编制说明-布鲁氏菌荧光偏振抗体检测方法

一、工作简况（任务来源、主要工作过程、主要参加单位和人员）（一）任务来源1.标准编制的必要性布鲁氏菌病（Brucellosis）简称布病，是由布鲁氏菌感染引起的包括人在内的多种哺乳动物共患的传染病。主要感染羊、牛、猪、犬、鹿、骆驼及人等，以流产、早产、死胎、睾丸炎、附睾炎、发热多汗、乏力、关节肿痛、肝脾及淋巴结肿大等为主要特征，我国将其列为二类动物疫病。自1886年苏格兰病理学家大卫·布鲁氏（DavidBruce）发现羊种布鲁氏菌病以来，现已在世界160多个国家存在人畜布病，分布于世界各大洲。根据以往发病情况，我国布病分布情况分三类—第一类严重流行区有新疆、内蒙古、西藏、黑龙江、吉林、宁夏、青海、河南；第二类一般分布区有陕西、甘肃、辽宁、广西、山西、河北、四川；第三类散发区有北京、天津、上海、浙江、安徽、福建、江西、湖北、湖南、广东、云南。近年布病疫情回升地区有辽宁、吉林、内蒙、黑龙江、山东、西藏、新疆等。总体上在我国的华北、东北、西北等地区是布病的多发区，其中羊种布氏菌是疫情回升流行的优势菌种。布鲁氏菌病潜伏期为7-60天，最长1年以上，自然发病多见于羊、牛、猪。病羊是主要传染源，其次是牛和猪。在我国该疾病的主要传染源为牛、羊、猪3种牲畜，其中以羊型布鲁氏杆菌对人体的传播性最强，致病率最高，危害最为严重。患病动物的血液、分泌物、子宫排泄物、流产胎儿、牛乳中均能排出高浓度的布鲁氏菌。一年四季均可发生，以产仔季节多发，牧区、农牧区家畜饲养密集区发病率较高。绵羊和山羊感染前期常不表现症状，首先发现的症状是流产，一般发生在妊娠后3-4个月。其他症状有乳房炎产生乳汁结块，关节炎引起的跛行，公羊表现睾丸炎、绵羊附睾炎。母牛以流产症状为主，常发生在妊娠后第6-8个月；公牛常见睾丸炎及附睾炎，膝关节关节炎导致关节肿胀。对本病不建议治疗，疫苗接种结合检疫净化是目前控制布病的有效措施，应以预防为主，采取检疫、免疫、淘汰患病动物等措施。在流行率较高的地区，要免疫、监测、隔离、净化同步推进。低感染率的地区或场群首要采取净化措施，通过监测和扑杀及时剔除阳性个体。布病检疫净化采用的检测技术要强调敏感性。目前，布病的检测方法主要用来进行疫病诊断、疫病动态监测及其流行情况的调查。近年畜间布病的高位流行势态和扩散态势，有必要利用快速、高效、敏感的检测手段来定位及预测布病的流行范围，实施有效的防控策略。因此建立布病的快速、高效、准确检测方法具有重要意义。在当前国内标准中，国标GB/T18646-2018推荐方法有虎红平板凝集试验（RBT）、乳牛全乳环状试验（MRT)、试管凝集试验（SAT）、补体结合试验（CFT）、间接酶联免疫吸附试验（iELISA)、竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）、多重聚合酶链式反应（Bruce-LadderPCR）、细菌染色镜检、分离培养、生化鉴定等。这些方法有点操作复杂，试验周期较长，不利于快速精准诊断；有的操作简单，但是敏感性上不去漏检或误检。因此建立快速简便、敏感性高、特异性强的布鲁氏菌荧光偏振抗体检测标准十分必要。布鲁氏菌荧光偏振抗体分析检测方法相较于细菌培养鉴别、PCR方法、ELISA方法、凝集试验等检测方法具有试验材料易获取，操作简便、省时快速、敏感性和特异性高、检测性能稳定等优势，尤其具备快速检测、结果判定更为简单的优点，使该方法在临床检测和疫苗免疫大面积抗体监测等方面具有重要价值，对布病的筛查及防控意义重大，鉴于上述现实问题，特制定本标准。本文件规定了布鲁氏菌荧光偏振抗体检测方法的范围、规范性引用文件、试剂与耗材、仪器与设备、操作步骤、结果分析与表述。本标准适用于光滑型布鲁氏菌抗体的检测。本文件实用、准确、敏感，具有十分重要的实际应用价值。将其在基层推广开来，有利于布病的快速、准确筛查，有利于行业发展。2.任务来源为建立布病的快速、高效、准确检测方法，2023年5月，甘肃省动物卫生标准化技术委员会向甘肃省市场监督管理局申报制定《布鲁氏菌荧光偏振抗体检测方法》地方标准，同年6月，该标准获批立项，被列入2023年第2批甘肃省地方标准制修订计划。（二）主要工作过程标准申报单位一直致力于布鲁氏菌病发生的病原学和血清学诊断技术研究、流行病学监测、疫情形势研判、防控技术研究等工作。为了完成该标准的编写，我们召集具有布鲁氏菌病诊断检测技术经验丰富的科研人员，共同组建了由专业技术人员组成的标准编写团队，查阅国内外相关资料，同时结合实验室已有的该病的诊断检测技术，按甘肃省地方标准管理办法和地方标准知识培训的相关内容进行编写，最终形成了该标准检测方法，按时上报给甘肃省动物卫生标准化技术委员会进行评审。主要经历了如下4个阶段：1.起草工作阶段：2020年9月标准起草工作组认真学习了GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》等相关内容，结合标准制定工作程序的各个环节，进行了深入探讨和研究。标准起草工作组经过技术咨询、调研，收集、整理和分析有关资料，并结合荧光偏振研制方法、技术路线、应用现状和发展趋势等，于2023年3月编写完成了地方标准《布鲁氏菌荧光偏振抗体检测方法》的草案稿。2.标准立项阶段：2023年6月9日，经甘肃省市场监督管理局审查，标准起草工作组起草的《布鲁氏菌荧光偏振抗体检测方法》通过标准立项。3.征求意见阶段：2023年7月～12月，起草工作组邀请来自于中国农业科学院兰州兽医研究所、甘肃农业大学、甘肃省畜牧兽医局、省内14个市（州）、10个县（区）动物疫病预防控制中心、兰州新区农林水务局、中农威特生物科技股份有限公司和萨福克养种植有限公司等3家企业的31位专家同行进行函审，共收到相关建议和意见36条。4.修改阶段：标准起草工作组按照专家对草案稿提出的所有意见和建议进行了认真分析、理解和总结，根据所提意见，对标准草案进行了认真修改。5.审查阶段：起草工作组对收集到的意见进行了认真分析和处理，采纳13条，对征求意见稿进行了修改，于2024年1月8日前形成征求意见稿，报甘肃省动物卫生标准化技术委员会审查。（三）主要参加单位本标准起草单位：甘肃省动物疫病预防控制中心、中国动物疫病预防控制中心、中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、中联瑞（北京）生物科技有限责任公司。（四）主要参加人员序号姓名单位职务/职称任务分工联系方式1曹丽萍甘肃省动物疫病预防控制中心正高级兽医师主持人139199527032孙雨中国动物疫病预防控制中心正高级兽医师标准撰写152014351913郑红飞甘肃省动物疫病预防控制中心高级兽医师推广应用152942029204蒋卉中国农业科学院北京畜牧兽医研究所正高级兽医师标准撰写150112169215王睿男中国动物疫病预防控制中心兽医师标准撰写135218144126孙航中国动物疫病预防控制中心兽医师标准撰写136930053237葛忠源中联瑞（北京）生物科技有限责任公司兽医师推广应用138105021688杨琪中联瑞（北京）生物科技有限责任公司兽医师标准撰写186012523669朱小青中联瑞（北京）生物科技有限责任公司兽医师标准撰写1861201151310陈莉丽中联瑞（北京）生物科技有限责任公司兽医师推广应用1312187281611庄园中联瑞（北京）生物科技有限责任公司兽医师推广应、标准编写原则和主要内容（一）标准编写原则本标准依据《中华人民共和国动物防疫法》的有关规定，在标准制定单位完成国家布鲁氏菌病流行病学紧急监测和常规监测、诊断和防控技术研究等一系列工作基础上，查阅有关文献资料，依据“统一性、协调性、适用性、一致性、规范性”的原则，按照先进性、科学性、合理性和可操作性的要求以及GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的规则编写了本标准。此外，本标准编写依照甘肃省地方标准管理办法中地方标准制修订工作应当遵循的原则进行。（二）主要内容本文件规定了布鲁氏菌荧光偏振抗体检测方法的适用范围、规范性引用文件、原理、术语和定义、试剂、设备与耗材、操作步骤、结果判定、附录。本文件适用于荧光偏振技术检测动物血清中的光滑型布鲁氏菌抗体。其中主要内容的解释和说明如下：标准名称：布鲁氏菌荧光偏振抗体检测方法。2.范围：本文件描述了应用荧光偏振技术检测布鲁氏菌抗体的方法。本文件适用于荧光偏振技术检测动物血清中的光滑型布鲁氏菌抗体，可以用于动态监测抗体消长变化，适用于未注射布鲁氏菌疫苗动物的检疫及评估养殖场布鲁氏菌疫苗免疫状况。3.规范性引用文件：本文件中引用和参考了最新版的国内标准、农业标准，以充分保证本标准条款的可依性和可行性。4.术语和定义：使用的术语和定义适用于本文件。5.原理：本文件描述了检测方法的原理。6.试剂：本文件描述了所需的试剂。7.设备与耗材：本文件描述了所需的仪器与设备。8.操作步骤：本文件规定了相关试验的具体操作步骤。9.结果判定：本文件规定了试验成立标准与结果判定标准。10.附录：本文件规定了相关试剂的制备方法与说明。三、主要验证情况和分析本单位对相关重要的试验项目进行了验证，验证结果来看，满足标准编写要求。（一）特异性指标验证1.阴性检出率检测布鲁氏菌抗体阴性血清60份，由中国动物疫病预防控制中心所采集提供，为田间未免疫布鲁氏菌疫苗的30只山羊，30头奶牛，用试管凝集试验、布病竞争ELISA和补体结合试验验证为阴性血清，其中表中血清编号1-30号为山羊血清，31-60号为奶牛血清。采用布鲁氏菌荧光偏振抗体检测方法检测上述60份阴性血清，并重复三次试验，并用竞争ELISA同时验证，检测结果显示布病FPA检测60份阴性血清检出率为98.33%，见表1。表1布鲁氏菌抗体阴性血清检测结果血清编号布病FPA抗体检测方法竞争ELISA试验第一次第二次第三次△mP值△mP值△mP值判定1-9.358-9.36-9.351—2-0.144-0.14-0.139—31.6831.6511.701—414.24113.91214.207—53.9543.8993.947—6-2.936-2.921-2.877—712.58712.38912.566—8-2.088-2.101-2.161—912.02112.12711.897—107.1517.2016.111—1116.38315.52316.413—128.468.5018.457—1320.05420.10120.066—1411.69911.66111.591—158.9218.9278.919—16-0.781-0.774-0.801—171.8841.8051.881—1811.18411.08510.982—196.2626.0616.251—2011.511.45411.506—2111.26311.0411.259—226.3216.3316.311—2312.60712.61112.583—247.2427.217.253—254.44.4134.382—26-0.537-0.531-0.544—27-2.19-2.091-2.111—287.8187.8037.779—296.8666.8516.861—309.4449.4519.437—319.1939.219.231—325.2585.2675.221—333.8583.8613.866—344.5944.6014.591—358.338.3168.329—367.4667.4297.464—378.0268.1218.033—382.0962.1282.031—396.6326.6286.599—407.6727.6497.701—4112.64112.59112.618—4215.5415.54115.558—432.5242.4832.479—442.452.4412.468—45-15.984-15.897-15.946—46-7.869-7.882-7.871—474.564.6084.611—482.9272.9112.898—497.5617.5467.607—508.9588.9478.96—516.8176.8116.815—52-0.921-0.911-0.943—533.2253.2183.221—54-2.304-2.273-2.3—5514.84514.82214.84—562.7932.7892.807—57-2.595-2.605-2.589—58-16.531-16.541-16.491—594.364.4084.367—60-11.269-11.301-11.287/NC0.1280.1210.125/NC0.1230.1190.12/NC0.1290.1250.127/PC92.53792.48692.501/注:1、FPA分析检测判定标准：△mP≥20为阳性，△mP＜20为阴性。2.交叉试验采用特异性质控血清5份，均为光滑型布鲁氏菌抗体阴性血清，分别是大肠杆菌O157阳性血清N1、耶尔森氏菌O9阳性血清N2、粗糙性布鲁氏菌M111阳性血清N3、布病阴性牛血清N4、布病阴性羊血清N5，均由中国兽医药品监察所制备、提供。将这5份血清用布病FPA分析检测方法重复三次检测，同时采用试管凝集进行平行实验，比较2种检测方法的特异性。结果全部为阴性，无特异性反应。数据见表2。表2特异性质控血清检测结果特异性质控血清布病FPA抗体检测方法竞争ELISA试验第一次第二次第三次判定△mP值△mP值△mP值N1-0.738-0.731-0.744—N2-1.624-1.618-1.62—N3-11.964-11.958-11.961—N4-0.625-0.631-0.627—N5-6.9-6.907-7.021—NC0.1240.1290.127/NC0.120.1220.119/NC0.1250.1210.123/PC92.54192.49792.548/注:1、FPA分析检测判定标准：△mP≥20为阳性，△mP＜20为阴性。（二）敏感性指标验证1.最小检出量试验本品系用布鲁氏菌荧光偏振试剂盒阴性对照血清将阳性对照血清（试管凝集效价为1:320）分别进行1:4（敏感性质控血清P1）、1:16（敏感性质控血清P2）、1:64（敏感性质控血清P3）、1:128（敏感性质控血清P4）稀释得到阳性质控血清P1-P4，采用FPA分析检测方法进行检测结果显示，三次重复试验数据一致，灵敏度均可达1:64。数据如见表3。表3布病敏感性质控血清检测结果敏感性质控血清布病FPA抗体检测方法第一次第二次第三次△mP值△mP值△mP值1﹕486.29286.31287.0021﹕1649.56950.12850.2311﹕6433.88634.08133.9041﹕12816.54116.5516.489NC0.1220.1250.127NC0.1250.1280.121NC0.1260.1290.124PC92.49892.48792.511注:1、FPA分析检测判定标准：△mP≥20为阳性，△mP＜20为阴性。2.阳性检出率试验经试管凝集试验、布病竞争ELISA和补体结合试验验证布病阳性血清60份，其中包括其中表中血清编号1-30号为山羊阳性血清，31-60号为奶牛阳性血清，由中国动物疫病预防控制中心制备、保存。采用布病FPA分析检测方法重复三次检测60份血清，并用试管凝集试验同时检测，检测结果显示布病FPA检测60份阳性血清检出率为98.33%，见表4。表4FPA法布病阳性血清重复检测结果血清编号布病FPA抗体检测方法竞争ELISA试验第一次第二次第三次△mP值△mP值△mP值判定121.22321.23121.218+225.62525.61125.627+321.87121.85121.863+427.56827.54827.565+530.80430.8130.785+696.03496.15696.21+792.65992.65192.711+893.15893.10793.218+9104.968104.853104.91+1092.47592.44892.501+1198.11698.10698.11+1294.35394.36194.375+1396.32796.25195.871+1498.50699.01298.482+1529.31730.12529.319+1654.60854.51555.162+1798.57597.81598.591+1899.357100.25199.421+1978.01778.10577.681+2021.13821.21120.876+2135.25835.35835.121+2233.85834.51233.77+2344.59443.85144.469+2498.3398.54198.477+2537.46636.95137.251+2626.0326.11325.775+2752.80952.90353.016+28109.093109.051108.899+2945.2945.41145.316+3028.14528.00127.881+3172.65372.26373.157+3214.38914.62113.897+3318.51218.45118.561+3421.44321.62121.453+3523.03523.11722.977+3622.72722.86122.717+3726.62626.60126.751+3822.62222.33222.562+3921.65422.15622.011+4071.77971.66171.752+4169.09869.10169.1+4273.28773.51173.302+4371.52670.95171.466+4471.08871.21771.118+4520.52420.65820.775+4622.4522.46122.399+4747.56147.53147.771+4838.95838.69838.558+4986.81786.11786.257+5029.26129.51229.751+5119.10719.11719.427+5266.66266.60567.014+5330.1130.41129.844+5423.12923.41523.169+5516.99417.09416.91+5623.11523.13329.915+5723.70823.61523.801+5822.0352245122.652+5933.32933.30133.251+6027.69227.62227.751/NC0.1270.1280.125/NC0.1240.1260.123/NC0.1220.1210.125/PC92.50892.49792.491/注:1、FPA分析检测判定标准：△mP≥20为阳性，△mP＜20为阴性。四、标准中涉及专利的情况说明无相关专利申报和授权情况。五、预期达到的社会效益、对行业发展的作用布病是在我国列为二类动物疫病，是严重危害人类健康的人畜共患病之一，是我国优先防治的病种。鉴于近年畜间布病的高位流行和扩散态势，建立布病荧光偏振的快速、高效、准确检测方法是必要的和亟需的，也是对布病防控具有重要意义的。当前布病防控采取疫苗预防和阳性剔除净化策略，发现病例，净化扑杀患病牛羊，遏制畜间传播，最大可能的减小经济损失。对本病的高危流行地区防控采用疫苗免疫预防，低风险区可采用阳性扑杀净化，而血清学抗体检测的荧光偏振方法以10分钟近100份样品的高通量、快速检测大大提高了畜群场全覆盖监测效率，极大程度的缩短了人与样品的暴露与接触时间，为早期防止人畜传播提供了保障，对公共卫生安全和社会效益是有重大意义的。布病荧光偏振抗体检测技术是布病快速监测、及时指导防控策略和保障畜群养殖业健康发展的有力手段。针对此情况，特制定此标准，应用此标准，对提高我国布病血清学抗体检测水平和该病的防控具有重要的现实意义。六、采用国际标准和国外先进标准情况，国内外关键指标对比分析目前，国际上针对布病的诊断试验标准有OIE陆生动物手册3.01.04，关于布病的诊断方法有细菌培养、荧光偏振试验、荧光PCR方法、普通PCR方法、玫瑰孟加拉试验、凝集试验、补体结合试验、间接ELISA、竞争ELISA。国内的标准为GB/T18646-2018动物布鲁氏菌