四）4同前（四）3：同前（四）3死体积或柱外体积过大：连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管柱效下降：用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱（八）峰展宽进样体积过大：同（四）1在进样阀中造成峰扩展：进样前后排出气泡以降低扩散数据系统采样速率太慢：设定速率应是每峰大于10点检测器时间常数过大：设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%流动相粘度过高：增加柱温,采用低粘度流动相检测池体积过大：用小体积池,卸下热交换器保留时间过长：等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱柱外体积过大：将连接管径和连接管长度降至最小样品过载：进小浓度小体积样品维修经验与原则亲自重复故障（如果可以重复的话），不轻信用户或第三者的口述或转述。仔细观察，不轻信用户的口述，尤其是第三者的转述。有的操作者为了推脱自己的责任，会说仪器自己突然……，自己什么也没动等等，这些都是可以理解的，工程师要会妥善处理。先外部，后内部。不要动不动就打开机壳，没有初步的判断和排除就喜欢铺开摊子绝不是老手的做法。指望打开机壳看哪里有断线或明显故障之处，纯粹是在碰运气，即使好运也不可能每次都这样。约有50%故障是由外部环境或操作、清洁等造成的。如是否关机时间长了？昼夜温差是否很大？仪器放置的位置是否离电梯间很近?仪器附近还有什么仪器在使用？计算机设置是否正确？等等。先电源，后主机；先附件，后主机。应先检查电源是否稳定、负载是否过重、地线是否良好、电极等附件是否良好和正常、各接口是否正确等。充分利用仪器面板上各种按键、显示屏幕和操作或维修程序等，作些排除，这需要极其熟悉结构。（重要步骤）了解用户的操作习惯、操作人员结构和水平，科室经济情况等也会对维修有很大帮助。如可推断清洁保养得如何，是否有欲更新的想法（否则无论怎么修都不会说好）等。如笔者碰到一台血球计数仪，前任几个工程师无数次维修，持续二年，还换过新机器，但不到半年又重复出现故障，麻烦不断。我接手后有一次接报修，赶到时屏幕暗的，问医生是这台吗？医生回答是的，且上前按电源开关，按后无反应，就又按一下，机器重启了。原来仪器有屏幕保护功能，该科室无专人保管使用，使用者用好就走，后一使用者一看屏幕暗的，就开开关。每天数百次开关电源，怎有不坏之理？修好后，我写了一个条子贴在仪器前，写明若发现屏幕暗，先随意按一下任何键，不亮再开电源开关。从此就再也没这么麻烦了。不轻易更换原来仪器上的元器件和板子、管道等，因为有些元器件与板子、软件数据相关。更不能*不停地换板子和部件来缩小故障源，否则招一民工教教即会（目前此类维修者最多，既可收费又简单）。必要时仪器或工程师要承担责任，背“黑锅”。若责任在科室或使用者，以后更难打交道了。出于各种目的，也会出现有人故意设置故障。最好解铃还须系铃人！否则很花时间。修好一台仪器不容易，尤其是老仪器；搞坏一台仪器可是太容易了，不需要什么知识。色谱柱和色谱系统的故障检修HPLCColumnandSystemTroubleshooting1.HPLCColumnandSystemTroubleshooting色谱柱和色谱系统的故障检修WhatEveryHPLCUserShouldKnow每个HPLC使用者应该知道什么：HPLCComponentsHPLC的组成Pump泵Injector/Autosampler进样器/自动进样器Column色谱柱Detector检测器DataSystem/Integrator数据系统/积分仪表Allofthesecomponentscanhaveproblemsandrequiretroubleshooting.所有这些部件可能出现故障而需要检修。CategoriesofColumnProblems色谱柱问题的类型Pressure压力Peakshape峰形Retention保留时间PressureIssues压力问题ColumnObservationsPotentialProblems色谱柱观测潜在的问题HighpressurePluggedfrit压力高堵塞滤头Columncontamination色谱柱污染Piuggedpacking堵塞填料DeterminingtheCauseandCorrectingHighBackPressure查出原因纠正压力Checkpressurewith/withoutcolumn-manypressureproblemsareduetoblockagesinthesystemorguard有／无柱子时检查压力－许多压力问题是由于系统或保护柱的阻塞IfColumnPressureishigh如果柱压高：Washcolumn-Eliminatecolumncontaminationand冲洗柱子pluggedpacking排除柱污染和填料堵塞highmolecularweight/adsorbedcompounds高分子量/被吸附化合物precipitatefromsampleorbuffer样品或缓冲液中的沉淀物Backflushcolumn-Clearpluggedfrit反冲柱子－清洁阻塞的滤头Changefrit-Clearpluggedfrit更换滤头ColumnCleaning柱子清洗Flushwithstrongersolventsthanyourmobilephase用比你的流动相更强的溶剂冲洗Reversed-PhaseSolventChoicesinOrderofIncreasingStrength为了增加强度选择反相溶剂Useatleast25mlofeachsolventforanalyticalcolumns对于分析柱每种溶剂至少用25ml冲洗Mobilephasewithoutbuffersalts没有缓冲盐的流动相100%Methanol甲醇100%Acetonitrile乙腈75%Acetonitrile:25%Isopropanol75乙腈：25％异丙醇100%Isopropanol异丙醇★二氯甲烷•100%MethyleneChloride★已烷★WhenusingeitherHexaneorMethyleneChloridethe•100%Hexanecolumnmustbeflushedwith•Isopropanolbeforereturningtoyourresvered-phasemobilephase.当用已烷蔌二氯甲烷柱子时,必须先用异丙醇冲洗,然后再用你的反相流动相7.ColumnCleaning柱子清洗NormalPhaseSolventChoicesinOrderofIncreasingStrength为了增加强度选用正相溶剂Useatleast50mlofeachsolvent每种溶剂至少用50ml50%Methanol:50%Chloroform50%甲醇:50%氯仿100%EthylAcetate乙酸乙酯HowtoChangeaFrit怎样更换滤头ColumnInletFrit柱进口滤头ColumnBody柱身CompressionFerrule压缩金属套圈Weargloves戴手套Donotallowbedtodry不要让底座干燥Donottouchthecolumn-bodyheatwillextrudepacking不要使柱身受热,否则填料会喷出Donotovertighten不要旋得太紧FemaleEndFitting旋好尾端螺母MaleEndFitting旋好尾端螺头PreventingBackPressureProblems压力问题的预防Usecolumnprotection柱保护-Guardcolumns保护柱/预柱-In-linefilters在线过滤器SamplePreparation样品预处理Appropriatecolumnflushing适当的柱冲洗Filterbufferedmobilephase过滤缓冲流动相PreventingBackPressureProblems:In-LineDevices压力问题的预防:在线装置MobilePhasePre-ColumnInjectorFilterGuardFromPump预柱进样器滤头Column从泵来的流动相保护柱AnalyticalColumnFilterandGuardColumnActonSample分析柱滤头和保护柱作用于样品Pre-ColumnActsonMobilePhase预柱作用于流动相ToDetector到检测器PreventingBackPressureProblems:SamplePreparation压力问题的预防:样品制备Solvent/ChemicalEnvironment溶剂/化学环境Particulate/AggregateRemove微粒/凝聚物的除去Filtersamples过滤样品Centrifugation离心分离SolidPhaseExtraction(S.P.E.)固相萃取CartridgesorPlates薄膜或薄层板DisksorMembranes圆盘或生物膜PeakShapeIssues12.峰形问题Splitpeaks裂峰Peaktailing峰拖尾Broadpeaks宽峰Poorefficiency低柱效Manypeakshapeissuesalsocombinations-I.e.Broadandtailingortailingwithincreasedretention许多峰形问题是结合在一起的-例如:展宽和拖尾或拖尾和保留时间增加13.SplitPeaks裂峰Canbecausedby:可能的原因:Columncontamination柱污染Partiallypluggedfrit咅B分阻塞滤片Columnvoid柱头塌陷Injectionsolventeffects溶剂效应14.SplitPeaks裂峰ColumnContamination柱污染Column:StableBondSB-C8,4.6x250mm,5pmMobilePhase:60%25mMNa2HPO4,pH3.0:40%MeOHFlowRate:1.0mL/minTemperature:35oCDetection:UV254nmSample:FilteredOTCColdMedication:PseudoephedrineAPAPUnknownChlorpheniramineInjection1峰3峰形较好Injection30峰3裂峰Injection1AfterColumnWashwith100%CAN经100%乙腈冲洗后峰3峰形极好15.SplitPeaks裂峰InjectionSolventEffects溶剂化效应Column:StableBondSB-C8,4.6x250mm,5pmMobilePhase:82%H2O:18%ACNInjectionVolume:30pLSample:Caffeine咖啡因Salicylamide水杨酰胺InjectionSolventInjectionSolvent100%AcetonitrileMobilePhase峰形宽拖尾峰形尖锐对称样品溶剂尽可能与流动相匹配DeterminingtheCauseofSplitPeaks裂峰原因的确定Complexsamplematrixormanysamplesanalyzed-likelycolumncontaminationorpartiallypluggedfrit复杂样品的基质或分析许多样品-柱污染或部分阻塞滤片MobilephasepH>=7-likelycolumnvoidduetosilicadissolution(unlessspecialtycolumnused)流动相pH>=7-由于硅胶溶解使柱塌陷(除非使用专门的柱子)Injectionsolventstrongerthanmobilephase-likelysplitandbroadpeaks,dependentonvolume溶剂比流动相的可能性大-裂峰和宽峰,由样品量来决定PeakTailing,BroadeningandLossofEfficiency峰拖尾、变宽和柱效降低Canbecausedby:可能的原因Column“secondaryinteractions”柱“次级效应”Columnvoid柱塌陷Columncontamination柱污染Columnaging柱老化Columnloading柱负荷超载Extra-columneffects柱外效应PeakTailingColumn“SecondaryInteractions”峰拖尾柱“次级效应”Column:Alkyl-C8,4.6x150mm,5pmMobilePhase:85%25mMNa2HPO4,pH7.0:15%ACNFlowRate:1.0mL/minTemperature:35oCSample:1.Phenylpropanolamine苯丙醇胺/去甲麻黄碱Ephedrine麻黄碱Amphetamine安非他明/苯丙胺Methamphetamine脱氧麻黄碱Phenteramine苯三胺NoTEA无三乙胺10mMTEA10mM三乙胺USPTF(5%)美国药典拖尾因子USPTF(5%)美国药典拖尾因子1.291.1.191.912.1.181.633.1.202.354.1.261.575.1.14Peaktailingeliminatedwithmobilephasemodifier(TEA)atpH7用流动相减尾剂(三乙胺)在pH7消除峰拖尾PeakTailingColumn“SecondaryInteractions”峰拖尾柱“次级效应”Column:Alkyl-C8,4.6x150mm,5pmMobilePhase:85%25mMNa2HPO4,pH7.0:15%ACNFlowRate:1.0mL/minTemperature:35oCSample:1.Phenylpropanolamine苯丙醇胺/去甲麻黄碱Ephedrine麻黄碱Amphetamine安非他明/苯丙胺Methamphetamine脱氧麻黄碱Phenteramine苯三胺pH3.0pH7.0USPTF(5%)美国药典拖尾因子USPTF(5%)美国药典拖尾因子