311DNA重组技术的基本工具

1专题1基因工程1.1DNA重组技术的根本工具根底实际和技术开展催生了基因工程科技探求之路1)基因转移载体的发现2)工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明4)DNA体外重组的实现5)重组DNA表达实验的胜利6)第一例转基因动物问世7)PCR技术的发明角似鹿鼻似狮目似虎唇似牛爪似鹰髭似马鳞似鱼身似蛇想象一能否培育出具有抗虫性状的抗虫棉呢？蓝色玫瑰能消费胰岛素的大肠杆菌转基因鼠能发荧光的转基因猪9是指按照人们的志愿，进展严厉的设计，经过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，发明出更符合人们需求的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子程度上进展设计和施工的，又叫DNA重组技术或基因拼接技术。什么叫基因工程？生长激素、胰岛素10别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子程度人类需求的新的生物类型和生物产品〔或基因产物〕剪切→拼接→导入→表达实质〔原理〕基因重组对基因工程概念的了解一种定向改造生物的新技术第1节121.1DNA重组技术的根本工具13基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因与载体DNA拼接导入棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)14关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取。关键步骤二：抗虫基因与载体DNA衔接。关键步骤三：抗虫基因进入棉细胞。基因的分子手术刀——限制性内切酶。

基因的分子缝合针——DNA衔接酶。

基因的分子运输车——载体。如何处理？抗虫棉培育来源种类作用作用结果阅读课本4-5页“限制性核酸内切酶——分子手术刀〞的相关内容，填写下表自主学习一主要从原核生物中分别纯化而来曾经分别出大约4000种1、识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列2、使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。构成两种末端：黏性末端或平末端1’2’3’4’5’脱氧核苷酸的构造G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A3’,5’-磷酸二酯键3’端5’端3’端5’端磷酸二酯键18仔细察看各限制酶识别的特定序列有何特点？限制酶的识别序列限制酶所识别的序列的特点是：找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称反复陈列的，称为回文序列中轴线在G与A之间切割大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。EcoRI限制酶的作用

黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。错位切SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。中轴线SmaI限制酶的作用在G与C之间切割平末端平末端SmaI限制酶的切割当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。限制酶作用特点1、限制酶识别特定的核苷酸序列——回文序列回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。2、限制酶断开磷酸二酯键他能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？原核生物〔主要是细菌〕易受自然界外源DNA〔噬菌体DNA〕的入侵，但生物在长期的进化过程中构成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的损害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证本身的平安。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而到达维护本身的目的。寻根问底寻根问底为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？经过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者经过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，虽然细菌中含有某种限制酶也不会使本身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。261、要想获得某个特定性状的基因必需求用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。3、假设把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生一样的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。2、要把目的基因插入运载体的前提是什么必需用同一种限制酶来切割目的基因和运载体。思索?27类型来源功能一样点差别E·coliDNA衔接酶T4DNA衔接酶大肠杆菌T4噬菌体催化构成磷酸二酯键只能衔接黏性末端能衔接黏性末端和平末端(效率较低)阅读课本第5页“分子缝合针——DNA衔接酶〞的相关内容，填写下表自主学习二28基因工程的衔接酶“DNA衔接酶〞将两段DNA片段衔接1．分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA衔接酶两类2．功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。★两种DNA衔接酶(E·coliDNA衔接酶和T4DNA衔接酶)的比较：①一样点：都缝合磷酸二酯键②区别：E·coIiDNA衔接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间衔接；T4DNA衔接酶能缝合两种末端，但衔接平末端之间的效率较低。把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸衔接起来催化构成磷酸二酯键DNA衔接酶的作用两DNA片段要具有互补的黏性末端才干拼起来DNA衔接酶的缝协作用可把黏性末端之间的缝隙“缝合〞起来，留意：DNA衔接酶可衔接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能衔接单链DNA！DNA衔接酶与DNA聚合酶是一回事吗？T4DNA衔接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合〞起来，但效率较低DNA衔接酶的缝协作用AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶的作用DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象

作用结果 用途都能催化构成磷酸二酯键都是蛋白质 不需求需求构成完好的重组DNA分子构成DNA的一条链基因工程DNA复制DNA衔接酶与DNA聚合酶的比较只能将单个核苷酸衔接到已有的DNA片段上，构成磷酸二酯键在两个DNA片段之间构成磷酸二酯键34DNA衔接酶的种类种类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶作用将双链DNA片段“缝合起来”，恢复被限制性内切酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。区别只能连接黏性末端黏性末端和平末端都能连接35362个4个1、每衔接两个一样的黏性未端要衔接几个磷酸二酯键？

2、用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键？思索：2.为什么限制酶和DNA衔接酶在微生物中可以分别到,而高等植物和动物中没有?原核生物容易遭到自然界外源DNA的入侵，但是生物在长期的进化过程中构成了完善的防御机制，以防止外来病原物的损害。限制性核酸内切酶就是细菌的防御性工具，当外源DNA侵入时，限制性核酸内切酶会将外源DNA切割掉，以保证本身的安全。所以，限制性核酸内切酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而维护本身的作用。载体的作用载体的必要条件载体的种类阅读课本第6页“分子运输车——运载体〞的相关内容，填写下表自主学习三1〕可以在宿主细胞中复制并稳定地保管。2〕具多个限制酶切点，以便与外源基因衔接。3〕具有某些标志基因，便于进展鉴定和选择。4〕必需是平安的，对受体细胞无害。5〕载体DNA分子应大小适中，以便于提取和操作1〕作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中2〕在受体细胞内对目的基因进展大量复制①细菌的质粒(由天然的改造而成)②病毒：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。39基因工程的载体目的基因指某些小型DNA分子可以在宿主细胞中复制并稳定地保管具有多个限制酶切点〔每种限制酶切点最好只需一个〕具有标志基因，便于进展挑选条件40常用的运载体主要有两类：1〕细菌细胞质的质粒2〕噬菌体或某些动植物病毒有标志基因的存在，可用含青霉素的培育基鉴别。有切割位点能复制并带着插入的目的基因一同复制质粒——裸露的、构造简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制才干的很小的双链环状DNA分子。最常用运载体——质粒实践上在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的根底上进展过人工改造的。42质粒是染色体外可以进展自主复制的裸露的、构造简单的、双链环状DNA分子。如今习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中核以外的DNA分子。

质粒Plasmids质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决议性作用，但复制只能在宿主细胞内完成。43大肠杆菌的质粒最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素、氨苄青霉素的标志基因。复制的方式：1、独立自我复制2、整合到染色体上，随染色体DNA同步复制。质粒〔人工改造的质粒〕是基因工程最常用的运载体。44ACGTGCAG标志基因外源基因ACGTGCAT45抗四环素基因四环素生长被抑制正常生活四环素重组DNA46例、知标志基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因，现讨论某细菌的质粒中有无标志基因或标志基因是什么？请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论。对照组：不添加抗生素实验组1：添加一定浓度的四环素实验组2：添加一定浓度的氨苄青霉素实验组3：添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素47对照组实验组1实验组2实验组3结论预期一＋＋＋＋预期二＋＋－－预期三＋－＋－预期四＋－－－对照组：不添加抗生素实验组1：添加一定浓度的四环素实验组2：添加一定浓度的氨苄青霉素实验组3：添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素既含有抗四环素基因也含有抗氨苄青霉素基因只含有抗四环素基因只含有抗氨苄青霉素基因既不含有抗四环素基因也不含有抗氨苄青霉素基因48重组DNA分子的模拟操作留意：这两条DNA分子的碱基对不是随意乱写的。首先，每个DNA分子上的两条链上的碱基要互补配对；第二，每个DNA分子中每条链都存在一个G-A-A-T-T-C的碱基序列，也就是说是EcoRI限制酶的识别位点，并存在G-A的切割位点。49天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？提示：基因工程中作为载体运用的DNA分子很多都是质粒〔plasmid〕，即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。能否任何质粒都可以作为基因工程载体运用呢？不是作为基因工程运用的载体必需满足以下条件：501〕载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必需是在质粒本身需求的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。2〕载体DNA必需具备自我复制的才干，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。3〕载体DNA必需带有标志基因，以便重组后进展重组子的挑选。4〕载体DNA必需是平安的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。5〕载体DNA分子大小应适宜，以便提取和在体外进展操作，太大就不便操作。实践上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进展人工改造后才干用于基因工程操作。51DNA衔接酶有衔接单链DNA的身手吗？迄今为止，所发现的DNA衔接酶都不具有衔接单链DNA的才干，至于缘由，如今还不清楚，也许未来会发现可以衔接单链DNA的酶。52思索：一、质粒是基因工程中最常用的运载体，它的主要特点是〔〕1．能自我复制2、不能自我复制3、构造很小4、成分是蛋白质5、是环状DNA分子6、是环状RNA分子7、链状DNA分子8、能友好地借居在宿主细胞中二、质粒上会存在某些标志基因，这些标志基因有什么用途？1、3、5、8便于挑选、识别三、要想将某个特定基因与质粒相连，需求用几种限制性内切酶和几种DNA衔接酶处置？为什么？一种53例1、以下是两种限制酶切割后构成的DNA片段，试分析：①GC…②AATTC…③…GC④…CTTAACG…G……CG…G

(1)其中①和是由一种限制酶切割构成的末端，两者要重组成一个DNA分子，所用DNA衔接酶通常是。(2)和是由另一种限制酶切割构成的末端，两者要构成重组DNA片段，所用的衔接酶通常是。③平T4DNA衔接酶②④黏性E·coliDNA衔接酶54例2、某科学家从细菌中分别出耐高温淀粉酶〔Amy〕基因a,经过基因工程的方法，将a转到马铃薯植株中，经检测发现Amy在成熟块茎细胞中存在。这一过程涉及A.目的基因进入受体细胞后，可随着马铃薯的DNA分子的复制而复制，传给子代细胞B.基因a导入胜利后，将抑制细胞原有的新陈代谢，开辟新的代谢途径C.细菌的DNA分子较小，可直接作为目的基因，导入受体中不需求整合到马铃薯的DNA分子中D.目的基因来自细菌，可以不需求运载体直接导入受体细胞A例：限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶Ⅱ的切点。〔1〕请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所构成的黏性末端。〔2〕请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所构成的黏性末端。〔3〕在DNA衔接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后构成的黏性末端能否衔接？为什么？

可以衔接。由于由上述两种不同限制酶切割后构成一样的黏性末端〔或是可以互补的〕小试身手随堂练习：1、关于限制酶的说法中，正确的选项是〔〕A、限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列B、EcoRI切割的是G—A之间的氢键C．限制酶普通不切割本身的DNA分子，只切割外源DNAD．限制酶只存在于原核生物中答案：C572、以下说法正确的选项是〔〕A、一切的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B、质粒是基因工程中独一的运载体C、载体必需具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因衔接D、基因控制的性状都能在后代表现出来C583、以下不是基因载体具备的条件的是〔〕A、能自我复制B、有多个限制酶切点C、具有标志基因D、它是环状DNAD594、有关基因工程的表达中，错误的选项是〔〕A、DNA衔接酶将黏性末端的碱基对衔接起来B、限制性核酸内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由载体导入受体细胞D、人工合成目的基因不用限制性内切酶A605、有关基因工程的表达正确的选项是〔〕A、限制酶只在获得目的基因时才用B、重组质粒的构成在细胞内完成C、质粒都可作为载体D、蛋白质的构造可为合成目的基因提供资料D616、基因工程是在DNA分子程度上进展设计施工的。在基因工程操作的根本步骤中，不进展碱基互补配对的步骤是〔〕A、人工合成目的基因B、目的基因与载体结合C、将目的基因导入受体细胞D、目的基因的检测和表达C7、在将胰岛素的基因与质粒构成重组DNA分子的过程中，以下哪组是所需求的①同一种限制酶切割两者；②不需同一种限制酶切割两者；③参与适量的DNA衔接酶；④不需加DNA衔接酶A．①③ B．①④ C．②④ D．②③8、〔多项选择〕有关基因工程的表达中，错误的选项是A、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性状，培育生物新种类B、重组DNA的构成在细胞内完成C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、质粒都可作为运载体答案：BD9、以下四条DNA分子，彼此间具有粘性末端的一组是

A．①②B．②③C．③④D．②④答案：D10、以下黏性末端属于同种内切酶切割而成的是〔〕A、①②B、①③C、①④D、②③TCGAGCTTAAAGGTTCCAAGCTTCAGAATTCG③①②④11、以下哪一种酶是基因工程的工具酶A、DNA衔接酶B、DNA酶C、RNA酶D、运载体AA12、以下不适宜用于基因工程的运载体是〔〕A、质粒B、噬菌体C、细菌D、病毒C13、以下说法正确的选项是：〔〕A、限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列B、质粒是基因工程中独一的运载体C、重组技术所用的工具酶是限制酶、衔接酶、运载体D、利用运载体在宿主细胞内对目的基因进展大量复制的过程可称为“克隆〞D14、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需运用〔〕同种限制酶B.两种限制酶同种衔接酶D.两种衔接酶15、基因工程常用的受体细胞有〔〕(1)大肠杆菌〔2〕枯草杆菌〔3〕支原体〔4〕动植物细胞A.〔3〕〔4〕B.〔1〕〔2〕〔4〕C.〔2〕〔3〕〔4〕D.〔1〕〔2〕〔3〕16、如图为大肠杆菌及质粒载体的构造方式图，据图回答以下问题。(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为____________________，其作用是_________________________。(4)以下常在基因工程中用作载体的是()A．苏云金芽孢杆菌抗虫基因B．土壤农杆菌中的RNA分子C．大肠杆菌的质粒D．动物细胞的染色体【思绪点拨】此题经过质粒构造的方式图调查质粒的功能和特点，分析如下：17、(2021年北大附中高二检测)以下关于DNA衔接酶的表达正确的选项是()①催化一样黏性末端的DNA片段之间的衔接②催化不同黏性末端的DNA片段之间的衔接③催化两个黏性末端互补碱基间氢键的构成④催化DNA分子两条链的脱氧核糖与磷酸之间磷酸二酯键的构成A．①③B．②④C．②③D．①④【尝试解答】D18、(2021年雅礼中学高二检测)基因工程中，须运用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和挑选。知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是－G↓GATCC－，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是－↓GATC－。根据图示判别以下操作正确的选