高效液相色谱仪HPLC使用资料点滴

高效液相色谱仪使用点滴二、WatersHPLC2695分离单元使用操作/dvbbs/dispbbs.asp?boardID=151&ID=87627&page=11、 开机自检打开电源开关，仪器开始自检(4〜5min)，待屏幕上方出现“Idle”字样表示自检成功。2、 脱气(Degas)按面板右下方“MenUStatus”键进入“Status(1)”界面，移动光标至“DegasserMode"，按Enter选择“On”，打开在线脱气。注意：自动脱气机？在开启除气装置时，要确认所有溶剂管路都充满溶剂；若没有溶剂时请执行溶剂的DryPrime动作。当溶剂流速为0.0时，一定要关闭除气装置，不然可能会过度真空使除气槽(vacuumchamber)破裂，而造成移动相外流出来.当溶剂的管子是空的时候，或是更换溶剂的时候，先执行DryPrime。按“MenUStatus”键，进入Status(1)画面，按“DirectFunction”功能键，选择DryPrime，按Enter。冬天脱气时，室温应大于10°C。3、 设定柱温(可选项)

在“Status（1）”界面，移动光标至“ColHtrSet”，输入目标温度按Enter即可（可在工作站方法中设置）。注意：设定温度应高于室温5°C低于60°C。4、 PrimeSealWash（清洗柱塞杆）按“Menu/Status”键回到“Menu”界面，按下排功能键“Diag”，然后再按下排功能键“PrimeSealWsh”，按'Start”键，冲洗1〜2min后，先按“HALT”键，再按“CLOSE”键，结束柱塞杆的清洗。注意：（1）清洗柱塞杆的溶剂可以用水，或5%-10%甲醇（抑菌）。（2）可以每天开机后进行，或结束实验时进行。流动相中有盐，结束实验时一定要清洗，仪器不自动进行。5、 WetPrime在“Status（1）”界面中"Composition”下，选择将用到的溶剂通道为“100%”，按液晶屏幕右下角“DirectFunction”键，移动光标选择“2WetPrime”，“OK”，流速及时间可使用默认值，也可自行设定（如：5ml/min，3min），“OK”即可。将每一个会用到的溶剂通道按照上述操作一次。6、 PurgeInjector（注射器排气泡及清洗）进入“DirectFunction”界面后，选择“3PurgeInjector”，“OK”，默认数值为6，“OK”。7、 PrimeNeedleWash（清洗注射针）

按“Menu/Status”键回到“Menu”界面，按下排功能键“Diag”，进入“Diagnostics”界面，按下排功能键之“PrimeNdlWsh”，按“Start”键，默认30秒钟，按“Close”键，即可返回“Diagnostics”界面。注意：以上4~7操作步骤为溶剂系统前处理过程，建议每天开机后依次进行。若发现注射器中有气泡，则可重复6的操作步骤直至排除。如果流动相中含有盐类，则实验结束后必须用水清洗柱塞杆••(即操作4)。8、 平衡柱子在“Status(1)”界面上，按流动相比例设定各通道溶剂比例后，再WetPrime操作一次，然后设置流速，平衡色谱柱30~60min。9、 放置样品拉开样品转盘舱门，将盛有待测样品溶液的样品瓶放入转盘中,记下样品瓶号，关上舱门。10、 检测样品打开工作站，设置仪器方法、方法组、自动进样序列等，监视基线、检测样品。11、 分析处理数据、打印报告12、 清洗注射器、针、柱塞杆参见上述4、7的操作步骤。

13、 清洗色谱柱用水冲洗柱子40-60min（视柱子规格不同，流速通常1ml/min）；然后用甲醇或乙腈冲洗柱子40min（流速1ml/min）。14、 关机关掉电源开关。氨基柱是同时可以用于正相条件和反相条件的，http://www.sepu.net/dvbbs/dispbbs.asp?boardID=148&ID=29087&page=l这一点很多用户都已经知道；但是要注意到的是：正相溶剂和反相溶剂往往是不互溶的，对这一点的忽略可能会带给使用者一些麻烦。对于新购买到的柱子，首先请注意打开分析测试说明书，了解柱子的保存溶剂。如果保存溶剂与你将要使用的流动相极性不同不会互溶，请先用异丙醇过渡。过渡过程中注意因异丙醇粘度较大，会导致柱压很高，适当调低流速即可。如果要使用的流动相中还含有缓冲盐类，建议在用分析流动相之前，先用不含缓冲盐的同比例流动相过渡，这样可避免缓冲盐在分析柱内的析出。柱效检测：我用于判断一个用户是否有经验的指标之一，是用户是否习惯配制一些柱效检测标准溶液。说到柱效检测，我可以向大家提供一个方法，而且很通用，你也可以用同样的标准溶液和流动相来检测硅胶柱和氰基柱。流动相：10%乙酸乙酯+90%正己烷流速1.0标准溶液：乙苯（如乙苯找不动就用甲苯代替呗）+苯甲酸甲酯检测波长254nm这个方法特别适用于新购柱子（新购柱子往往保存在正相溶剂中）时即进行检测，如有问题，可及时与供应商沟通。也适合在柱子在准备放置相当长一段时间之前进行充分清洗后进行检测作为记录留档。在平常的使用过程中，如果分析物是固定重复的，我们当然可以从对分析物的分离分析情况来作出判断；但如果分析物和分析条件不同时，定期检测柱效可以避免柱效下降导致分离不佳再分析查找原因这样浪费人力物力的过程。不过特别要注意的是，当氨基柱（或氰基柱）在反相条件中使用时，如用该条件检测，请注意流动相的换相过渡问题。氨基柱的使用：需要注意的是，氨基柱的键合官能团氨丙基要比C18,C8柱的键合官能团C18,C8要容易水解，所以首先要做好其使用寿命稍逊的心理准备，特别是当你的使用条件是反相条件下时。反相条件下使用时，要特别注意控制PH值范围，PH值越低越有发生水解的危险，流动相中水的比例越高当然也越有发生水解的危险。所以，在使用后以及准备长时间放置该柱时，必要的清洗和将氨基柱保存于纯的有机溶剂中是很好的保养措施。有一种情况是，当使用氨基柱进行酸性物质如果汁的分析时（分析其中的糖份），酸性物质的存在意味着质子的存在，可能会使略带负电荷的氨基官能团质子化，导致使用一段时间后对于某些类的分析物保留性质有所改变或表现在柱效下降。这时，Kromasil专家所给的建议是：用5-10倍的柱体积的含0.5-1.0%NH3的50-50乙腈-水溶液冲洗该柱（冲洗后当然要再用不含碱的流动相洗去多余氨），之后再进行分析这类酸性分析物时建议在流动相中略微添加少许氨如0.1%。氨基柱的清洗简单说起来，正相条件下使用的氨基柱你就参照硅胶柱的清洗方法；反相条件下使用的氨基柱你就参照C18的清洗方法。平时在正相条件下使用：首先用50倍柱体积的异丙醇清洗，因异丙醇粘度较大可适当放低流速；之后，用50倍的甲醇清洗；之后，用异丙醇过渡回到平常使用的正相流动相，即可。平时在反相条件下使用：缓冲盐应及时冲洗，以及不能直接用纯甲醇冲

洗缓冲盐等，属常识就不作特别交待了。用50倍纯甲醇冲洗；之后，用异丙醇过渡后，用二氯甲烷冲洗色谱柱；之后，再用异丙醇过渡回来到甲醇条件下。这些清洗方法，主要是针对当样品中有杂质逐步吸附累积到填料上时的处理方法，色谱柱表现行为为诸如柱压增高柱效降低等LUNA氨基柱的使用方法氨基柱既可以正相使用，也可以反相使用，但是要注意到的是：正相溶剂和反相溶剂往往是不互溶的，正常情况新氨基柱保存在正相环境中，例如LUNA氨基柱保存在正己烷-乙腈（99：1）中。正相使用2.1新柱子可直接用流动相。推荐先用正己烷-乙腈（99：1）以0.5ml/min的流速冲10倍柱体积，再根据流动相选用极性相近的氯仿或二氯甲烷以相同的流速冲10倍柱体积，最后换成流动相。2.1正相使用时，不宜分析含醛基、羰基的化合物，不可用于还原糖的分析；流动相要彻底脱气，并不得含有羰基化合物和过氧化物（质量不好的yi醚、四氢咲喃含有少量）。2.3任何时候更换流动相时都要确保新流动相与柱子原保存液可互溶。3反相使用3.1先用正己烷-乙腈（99：1）以0.5ml/min的流速冲10倍柱体积，再依次以相同的流速相同的用量用氯仿、异丙醇、甲醇、甲醇-水（50：50）冲柱子。3.2以0.5ml/min的流速用30倍柱体积的pH11.0的氢氧化钠（LUNA）水溶液冲柱子（注意pH值切不可超过11.0），立即用水（0.5ml/min的流速，30倍柱体积）冲洗，再换成流动相。3.3配制流动相时，应各组分分别量取，比例较小的组分要精密量取，需调pH值时要精密到0.1。3.4反相条件下使用时，要特别注意控制pH值范围，pH值越低越有发生水解的危险，流动相中水的比例越高当然也越有发生水解的危险。最理想的pH范围在pH3.0-7.03.5如果要使用的流动相中还含有缓冲盐类，建议在用分析流动相之前，先用不含缓冲盐的同比例流动相过渡，这样可避免缓冲盐在分析柱内的析出。3.6有一种情况是，当使用氨基柱进行酸性物质的分析时，酸性物质的存在意味着质子的存在，可能会使略带负电荷的氨基官能团质子化，导致使用一段时间后对于某些类的分析物保留性质有所改变或表现在柱效下降。建议：用5-10倍的柱体积的含0.5-1.0%NH3的乙腈-水（50:50）溶液冲洗该柱（冲洗后当然要再用不含碱的流动相洗去多余氨），之后再进行分析这类酸性分析物时建议在流动相中略微添加少许氨如0.1%。4色谱柱的冲洗：简单说起来，正相条件下使用的氨基柱就参照硅胶柱的清洗方法；反相条件下使用的氨基柱就参照C18的清洗方法。5色谱柱的保存5.1正相使用时，将柱子冲洗干净后，用正己烷-乙腈（99：1）保存。5.2反相使用时，如短期不用，可用甲醇或乙腈保存；长期不用时需将甲醇依次用异丙醇、氯仿置换，最后用正己烷保存。6色谱柱的再生6.1方案1：依次用甲醇、异丙醇、氯仿、正己烷、氯仿、异丙醇、甲醇冲柱子（各以0.5ml/min的流速，20倍柱体积），再换流动相。这些清洗方法，主要是针对当样品中有杂质逐步吸附累积到填料上时的处理方法，色谱柱表现行为为诸如柱压增高柱效降低等。6.2方案2：NH2柱用于反相条件时，NH2键会水解，尤其是在该柱子pH范围以外，在极端酸性和碱性条件下柱寿命会下降很快，如果在这个条件下使用需要清洗一下，需要用10倍柱体积溶液冲洗，如下：95%水/5%乙腈THF四氢咲喃95%乙腈/5%水并保持95%乙腈/5%水继续冲洗，以低流速0.2-0.5mL/min过夜冲洗。

6.3方案3：柱子使用一定时间后，柱效下降，老化，也可清洗一下柱子恢复柱性能清洗时依次用10倍柱体积的下列溶液冲洗：95%水/5%乙腈THF四氢咲喃95%乙腈/5%水再走流动相即可2695运行过程中，两种流动相切换过程中压力忽高忽低，是怎么回事？http://www.sepu.net/dvbbs/dispbbs.asp?boardID=151&ID=106954&page=l切换流动相的时候先wetprime一下，如果还是不行可能是单向阀的问题两种流动相能混溶吗？？可能有气泡生成应该是汽泡问题，dryprime一下吧。dryprime,这种叫做干排法！就是说管路里已经没有液体拉，也就是说管路里完全都是气泡，会选择这个。这种方法会让液体慢慢的充满整个管路！wetprime，这种叫做湿排！就是说管路里有液体，但是其间有气泡，这个情况下会选择这种方法！/showtopic-13664.html秘诀1：由强到弱：一般先用90%的乙腈（或甲醇）/水（或缓冲溶液）进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂（乙腈或甲醇）的比例。秘诀2三倍规则：每减少10%的有机溶剂（甲醇或乙腈）的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。秘诀3粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。最小检测限的计算方法（以N2000色谱工作站为例）/showtopic-23303.htmlCL=2*Nd*c*20/HV注：Nd基线噪声，单位：mVc样品浓度H峰高，单位：mV（或AU）V进样体积例：如基线噪声为20微伏即0.02mV,萘的甲醇标样溶液浓度为0.0001g/L,峰高145000微伏即145mV，进样体积为20微升，即得：CL=2*0.02*0.0001*20/145*20=2.76e-8即10的负8次方HPLC系统的酸清洗和钝化/showtopic-29179.html1、30％磷酸水溶液30％磷酸水溶液通过酸反应和强表面活性剂／洗涤剂的共同作用，可以有效地清洁不锈钢及其它润湿的部件。这一方法比更常用的硝酸“钝化”绝对更有效、且较少损害（特别是对日常使用低紫外波长的应用来说）。这一磷酸清洗步骤不是起钝化作用，但它是系统钝化前清洗的第一步。一般来说，对于阳离子的离子色谱分析或配有氧化方式的电化学检测器以外的应用不需要钝化系统。因为有真空脱气机（每个通道体积为8m1），可不必用磷酸；中洗全部通道。如果你计划四个通道都要用，则可用湿灌注的方式以4mL/min流速对每个通道清洗8〜1O分钟来清洗脱气机。这一步完成后你必须彻底淋洗管路，用水淋洗2〜3次以便将磷酸从溶剂过滤头等部件冲洗净。安装好的HPLC系统的酸清洗和钝化HPLC系统内部可能的污染物来自人的触摸，暴露在实验室化学环境，与零部件制造相关的残留物，或来自先前的流动相和样品的残余物。虽然系统自身也会逐步地被流动相清洗，但某些释放出的杂质会吸附在色谱柱上以及检测器润湿的表面上，因而会降低总的性能。磷酸清洗：通常用于从系统中除去有机杂质。可能是由于洗涤作用，它似乎比强有机溶剂更好也更快。这一步清洗必须在硝酸钝化之前完成。硝酸钝化：实际上是作用于不锈钢表面，在表面上生成均匀的氧化层。这层氧化膜保护不锈钢免受腐蚀（卤化物，螯合剂，等等）并且尽量减少浸出的金属离子进入流动相。以下应用需要在使用前做磷酸清洗和硝酸钝化，包括：所有的氨基酸分析系统；所有包含电化学检测器的系统；所有要分析无机阳离子，包括过渡金属的系统；所有利用柱后添加衍生试剂或络合样品组分的系统。以下应用需要在使用前只做磷酸清洗，包括：①所有常规用途的、可能在低pH环境下在