SN-T 5655.1-2023 商品化试剂盒检测方法 预包装食品致敏原免疫分析法 第1部分：麸质

学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载0ICS67.50学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载0CCSX04中华人民共和国出入境检验检疫行业标准1SN/T

5655.—20231商品化试剂盒检测方法预包装食品致敏原免疫分析法

1

:

i t tCommercalkitesi t tImmunoassayoffoodalergensinfoodstPar1:Glutent-

- -

--

- -

-中华人民共和国海关总署 发

布学ｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准兔兔ｗ下载学ｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准兔兔ｗ下载学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1SN/T5655.—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1前言本文件按照GB/T1.标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件为SN/T5655

《商品化试剂盒检测方法 预包装食品致敏原免疫分析法》的第1部分。SN/T5655已经发布了以下部分:———第1部分:麸质;———第2部分:甲壳纲类动物;———第3部分:蛋类;———第4部分:花生;———第5部分:大豆;———第6部分:乳;———第7部分:扁桃仁;———第8部分:腰果;———第9部分:榛子;———第10部分:巴西坚果;———第11部分:夏威夷果;———第12部分:开心果;———第13部分:胡桃。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国广州海关、中国海关科学技术研究中心。本文件主要起草人:刘津、高东微、曾静、梁颖婕、董洁、张海燕。学ｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准兔兔ｗ下载学ｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准兔兔ｗ下载学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1SN/T5655.—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1引 言食品致敏原是普通食品中正常存在的天然或人工添加物质,被过敏体质人群消耗后能够诱发过敏反应。SN/T5655《商品化试剂盒检测方法 预包装食品致敏原免疫分析法》规定了预包装食品中致敏原成分的酶联免疫吸附定量检测和胶体金免疫层析定性检测方法,旨在满足预包装食品致敏原标识、生产质控和食品安全检验监管的检测需求。SN/T5655《商品化试剂盒检测方法 预包装食品致敏原免疫分析法》拟由下列13个部分构成。———第1部分:麸质。———第2部分:甲壳纲类动物。———第3部分:蛋类。———第4部分:花生。———第5部分:大豆。———第6部分:乳。———第7部分:扁桃仁。———第8部分:腰果。———第9部分:榛子。———第10部分:巴西坚果。———第11部分:夏威夷果。———第12部分:开心果。———第13部分:胡桃。学ｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准兔兔ｗ下载学ｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准兔兔ｗ下载学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1SN/T5655.—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1商品化试剂盒检测方法 预包装食品致敏原免疫分析法第1部分:麸质1

范围本文件规定了预包装食品中麸质致敏原的酶联免疫吸附分析和胶体金免疫层析检测方法。第一法夹心酶联免疫吸附法适用于未经发酵或水解的预包装食品中麸质致敏原成分的定量检测。第二法竞争酶联免疫吸附法适用于经过发酵或水解的预包装食品中麸质致敏原成分的定量检测。第三法胶体金免疫层析法适用于预包装食品中麸质致敏原的定性检测,也适用于预包装食品生产过程中为监控麸质致敏原目的对生产原料和环境采样的定性检测。2

规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682

分析实验室用水规格和试验方法l i i iii i

i i

itiAOACl i i iii i

i i

itiAnalyss.AppendixM

:ValdatonproceduresforquanttatvefoodalergenELISA

methods:com-muniyguidanceandbestpractces3

术语和定义下列术语和定义适用于本文件。13.1e麸质

glutne小麦、黑麦、大麦、燕麦等粮谷或其杂交品种籽粒中主要的贮藏蛋白,可引起敏感人群不耐受反应,5约占总蛋白含量80%,不溶于水和0.

mol/L的

NaCl水溶液。523.233.3

醇溶蛋白

prolamins属于粮谷籽粒中的贮藏蛋白,约占麸质50%,溶于40%~70%乙醇溶液。i小麦醇溶蛋白

gladini小麦籽粒中的醇溶蛋白。43.4tR5方法

R5mehodt国际标准CODEXSTAN118中规定进行麸质定量检测采用的方法,该方法使用的R5单克隆抗体是一种可特异性结合各种粮谷籽粒的醇溶蛋白的单克隆抗体,对醇溶蛋白中抗原决定基的5个特定氨基酸残基片段高效识别。1学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载15SN/T5655.—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载153.-i E酶联免疫吸附测定

enzymelnkedimmunosorbent-i E可溶性抗原或抗体结合到微孔板等固相载体上,基于免疫反应和酶催化显色的一种定性或定量检测方法。63.6

G胶体金免疫层析

coloidalgoldassay;ICAG以胶体金作为示踪标志物的一种免疫层析检测技术。注:通常为试纸条形式。第一法

夹心酶联免疫吸附法4

原理利用抗原-抗体特异性结合反应,对样品中醇溶蛋白含量进行酶联免疫吸附测定。适用于各种未经发酵的食品原料和加工食品。样品中游离的醇溶蛋白和微孔中预先包被的

R5单克隆抗体结合,形成抗原-抗体复合物,洗板后加入酶标记R5单克隆抗体,形成酶标记抗体-抗原-抗体夹心复合物。再次洗板后,加入底物和发色剂呈显色反应。通过测定450nm

波长下吸光度值得出样品中醇溶蛋白含量,样品中醇溶蛋白含量与吸光度值成正比。样品中麸质的含量与醇溶蛋白含量约为两倍关系。5

试剂和材料除特别说明外,实验用水应符合

GB/T6682的三级水,所有试剂均为分析纯。1 iiii i i

ii

i ti5. 醇溶蛋白夹心酶联免疫吸附检测试剂盒:1 iiii i i

ii

i tiStudyProcedurestoValdateCharacterstcsofaMethodofAnalyssAppendixM:Valdatonproce-duresforquanttatvefoodalergenELISA

methods:communiyguidanceandbestpractces进行评价,评价结果见附录

A。注:试剂盒详细信息见附录B。 i235. Cocktal提取缓冲液,见附录 i235. 脱脂奶粉(不含醇溶蛋白)。455.

80%乙醇溶液:量取80mL无水乙醇与20mL水混合。455.

60%乙醇溶液:量取60mL无水乙醇与40mL水混合。 160 1 0 155.

1×稀释缓冲液:按照1∶5比例稀释5×稀释缓冲液浓缩液[见

B.

c)],现配现用 160 1 0 151.

mL5×

稀释缓冲液浓缩液[见

B.

c)]至4.

mL

水中稀释混匀。一般情况下,

个样品需约1.

mL1×稀释缓冲液。 172 15.

1×洗涤缓冲液:按照1∶10比例稀释10×洗涤缓冲液浓缩液[见B.d)], 172 1液可贮室温(0℃~25

℃)下保存4周。如移取10.

mL10×洗涤缓冲液浓缩液[见

B.

d)]至90.

mL水中稀释混匀。1条微孔需约15mL1×洗涤缓冲液洗涤。 1815.

1×酶标记物:用水按照1∶11比例稀释11×酶标记物浓缩液[见

B.

b)],现配现用。如移 181100μL11×酶标记物浓缩液[见B.b)]至1mL水中稀释混匀,足够1条微孔反应用。6

仪器和设备16.酶标仪:具450nm

波长。12学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1SN/T5655.—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1236. 分析天平:感量0.1g。236. 涡旋混匀仪。46. 微孔板振荡器。45 2 1637 36 185 2 1637 36 186. 八道移液器:0μL~300μL。6.

水浴锅:7℃,0℃,00℃。6. 离心机:转速≥4000r/min。7

分析步骤17.样品的制备1117.. 样品的准备113 5固态类样品应粉碎、研磨、过筛(筛板孔径0.

mm~0.

mm);半固态食品样品应匀浆混匀;液3 5样品应振摇混合均匀。127.. 样品的提取和稀释12121 2 57... 液态一般食品样品(不含单宁和多酚):吸取0.5mL均质后的液态样品中加入121 2 5i( 5Cocktal提取缓冲液

5.2),密闭上容器并充分混合。按照i( 5122 25 i (57... 固态和半固态一般样品(不包括燕麦样品;不含单宁和多酚122 25 i (5固体态样品中加入2.

mLCocktal提取缓冲液

5.2),密闭上容器并充分混合(对于肉类和香肠样品,应取50g以上样品均质后再进行称样)。按照7.1.2.

进一步处理样品。123 22 ( 5 i (7... 含有单宁和多酚的食品样品(如巧克力、咖啡、可可123 22 ( 5 i (g均质后的样品,加入0.5g脱脂奶粉

5.3)和2.

mLCocktal提取缓冲液

5.2),密闭容器并充分混5合。按照7.1.2.

继续处理。5124 0 i7... 燕麦样品:取200g燕麦样品进行均质,称取1.0g均质后的样品,加入10124 0 i( 5缓冲液

5.2),密闭上容器并充分混合。按照7.1.2.

( 5125 1、 45 ( 22( 57... 将经过7.1.2.

7.1.2.2、7.1.2.3、7.1.2.

处理后的样品于50℃水浴125 1、 45 ( 22( 5样品,加入7.

mL80%乙醇溶液

5.4)(针对燕麦样品加入30mL80%乙醇溶液)。在室温条件下(0℃~25℃)上下颠倒/旋转振荡1h。室温(0℃~25℃)下4000r/min离心10min或过滤,收集上清液或滤液。将上清液或滤液用1×稀释缓冲液

5.6)按比例1∶12.(如移取80μL滤液/提取物上清液到920μL1×稀释缓冲液中稀释混匀)继续稀释。至此样品的稀释倍数累计为500倍。27. 测定221 17.. 将预先包被有R5单克隆抗体的微孔板[见B.a)]插入微孔板架并做好标记21 1设置双平行,微孔数量为标准品和样品数量的2倍。22 1 2(( 2(11 21 37.. 平行加入100μL标准品1~6[见

B.

e)~j)]和样品至微孔中,室温(022 1 2(( 2(11 21 330min。孵育结束后,倒去微孔中的液体,每个微孔每次加入250μL1×洗涤缓冲液

5.7)洗涤并在吸水纸上拍干,洗板3次。洗板结束后,加入100μL1×酶标记物

5.8)至每个微孔,室温(0℃~25℃)孵育30min。孵育结束后,倒去微孔中的液体,每个微孔每次加入250μL1×洗涤缓冲液

5.7)洗涤并在吸水纸上拍干,洗板3次。洗板结束后,每个微孔分别加入50μL底物[见B.

k)]和50μL发色剂[见B.l)],轻轻地水平摇动微孔板使其均匀混合,室温(0℃~25℃)暗处避光孵育30min。孵育结束后,加入100μL终止液[见B.

m)]至每个微孔,轻轻地水平摇动微孔板使其反应完全,0min之内3ｚｆ兔ｗｗｗ．ｂｘｗ．ｃ学兔ｏｍ标准下载

m ×1000×f

×Vｚｆ兔ｗｗｗ．ｂｘｗ．ｃ学兔ｏｍ标准下载

m ×1000×f

×V …………(1)1读取450nm

波长下吸光度值。37. 标准曲线制作和测定结果计算3以标准品2~6质量浓度为横坐标,以实验中的双平行标准品的平均吸光度值为纵坐标,绘制半对数曲线,计算样品液中醇溶蛋白浓度(C)。也可使用试剂盒配套分析软件

RIDASOFT

Win中cubiisplne模式进行标准曲线绘制和测定结果计算。i8

分析结果描述18.结果分析11固体样品中醇溶蛋白含量按公式()计算:1XS= cS式中:nXS ———样品中醇溶蛋白含量,单位为毫克每千克(mg/kg);ncS ———样品液中醇溶蛋白浓度,单位为纳克每毫升(g/mL);f ———样品稀释倍数;2V ———定容体积,除燕麦外的样品为10mL,燕麦样品为40mL;2m ———样品的质量,除燕麦外的样品为0.5g,燕麦样品为1g;1000

———单位换算系数。5 5样品稀释倍数f

为7.1.2.

中使用1×稀释缓冲液稀释上清液或滤液的稀释倍数12.

倍5 5稀释步骤外还有进一步稀释,也要考虑进去。计算结果保留小数点后两位有效数字。2液体样品中的醇溶蛋白含量按公式()计算:2lXl=c

×f/1000 …………(2)l式中:l nXl ———样品中醇溶蛋白含量,l nc ———样品液中醇溶蛋白浓度,单位为纳克每毫升(g/mL);f ———样品稀释倍数;1000

———单位换算系数。按照本文件方法处理样品稀释倍数f

为500倍,若除500倍稀释外,还有进一步稀释,也要考虑进去。计算结果保留小数点后两位有效数字。3样品中麸质含量按公式()计算3Y=X×2 …………(3)式中:Y

———样品中麸质含量。固体样品单位为:毫克每千克(mg/kg);液体样品单位为:毫克每升(mg/L)。X———样品中醇溶蛋白含量。固体样品代入Xs,单位为毫克每千克(mg/kg);液体样品代入Xl,单位为毫克每升(mg/L)。食品加工工艺对样品中醇溶蛋白含量,以及醇溶蛋白与麸质含量的比例关系和换算系数有重要影响。一般情况下食品原料和食品中醇溶蛋白约占麸质50%,换算系数为2。某些食品加工工艺会显著改变比例关系。进行麸质含量换算时,充分评估食品加工工艺对换算系数的影响。计算结果保留小数点后两位有效数字。4．ｂ学兔兔ｗｗｗｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1SN/T5655.—2023．ｂ学兔兔ｗｗｗｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载128. 结果表述2麸质测定结果用于标签标识管理。麸质测定结果小于定量限时,结果表述为“未检出麸质致敏原”;麸质测定结果大于定量限时,结果表述为“检出麸质致敏原”并报告具体测定值。9

质量控制19. 试剂失效1出现以下情况之一表明试剂失效,不应进行测定或测定结果作废:a)

贮存在试剂瓶中的发色剂颜色出现蓝色;8 8b)

加入终止液后标准品6(0ng/mL)吸光度值8 829. 变异系数2在重复性条件下获得的两次独立测定结果的变异系数不应超过10%。10

检出限和定量限5 5本方法对醇溶蛋白的检出限为0.0mg/kg(L),定量限为2.0mg/kg(L)。对麸质的检出限5 50L 0 L1.0mg/kg(

),定量限为0L 0 L11

防污染措施12 (11. 食品样品的均质可能产生粉尘,12 (11. 设备和器具用水冲洗后,用60%乙醇溶液

5.5)彻底清洁,以消除谷物粉尘污染。311. 在试验过程中应戴手套操作。在称量、均质样品、样品提取及试剂盒检测四个检测阶段更换3手套。第二法竞争酶联免疫吸附法12

原理利用抗原-抗体特异性结合反应,对样品中醇溶蛋白含量进行酶联免疫吸附测定。适用于经过发酵或水解加工的食品原料和加工食品。样品中游离的水解醇溶蛋白与微孔中预先包被的醇溶蛋白竞争结合酶标记的R5单克隆抗体。洗板后,加入的底物和发色剂呈显色反应。通过测定450nm

波长下吸光度值得出样品中醇溶蛋白含量。样品中醇溶蛋白含量与吸光度值成反比。样品中麸质的含量与醇溶蛋白含量约为两倍关系。13

试剂和材料除特别说明外,实验用水应符合

GB/T6682的三级水,所有试剂均为分析纯。1 lii ii ii

ii

i1 lii ii ii

ii

i t iProcedurestoValdateCharacterstcsofaMethodofAnalyssAppendixM:ValdatonproceduresforquanttatvefoodalergenELISA

methods:communiyguidanceandbestpractces进行评价,评价结5学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1SN/T5655.—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1果见附录D。注:试剂盒详细信息见附录E。2313.

60%乙醇溶液:量取60mL无水乙醇与40mL水混合。2313. 鱼明胶:来源于冷水鱼类的皮肤,含量40%~50%。413.

1mol/L氢氧化钠(NaOH):称取40.0gNaOH,加水溶解并定容至1L。4 150 1 0 113.

1×稀释缓冲液:按照1∶5比例稀释试剂盒中5×稀释缓冲液浓缩液[见 150 1 0 1移取1.

mL5×稀释缓冲液浓缩液[见E.c)]至4.

mL水中稀释混匀。一般情况下,

个样品需约01.

mL1×稀释缓冲液。0 162113.

1×洗涤缓冲液:按照1∶10比例稀释试剂盒中10×洗涤缓冲液浓缩液[见E.

1621×洗涤缓冲液可贮室温(0℃~25℃)下保存4周。如移取10.

mL10×洗涤缓冲液浓缩液[见E.d)]至90.

mL水中稀释混匀。1条微孔需约8mL1×洗涤缓冲液洗涤。 1718 1 /1 1

4 5213.

1×酶标记物:用水按照1∶11比例稀释试剂盒中11×酶标记物浓缩液[见 1718 1 /1 1

4 52如移取100μL11×酶标记物浓缩液[见E.b)]至1mL水中稀释混匀,足够2条微孔反应用。13. 富含多酚的发酵食品提取试剂(0%鱼明胶60%乙醇溶液):在30mL水中加入10g鱼明胶(3.)并充分搅拌,再加入60mL无水乙醇,混匀后用1molL氢氧化钠(3.)调节pH

为8.,再补水至体积为100mL。配制好的提取试剂可贮室温(0℃~25℃)下保存2周。使用前先搅拌均匀再取用。14

仪器和设备同第6章。15

分析步骤115. 样品前处理和提取111 01

2 515.. 不含多酚类物质的固体食品样品:对不少于50g样品进行充分均质。称取1.0g11 01

2 550mL

离心管中。加入10mL60%乙醇溶液(3.)。按照15.1.

进行下一步的处理。121

8515.. 含有多酚类物质的固体食品样品:对不少于50g样品进行充分均质。称取1mL

样121

8550mL离心管中。加入10mL富含多酚的发酵食品提取试剂(3.)。按照15.1.

进行下一步的处理。1315..除啤酒外的液体食品样品:对不少于50mL样品进行充分均质。吸取1mL样品到50mL离131

25心管中。加入9mL60%乙醇溶液(3.)。按照15.1

251415.. 啤酒:对不少于50mL样品进行充分均质。吸取1mL样品到50mL离心管中。加入9mL141

85富含多酚的发酵食品提取试剂(3.)。按照15.1

8515 1 1421

515.. 将15.1.1、5.1.2、5.1.3、5.1.

处理后的样品涡旋混匀至少30s,上下颠倒15 1 1421

510min,室温(0℃~25℃)下4000r/min离心10min,取上清液用于检测。必要时可用滤纸过滤上清液,进一步得到滤清液用于检测。将滤液或上清液用1×稀释缓冲液(3.)按比例

1∶50(如移取20μL滤液/提取物上清液到980μL1×稀释缓冲液中稀释混匀)继续稀释,得到用于测定的样品液。至此样品的稀释倍数累计为500倍。2注:上清液或滤清液在密闭良好的容器中室温(0℃~25℃)黑暗处避光保存4周。2215. 测定221 115..将预先包被有醇溶蛋白的微孔板[见E.a)]插入微孔板架并做好标记21 16．ｂｚｆ学兔兔ｗｗｗｘｗ．ｃｏｍ标准下载

B0×100% …………(4．ｂｚｆ学兔兔ｗｗｗｘｗ．ｃｏｍ标准下载

B0×100% …………(4)

m ×1000×f

×V …………(5)1和样品,均设置双平行。22 11 21

61 2115.. 平行加入50μL标准品1~5[见

E.

e)~i)]和样品至微孔,再加入50μL1×22 11 21

61 21(4.1.4),轻轻地水平摇动微孔板使其均匀混合,室温(0℃~25℃)孵育30min。孵育结束后,倒去微孔中的液体,每个微孔每次加入250μL1×洗涤缓冲液(3.)洗涤并在吸水纸上拍干,洗板3次。洗板结束后,加入100μL底物/发色剂[见E.j)]至每个微孔,室温(0℃~25℃)暗处孵育10min。孵育结束后,加入100μL终止液[见E.k)]至每个微孔,轻轻地水平摇动微孔板使其反应完全,并立即读取450nm

波长下吸光度值。315. 标准曲线制作和测定结果计算34以标准品2~5质量浓度为横坐标,以公式()计算的百分比为纵坐标,绘制半对数曲线,计算样品4c液中醇溶蛋白浓度()。c16

分析结果描述116. 结果分析14醇溶蛋白标准品和样品液的百分比吸光度值按公式()计算:4A=

B式中:A

———百分比吸光度值;B

———醇溶蛋白标准品或样品液的平均吸光度值;B0

———标准品1的平均吸光度值。i也可使用试剂盒配套分析软件RIDASOFT

Win中cubisplne模式进行标准曲线绘制和测定结i果计算。5固体样品中醇溶蛋白含量按公式()计算:5sXs= cs式中:nXS ———样品中醇溶蛋白含量,单位为毫克每千克(mg/kg);ncS ———样品液中醇溶蛋白浓度,单位为纳克每毫升(g/mL);f ———样品稀释倍数;V ———定容体积为10mL;gm ———样品的质量,单位为克();g1000———单位换算系数。样品稀释倍数f

为使用1×稀释缓冲液稀释上清液或滤液的稀释倍数50倍,若除此稀释步骤外还有进一步稀释,也要考虑进去。6液体样品中的醇溶蛋白含量按公式()计算:6lXl=c

×f/1000 …………(6)l式中:l nXl ———样品中醇溶蛋白含量,l nc ———样品液中醇溶蛋白浓度,单位为纳克每毫升(g/mL);f ———样品稀释倍数;1000

———单位换算系数。7兔兔ｗｗｗ．ｂ学ｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1SN/T5655.—2023兔兔ｗｗｗ．ｂ学ｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载17按照本文件方法处理样品稀释倍数为500倍,若除500倍稀释外,还有进一步稀释,也要考虑进去。7样品中麸质含量按公式()计算:Y=X×2 …………(7)式中:Y

———样品中麸质含量,单位为毫克每千克(mg/kg)或毫克每升(mg/L)。X———样品中醇溶蛋白含量。固体样品代入XS,单位为毫克每千克(mg/kg);液体样品代入Xl,单位为毫克每升(mg/L)。食品加工工艺对样品中醇溶蛋白含量、以及醇溶蛋白与麸质含量的比例关系和换算系数有重要影响。一般情况下食品原料和食品中醇溶蛋白约占麸质50%,换算系数为2。某些食品加工工艺会显著改变比例关系。进行麸质含量换算时,充分评估食品加工工艺对换算系数的影响。计算保留小数点后22位有效数字。216. 结果表述麸质测定结果用于标签标识管理。麸质测定结果小于定量限时,结果表述为“未检出麸质致敏原”;麸质测定结果大于定量限时,结果表述为“检出麸质致敏原”并报告具体测定值。17

质量控制117.试剂失效1出现以下情况之一表明试剂失效,不应进行测定或测定结果作废:a)

贮存在试剂瓶中的发色剂颜色出现蓝色;0 8b)

加入终止液后标准品1(

ng/mL)吸光度值0 8217. 变异系数2在重复性条件下获得的两次独立测定结果的变异系数不应超过10%。18

检出限和定量限3 L 0 L本方法对醇溶蛋白的检出限为2.0mg/kg(

),定量限为5.3 L 0 L60mg/kg(L),定量限为10.0mg/kg(L)。19

防污染措施同第11章。第三法 胶体金免疫层析法20

原理利用抗原-抗体特异性结合反应,对样品中醇溶蛋白进行胶体金免疫层析试纸条检测。样品中的醇溶蛋白与包被固定在试纸条上的R5单克隆抗体、红色胶体金颗粒交联的

R5单克隆抗体,形成夹心复合物并在检测区显色,通过目测判读检测结果。样品中醇溶蛋白的含量和检测带的颜色成正比。样品中麸质的含量与醇溶蛋白含量约为两倍关系。8学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1SN/T5655.—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载121

试剂和材料除特别说明外,实验用水应符合

GB/T6682的三级水,所有试剂均为分析纯。1 l iiii i i

ii

i t i21. 醇溶蛋白胶体金免疫层析检测试剂盒1 l iiii i i

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i t iProcedurestoValdateCharacterstcsofaMethodofAnalyssAppendixM:ValdatonproceduresforquanttatvefoodalergenELISA

methods:communiyguidanceandbestpractces进行评价,评价结果见附录F。注:试剂盒详细信息见附录

G。 i2321. Cocktal提取缓冲液,见附录 i2321.

脱脂奶粉(不含醇溶蛋白)。4521.

60%乙醇溶液:量取60mL无水乙醇与40mL水混合。4521.

80%乙醇溶液:量取80mL无水乙醇与20mL水混合。6 4 3721.

1mol/L氢氧化钠(NaOH):称取40.0gNaOH,6 4 3721.

1mol/L盐酸(HCl):取8.

mL浓盐酸(7%),用水定容至100mL。22

仪器和设备1222. 分析天平:感量0.1g。1222. 匀浆机。322. 涡旋混匀仪。3422. 离心机:转速≥4000r/min。45 1 522. 单道移液器:00μL~1000μL,5 1 523

分析步骤123. 环境拭子的采样及测定111 1 123.. 使用一次性滴管[见

G.d)]吸取500μL样品稀释缓冲液[见

G.

11 1 11G.c)]中。112 11323..用干燥的试纸条[见

G.a)]下端的反应区充分擦拭10cm×10cm

12 11323.. 按照箭头指定方向将试纸条插入试管并静置5min±10s,试纸条浸入液体的高度不应超过最大刻度。14 1223.. 取出试纸条,对照结果比对卡[见

G.e)],14 1223. 清洁用水的采样及测定21 11 123.. 不含有洗涤剂的清洁用水:使用一次性滴管[见

G.

d)]吸取250μL样品稀释缓冲21 11 1G.b)]至一次性试管[见

G.

c)]中,再吸取250μL待测清洁用水样品到试管中,均匀混合,按照3 423.1.

和23.1.

3 42211 123.. 含有洗涤剂的清洁用水:使用一次性滴管[见

G.

d)]吸取500μL

样品稀释缓冲2211 1G.b)]至一次性试管[见

G.

c)]中,再吸取50μL

待测清洁用水样品到试管中,均匀混合,按照3423.1.

和23.1.

34注:含有次氯酸盐的清洁用水不适用于本文件。9学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1SN/T5655.—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载133123. 食品样品的制备及测定33123..食品样品的准备3 5固态类样品应粉碎、研磨、过筛(筛板孔径0.

mm~0.

mm);半固态食品样品应匀浆混匀;液3 5样品应振摇混合均匀。3223.. 未经加工的食品原料的提取323210 2

3 2

4 323... 液体样品:吸取13210 2

3 2

4 3酚物质,应加入1.0g脱脂奶粉(1.)。加入9mL60%乙醇溶液(1.),按照23.3.2.

进行下一步处理。322 00 2

3 2

4 323... 固体样品:322 00 2

3 2

4 3单宁或多酚物质,加入1.g脱脂奶粉(1.)。加入10mL60%乙醇溶液(1.)。按照23.3.2.

进行下一步处理。323 1 2 /2

6 2

7 523... 将经过23.3.2.

323 1 2 /2

6 2

7 525℃

)下4000r/min离心10min或过滤,取上清液或滤液用于检测。强酸性或强碱性样品可使用1mol/LNaOH(1.)或1molLHCl(1.)调节pH

值至7.0±0.

后再检测。3323.. 加工过的食品原料和食品的提取33331 2 5 i23... 不含单宁和多酚的液态样品:吸取0.5mL均质后的液态样品中加入331 2 5 i2

25取缓冲液(1.),密闭上容器并充分混合。按照23.2

25332 25 i 2

2523... 固态和半固态一般样品(不包括燕麦样品;不含单宁和多酚):称取0.5g均质后332 25 i 2

25半固体态样品中加入2.

mLCocktal提取缓冲液(1.),密闭上容器并充分混合(对于肉类和香肠样品,应取50g以上样品均质后再进行称样)。按照23.3.3.

进行下一步处理。3332 2 2

3 5 i 2

223... 含有单宁和多酚的食品样品(如巧克力、咖啡、可可、板栗粉、荞麦、小3332 2 2

3 5 i 2

20.5g均质后的样品,加入0.5g脱脂奶粉(1.)和2.

mLCocktal提取缓冲液(1.),密闭容器并5充分混合。按照23.3.3.

进行下一步处理。5334 0 i23... 燕麦样品:取200g燕麦样品进行均质,称取1.0g均质后的样品,加入10334 0 i2

2 5取缓冲液(1.),密闭上容器并充分混合。按照23.2

2 5335 12 22 2 45 2

52 223... 将经过23.3.3.、3.3.3.、3.3.3.、3.3.3.

处理后的样品于50335 12 22 2 45 2

52 2冷却样品,加入7.

mL80%乙醇溶液(1.)(针对燕麦样品加入30ml80%的乙醇)。在室温条件下(0℃~25℃)上下颠倒/旋转振荡1h。室温(0℃~25℃)下4000r/min离心10min或过滤,收集上清液或滤清液进行检测。2注:密封好的上清液或滤清液在室温(0℃~25℃)黑暗处避光保存4周。23423.. 食品样品的测定341 1 13 5 3 4使用一次性滴管[见

G.d)]吸取500μL样品稀释缓冲液[见

G.

b)]至一次性1 1 13 5 3 4中,取50μL从23.3.2.

及23.3.3.

得到的上清液或滤液到试管中,按照23.1.

和23.1.

进行检测。24

测定结果评估和表述124. 试纸条反应区包括2条结果条带,从上至下分别为质控带(C)和检测带(T)。当出现蓝色质控带110学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载26. 本方法对醇溶蛋白的检出限为:环境拭子1.

μg/100cm学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载26. 本方法对醇溶蛋白的检出限为:环境拭子1.

μg/100cm

,不含有洗涤剂的清洁用水5ng/mL,26. 本方法对麸质的检出限为:环境拭子3.

μg/100cm

,不含有洗涤剂的清洁用水10ng/mL,含1C(

),检测结果有效,否则检测结果无效。C2 C24. 试纸条同时出现蓝色质控带(

)和红色检测带(T),检测结果为阳性,结果表述为2 C原”。3 C24. 试纸条只出现蓝色质控带(

),未出现红色检测带(T),检测结果为阴性,结果表述为“未检出3 C质致敏原”。25

质量控制125.试剂失效1试纸条检测结果中既没有蓝色色带也没有红色色带,检测结果无效。225. 内部质控2定期或必要时使用商品化加工食品醇溶蛋白质控物或实验室自行制备的人工添加样品进行质量控制。26

检出限22 L含有洗涤剂的清洁用水50ng/mL,未经加工的食品原料2.

mg/kg(L),加工过的食品原料和2 L品3.

mg/kg(

)。24 L有洗涤剂的清洁用水100ng/mL,未经加工的食品原料4.4

mg/kg(L),加工过的食品原料和4 L品6.

mg/kg(

)。27

方法局限性次氯酸盐可令样品中的麸质迅速地被氧化破坏,无法检测含有次氯酸盐的清洁水样品。因此本文件的麸质快速检测条无法检测这种情况下可能残留的麸质片段。28

防污染措施同第11章。11学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1SN/T5655.—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1附 录

A(资料性)醇溶蛋白夹心酶联免疫吸附检测试剂盒评价结果1)1A. 线性和范围10线性范围为5.0mg/kg~80.0mg/kg麸质。02A. 检出限和定量限25 5 L 0对醇溶蛋白的检出限为0.0mg/kg(L),定量限为2.0mg/kg(5 5 L 00kg(L),定量限为5.0mg/kg(L)。03A. 正确度3对人工加标的烘焙面包基质回收率范围为99.4%~112.6%,对未经热加工的人工加标的玉米粉基质回收率范围为93.5%~96.0%,对经过热加工的人工加标的玉米粉基质回收率范围为88.5%~109%,对未经热加工及经过热加工的人工加标的大米粉基质回收率范围为91.5%~100.5%,对未经热加工的人工加标的香肠基质回收率为96.0%~112.5%,对经过热加工的人工加标的香肠基质回收率为93.0%~107.0%。4A. 特异性4对粮谷类、豆类、甲壳类动物、肉类、坚果类、香料、水果及果汁、奶类、食品添加剂等88种食品样品交叉反应率为0。5A. 精密度5对无麸质饼干、玉米零食点心、大米粉、燕麦粉、饼干、香肠、玉米粉、荞麦粉、大豆粉、面包进行不同浓度的人工加标,变异系数范围为5.4%~9.7%,平均值为7.5%,回收率范围为90.5%~13.0%,回收率平均值为102.8%。11)

本评价结果仅适用于rbiopharm

RIDASCREEN

Gladin试剂盒。给出这一信息是为了方便本文件的使用者。如果采用其他产品可以得到相同或更好的检测效果,经实验评估后可以使用这些等效产品。12学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1SN/T5655.—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1附 录 B(规范性)醇溶蛋白夹心酶联免疫吸附检测试剂盒2)1B. 试剂盒组成1::

261a)

预包被醇溶蛋白R5抗体的96孔可拆分微孔板

8×12::

261b)

11×酶标记物浓缩液

1.

mL/瓶×1瓶;c)

5×稀释缓冲液浓缩液:0mL/瓶×1瓶;d)

10×洗涤缓冲液浓缩液:00mL/瓶×1瓶;S 3S 3S 3S 3S 3S 3e)

标准品1(S 3S 3S 3S 3S 3S 3f)

标准品2(td2):1.

mL/瓶×1瓶,醇溶蛋白含量为5ng/mL;g)

标准品3(td3):1.

mL/瓶×1瓶,醇溶蛋白含量为10ng/mL;h)

标准品4(td4):1.

mL/瓶×1瓶,醇溶蛋白含量为20ng/mL;i)

标准品5(td5):1.

mL/瓶×1瓶,醇溶蛋白含量为40ng/mL;j)

标准品6(td6):1.

mL/瓶×1瓶,醇溶蛋白含量为80ng/mL;771k)

底物:

mL/瓶×1瓶;771l)

发色剂:

mL/瓶×1瓶;m)

终止液:4mL/瓶×1瓶。2B. 试剂盒验收和保存22122223243B.. 每个批号试剂盒应进行回收率测试的验收试验,2122223243B.. 试剂盒于2℃~8℃避光保存,使用前回复至室温(0℃~25℃)。B.. 不同批号试剂盒中组分不应混用。B.. 超过有效期的试剂盒不应使用。B. 试剂盒评估31B.. 定期进行回收率评估,回收率应在80%~120%之间。31324B.. 回收率评估可使用商品化加工的食品醇溶蛋白质控物或实验室自行制备的人工添加样品。324B. 标准曲线谱图1标准曲线谱图示例见图B.。12)

2)

rbipharmRIDASCREEN

Gladin试剂盒是适合的市售产品实例。给出这一信息是为了方便本文件的使用者。如果采用其他产品可以得到相同或更好的检测效果,经实验评估后可以使用这些等效产品。13学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1SN/T5655.—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载11图B. 标准曲线谱图示例114学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1SN/T5655.—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1附 录 C(规范性)lCocktai

提取缓冲液3)l1C. 试剂描述1iCocktal提取缓冲液是R5Mendez方法配套的麸质检测样品提取缓冲液,用于提取加工过的食品i样品中的醇溶蛋白。2C. 试剂安全2i iCocktal提取缓冲液中含有氯胍和巯基乙醇,宜在通风橱内使用Cocktal提取缓冲液i i肤直接接触。-

o i3)

rbipharmCocktalpatented提取缓冲液试剂盒是适合的市售产品实例。给出这一信息是为了方便本文-

o i使用者。如果采用其他产品可以得到相同或更好的检测效果,经实验评估后可以使用这些等效产品。15学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1SN/T5655.—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1附 录

D(资料性)醇溶蛋白竞争酶联免疫吸附检测试剂盒评价结果4)1D. 线性和范围1线性范围为10.0mg/kg~270.0mg/kg麸质。2D. 检出限和定量限23 0 L 6对醇溶蛋白的检出限为2.0mg/kg(L),定量限为5.0mg/kg(3 0 L 6Lkg(L),定量限为10.0mg/kg(

)L3D. 正确度3对人工加标的无麸质啤酒基质回收率范围为81.0%~134.0%,对人工加标的大米啤酒基质回收率范围为120.4%~132.7%,对人工加标的玉米粉基质回收率范围为88.0%~118.5%,对人工加标的发酵面包基质回收率范围为117.7%~132.0%,对人工加标的甜菜糖浆回收率为118.6%~130.0%,对人工加标的酱油基质回收率为103.9%~110.5%。4D. 特异性4对粮谷类、豆类、甲壳类动物、肉类、坚果类、香料、水果及果汁、奶类、食品添加剂等88种食品样品交叉反应率为0。5D.精密度5对啤酒、发酵面包、淀粉、糖浆、酱油、饼干进行不同浓度的人工加标,变异系数范围为4.5%~9.0%,平均值为6.7%,回收率范围为94.5%~118.1%,回收率平均值为106.7%。4)

4)

本评价结果仅适用于rbipharmRIDASCREEN

Gladincompettve试剂盒。给出这一信息是为了方便本文件的使用者。如果采用其他产品可以得到相同或更好的检测效果,经实验评估后可以使用这些等效产品。16学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1SN/T5655.—2023学兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ标准下载1附 录E(规范性)醇溶蛋白竞争酶联免疫吸附检测试剂盒5)1E. 试剂盒组成1::

761a)

预包被醇溶蛋白的96孔可拆分微孔板

8×12::

761b)

11×酶标记物浓缩液

0.

mL/瓶×1瓶;c)

5×稀释缓冲液浓缩液:0mL/瓶×1瓶;d)

10×洗涤缓冲液浓缩液:00mL/瓶×1瓶;S 3S 3S 3S 3S 31e)

标准品1(td1):S 3S 3S 3S 3S 31f)

标准品2(td2):1.

mL/瓶×1瓶,醇溶蛋白含量为10ng/mL;g)

标准品3(td3):1.

mL/瓶×1瓶,醇溶蛋白含量为30ng/mL;h)

标准品4(td4):1.

mL/瓶×1瓶,醇溶蛋白含量为90ng/mL;i)

标准品5(td5):1.

mL/瓶×1瓶,醇溶蛋