GBT 43450-2023 化学品 急性眼刺激体外细胞试验 TRPV1活性检测法

化学品急性眼刺激体外细胞试验TRPV1活性检测法2023-11-27发布国家市场监督管理总局国家标准化管理委员会I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。本文件起草单位：南京市产品质量监督检验院(南京市质量发展与先进技术应用研究院)、中国药科大学、中国化工经济技术发展中心、中检科健(天津)检验检测有限责任公司、厦门丰力扬科技有限公司、浙江辉日环境检测有限公司。1化学品急性眼刺激体外细胞试验TRPV1活性检测法本文件规定了化学品急性眼刺激试验的方法原理、仪器与试剂耗材、试验和结果判定。本文件适用于化学品急性眼刺激性的体外检测，化学品溶于水且受试溶液的pH应在6.5～7.8范2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T21609化学品急性眼刺激性/腐蚀性试验方法SN/T2285化妆品体外替代试验实验室规范SN/T3899化妆品体外替代试验良好细胞培养和样品制备规范下列术语和定义适用于本文件。眼球表面接触受试物后产生的眼睛可逆性炎性变化。激动剂agonist既有亲和力又有内在活性，能与受体结合并激动受体产生效应的化合物。拮抗剂antagonist与受体结合后本身不引起生物学效应，但能阻断该受体产生激动效应的化合物。下列缩略语适用于本文件。AUC:曲线下面积(AreaUnderCurve)BSA:牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin)DMEM:杜氏改良依格尔培养基(Dulbecco'sModifiedEagleMedium)2DMSO:二甲基亚砜(DimethylSulfoxide)EDTA:乙二胺四乙酸(EthylenedinitrilotetraaceticAcid)FBS:胎牛血清(FetalBovineSerum)HBSS:Hank’s平衡盐溶液(Hank'sBalancedSaltSolution)HEPES:4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-Hydroxyethyl)-1-PiperazineethanesulfonicAcid]PBS:磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferedSaline)TRPV1:瞬时受体电位香草酸亚型1基因(TransientReceptorPotentialVanilloidType-1)TRPV1-HEK293:稳定转染人源TRPV1的人胚胎肾293细胞系(HumanTransientReceptorPo-4方法原理具有眼刺激性的化学品可通过激活TRPV1通道引起钙离子内流，使细胞内钙离子浓度迅速升高。通过测试化学品作用于TRPV1-HEK293细胞后的胞内钙离子浓度的改变，反映TRPV1通道的实时5仪器与试剂耗材5.1.2二氧化碳培养箱：温度为37℃±1℃,二氧化碳体积分数为5%±1%,相对湿度为90%±5%。5.1.5高通量实时荧光检测分析仪。5.1.7细胞计数仪或血球计数器。μL,最大允许系统误差为5%。5.1.12超低温冰箱。5.2.3DMEM培养基：DMEM培养基可选用各用0.22μm的滤膜过滤除菌，储存于4℃不超过1个月。5.2.4完全培养基：常规培养时，完全培养基配方为90%DMEM、10%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1mg/mL遗传霉素(CAS:108321-42-2)。试验时，完全培养基配方为90%pH至7.2,用双蒸水定容至1000mL,115℃高压灭菌15min,储存于4℃不超过1个月，5.2.60.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA:称取0.05g胰蛋白酶干粉和0.02gEDTA,先加入少量PBS溶3液，4℃低速搅拌，完全溶解后调节pH至7.2,用PBS溶液定容至100mL,过滤除菌，储存于一20℃,使用5.2.7Hank’s平衡盐溶液：称取8.0gNaCl、0.4gKCl、0.1gMgSO₄·7H₂O、0.1g0.06gNa₂HPO₄·2H₂O、0.06gKH₂PO₄、1.0g葡萄糖、0.14gCaCl₂、0.35gNaHCO₃,加700mL双蒸水充分混匀，调pH至7.2,用双蒸水定容至1000mL,储存于4℃不超过1个月。5.2.8HBSS缓冲液：称取HEPES(CAS:7365-45-9)2.383g,加入Hank’s平衡盐溶液定容至500mL,4℃保存备用。5.2.9辣椒素(Capsaicin)溶液：TRPV1激动剂(CAS:404-86-4)。称取1mg辣椒素溶于3.274mL5.2.10辣椒平(Capsazepine)溶液：TRPV1拮抗剂(CAS:138977-28-3)。称取5mg辣椒平溶于0.132mLDMSO中，配制成100mmol/L的母液，-20℃分装保存。使用前取10μL母液，加10mL5.2.11钙离子染料Fluo-4AM溶液：称取1mgFluo-4AM(CAS:273221-67-3),溶于227.9μLDMSO中，配制成4mmol/L的母液，避光保存于一20℃,分装保存。使用前取10μLFluo-4AM母液，加9mLHBSS缓冲液和1mL50mg/mLBSA(CAS:9048-46-8,HBSS缓冲液配制),37℃预热，即用即配。5.2.15细胞冻存管。5.2.1696孔黑色透明平底酶标板(细胞板)。5.2.1796孔尖底透明酶标板(加样板)。6试验方法6.1基本要求细胞培养相关的溶液和器皿等均应无菌，并且所有操作都应在无菌环境和IⅡ级生物安全柜或超净工作台中进行。定期检查细胞，确保无微生物污染。细胞由有资质的细胞库提供。细胞培养、传代、冻存应符合SN/T3899的要求，使用25代之内的细胞进行试验。试验过程应符合SN/T2285的要求。6.2试验步骤日常培养时，TRPV1-HEK293细胞使用常规培养的完全培养基在37℃±1℃,二氧化碳体积分数为5%±1%,相对湿度为90%±5%条件下培养。当细胞进行了2次～3次传代，显微镜下观察生长状况良好，培养液清澈透明无杂质，细胞无悬浮或微量悬浮，贴壁均匀，胞浆内颗粒少，则可进行细胞接种。使用PBS溶液洗涤细胞3次～4次，加入预热至37℃的0.05%胰蛋白酶(含EDTA)溶液消化细胞，用完全培养基调整细胞浓度以2×10'个/孔接种至细胞板的所有细胞孔，每孔150μl。空白对照孔中不加液体。在细胞培养板的外周孔中加入200μL无菌双蒸水，以减少培养基的蒸发(细胞板分布见图1)。将细胞板置于二氧化碳培养箱中培养4ABCDABCDEFGH过夜。次日，如细胞融合达到培养瓶底壁的85%～90%且形态正常，可进行下一步试验。H₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OH₂OCell:细胞孔(每孔加入150μL细胞悬液。其中Cellss为缓冲液对照孔，Cellc为阳性对照孔，Cellc-为受试样品无辣椒平孔，Cellc+为受试样品加辣椒平孔，Cellc为溶剂对照孔)。H₂O:外周孔(每孔加入200μL无菌双蒸水)。BL:空白对照孔(不加液体)。图1细胞板分布图吸取移除细胞板所有细胞孔内的培养基，加入60μL钙离子染料Fluo-4AM,于二氧化碳培养箱中孵育45min～60min。孵育结束后，每孔加入140μLHBSS缓冲液，此时每孔溶液总体积为200μL。吸取移除150μL孔内溶液，再轻柔缓慢地加入150μLHBSS缓冲液，避免吹起贴壁的细胞，重复该步骤5次～6次。除受试样品加辣椒平孔(Cellc+)外，其余细胞孔在最后一次移除150μL孔内溶液后，加入125μLHBSS缓冲液，此时每孔溶液总体积为175μL。受试样品加辣椒平孔(Cellc+)在最后一次洗涤完成后，移除孔内所有溶液，加入175μL辣椒平溶液(5.2.10)。室温下静置5min。上述所有操作均应避光。6.2.4.1受试物可为实验纯以上纯度的单一化学品或若干化学品组成的混合物。对于液态受试样品，一般不需稀释，可直接使用原液。若受试样品为固体、颗粒或粉末，应将其粉碎，研细。试验前预先测试受试物的溶解性，可选择的溶剂包括HBSS、DMSO、PBS等。液体受试物可以使用原液作为受试孔60μL。每板可同时测试6个样品(C1～C6)。缓冲液对照孔(HBSS)每孔加入60μLHBSS缓冲液。阳性对照孔(PC)每孔加入60μL辣椒素溶液(5.2.9)。溶剂对照孔(SC)每孔加入60μL含与受试样品孔中相等体积溶剂的HBSS缓冲液(以溶剂为DMSO为例，取3μLDMSO加入372μLHBSS缓冲液，充分混匀后每孔加入60μL)。当受试物为液体原液时，可不设溶剂对照孔。加样板分布见图2。5GB/T43450—2023ABCDEFGHHBSSHBSSHBSSHBSSHBSSHBSSC1～C6:受试样品孔(每列为同一浓度样品，每孔加入受试样品溶液)。图2加样板分布图6.2.5.1分别将细胞板和加样板放置于高通量实时荧光检测分析系统的相应位置，设定激发波长范围为470nm～495nm,测定波长范围为515nm～575nm,荧光信号采集间隔为1s,加样体积为25μL。6.2.5.2测试开始后，先不加样品，连续检测细胞板的基线荧光强度60s,以最初10个时间点荧光信号的平均值作为基础荧光强度值(F。)。随后，自动加样并连续检测荧光强度值(F)740s,检测时间共800s。对于空白对照孔、溶剂对照孔、缓冲液对照孔、阳性对照孔、受试样品无辣椒平孔和加辣椒平孔，分别计算每个测试时间点各孔的相对荧光强度F/F。。计算样品有/无辣椒平组及对照组的复孔在800s的AUC。见公式(1)～公式(6)。6.3二次测试当首次测试的结果出现7.4的情况，则进行二次试验。试验步骤按6.2进行，但在样品制备时，将受试溶液以3倍梯度稀释为6个浓度，分别加入加样板的C1孔～C6孔中。测试完成后，计算不同浓度受试物时间—F/F。曲线60s～800s的AUC。见公式(1)～公式(6)。6.4结果计算空白对照组激动效果以Eμ计，按公式(1)计算：……………式中：FBmx——空白对照的平均荧光强度最大值，单位为相对荧光单位(RFU);F₀——基础荧光强度值，单位为相对荧光单位(RFU)。6GB/T43450—2023溶剂对照组激动效果以Esc计，按公式(2)计算：式中：Fxm溶剂对照的平均荧光强度最大值，单位为相对荧光单位(RFU);F₀——基础荧光强度值，单位为相对荧光单位(RFU)。阳性对照组激动效果以Epc计，按公式(3)计算：式中：Fcmx——阳性对照的平均荧光强度最大值，单位为相对荧光单位(RFU);F₀——基础荧光强度值，单位为相对荧光单位(RFU)。缓冲液对照组激动效果以Emss计，按公式(4)计算：式中：FHmsmx——缓冲液对照的平均荧光强度最大值，单位为相对荧光单位(RFU);F₀——基础荧光强度值，单位为相对荧光单位(RFU)。受试样品的激动效果以Ec-计，按公式(5)计算：式中：AUCc-——受试样品无辣椒平的AUC值；AUCHmss——缓冲液对照的AUC值；AUC——阳性对照的AUC值。辣椒平溶液对于受试样品的拮抗效果以Ec+计，按公式(6)计算：…式中：AUCc+——受试样品加辣椒平的AUC值；AUCnmss——缓冲液对照的AUC值；AUCc-——受试样品无辣椒平的AUC值。7结果判定7.1首次测试时，如Eπ小于或等于110%、Ex小于或等于110%、Eμss小于或等于110%,同时Ep大于200%,试验结果有效。7.2当受试样品的Ec-小于20%,样品无急性眼刺激性。7.3当受试样品的Ec-大于或等于20%,且Ec+小于或等于75%,样品具有潜在的急性眼刺激性。7.4当受试样品的Ec-大于或等于20%,但Ec+大于75%,则应按6.3进行二次测试。二次测试的结果中，受试样品任一浓度的Ec+小于或等于75%,样品具有潜在的急性眼刺激性。7.5若测试结果不符合7.1～7.4,应按照GB/T21609或其他试验方法检测。[1]ForsbyA,Norma