保健食品中淫羊藿苷的测定 编制说明

《保健食品中淫羊藿苷的测定》编制说明（征求意见稿）一、工作简况根据《国家标准化管理委员会关于下达2023年第二批推荐性国家标准计划及相关标准外文版计划的通知》（国标委发〔2023〕372024年1月，全国特殊食品标准化技术委员会组织各参与单位2024年1月，起草工作组在前期工作基础上形成标准征求意见二、国家标准编制原则、主要内容及其确定依据GB/T22247-2008相比，除结构调整和编辑性修改外，主要技术C等其他功效成分，我们建议增加液相色谱-串联质谱法的目的是在三、试验验证的分析、综述报告方法线性关系：以淫羊藿苷为定量外标，在1.0~100.0μg/mL浓80.5%～109.6%之间，相对偏差在1.10%～8.57%之间，符合GB5009.295-2023《食品安全国家标准化学分析方法验证通则》对方法方法线性关系：以淫羊藿苷为定量外标，在1.0~100.0ng/mL浓10mg/kg淫羊藿苷标准品，选择酒类、口服液空白样品分别加入1间，符合GB5009.295-2023《食品安全国家标准化学分析方法验证方法验证基础上，起草工作组组织6家实验室进行验证，结果符四、与国际、国外同类标准技术内容的对比情况五、以国际标准为基础的起草情况六、与有关法律、行政法规及相关标准的关系七、重大分歧意见的处理经过和依据八、涉及专利的有关说明九、实施国家标准的要求，以及组织措施、技术措施、过渡期和实施日期的建议十、其他应当说明的事项附件：方法学验证报告第一法高效液相色谱法1、特异性比较了与淫羊藿其他功效成分朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C对淫羊藿苷出峰的影响，结果显示，淫羊藿苷能与朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C基线分离，淫羊藿苷与朝藿定C的分离度为2.83,满足分离要求。4种功效成分的色谱图见图1。粉剂等空白样品与淫羊藿苷标准进行比对，结果显示淫羊藿苷保留时间为18.305,空白辅料中无色谱峰对淫羊藿苷检测造成干扰，具体见2之之(h)丸剂样品空白(i)粉剂样品空白之(j)淫羊藿苷标准溶液图2不同剂型样品空白出峰情况2、前处理条件的选择和优化2.1提取溶剂的选择为选择合适的提取溶剂，选取淫羊藿中药、含淫羊藿的钙片、含淫羊藿的口服液为研究对象，考察不同溶剂水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯，40%乙醇溶液、50%乙醇溶液、60%乙醇溶液、70%乙醇溶液、80%乙醇溶液、40%甲醇溶液、50%甲醇溶液、60%甲醇溶液、70%甲醇溶液、80%甲醇溶液)对目标物的提取效果。结果见图3,由实验结果可知，70%乙醇水溶液对含目标物样品的提取效果最佳。图3(a)不同溶剂对淫羊藿中药中淫羊藿苷的提取效果图3(b)不同溶剂对含淫羊藿的钙片中淫羊藿苷的提取效果20min、30min、1h)和超声提取(超声时间10min、20min、30min、1h)的提取效果。结果见图4,由实验结果可知，超声提取20min的图4(c)不同提取方式对酒类中淫羊藿苷的提取效果图4(d)不同提取方式对含淫羊藿的口服液中淫羊藿苷的提取效果脂两种方式下提取效果。结果见图5,由实验结果可知，正己烷除脂粉剂等不同剂型的保健食品，考察不净化、分散固相萃取净化和图6不同净化方式对加标回收率的影响综上，提取液选择70%乙醇溶液，提取方式选择超声提取，超声时间为20min,含油样品选择正己烷除脂，净化方式选择通过式固相结果见图7。后续实验，检测波长选择270nm。定B和朝藿定C完全分离，我们参照了《中国药典》（2020分离效果，结果表明甲醇-水体系很难将朝藿定C与淫羊藿苷充分分表1梯度洗脱条件%%实验考察了在最佳的梯度洗脱条件下，柱温35℃,流速为1.0mL/min时淫羊藿苷与朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C在Waters（5μm4.6*250mm）和WatersXBridge®Shiel分钟分钟分钟4、检出限检出限估值：采用信噪比法估计方法检出限：向空白样品基质添加目标分析物，信噪比为3时的添加浓度作为估算检出限。结果见表表2淫羊藿苷分析方法检出限验证估算结果测定：选取空白样品基质至少20个平行样，分别添加估算检出表3方法检出限验证结果量率表4淫羊藿苷分析方法定量限验证估算结果测定：采用估算定量限浓度水平的有证标准物质/标准样品、质表5淫羊藿苷分析方法定量限验证结果称度采用标准曲线法定量，定量方法标准曲线的线性相关系数应大于等于0.99,并具有6个数据点(不包括0点)。表6淫羊藿苷标准曲线(HPLC)标准点123456质量浓度峰面积93曲线方程Y=9.98614*10³X+2.093相关系数(R2)图9校准曲线选择胶囊、片剂、保健茶、颗粒、丸剂、粉剂空白样品，分别加入25mg/kg(LOQ)、125mg/kg(5LOQ)、250mg/kg(10LOQ)50mg/L（5LOQ）、100mg/L（10LOQ）淫羊藿标准品，选择软胶mg/kg（10LOQ）淫羊藿标准品，每个添加六个平行。结果显示：实表7-1胶囊样品添加回收率表7-2片剂样品加标回收率表7-3酒类样品加标回收率表7-4软胶囊样品加标回收率表7-5口服液样品加标回收率表7-6保健茶样品加标回收率表7-7颗粒样品加标回收率表7-8粉剂样品加标回收率表7-9丸剂样品加标回收率表8样品稳定性测试02468剂羊藿的酒类含量第二法液相色谱-串联质谱法图10。图10不同剂型空白样品色谱质谱图2、仪器条件的选择和优化本实验用液相色谱仪型号为岛津NexeraUHPLCLC-30A。本方法比较了乙酸铵水溶液-乙腈流动相体系和甲酸水溶液-乙腈流动相体系的分离效果，发现两者所得的峰形对称，但两者在响应值指标上甲酸水一乙腈体系优于乙酸铵-乙腈体系，故而本方法采用甲酸水溶液一乙腈作为流动相。在流动相中加酸可抑制电离、改善峰形，但酸浓度过高会抑制在负离子模式下的离子化效率。同时考虑到0.1%的甲酸水溶液已经足以满足检出限响应的要求，过高浓度的酸溶液对色谱柱寿命有一定的影响，且不利于离子源中溶剂的高效脱除，所以最终选择了0.1%的甲酸水溶液一乙腈作为流动相。mm*100mm,粒径1.8μm)、WatersACQUITYBEHCig色谱柱(100谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm)和PhenomenexKinetexF5柱(2.1mm×100mm,2.6μm)上的分离效果。结果显示，与其他色谱柱相比，WatersACQUITYBEHCi₈色谱柱(100mm×2.1mm,2.5μm)色最佳，尖锐对称，故选择WatersACQUITYBEHC18色谱柱(100mm×2.1mm,2.5μm)柱作为本方法的色谱柱。图11为目标化合物的电喷雾ESI离子源适应极性范围广，离子化效率高，重现性好，盟2002/657/EC指令规定对于质谱确证方法必须达到4个确证点的要求，低分辨液相色谱-质谱联用仪检测应在确定母离子的基础上选择图见图12，淫羊藿苷的m/z513和m/z367碎片离子的强度最藿苷的准分子离子峰为m/z675[M-H]-，其产生的特征二级离子碎片有m/z513、m/z367，其中m/z513为[M-H-C6H12O5]-，m/图12淫羊藿苷的二级质谱图Precursor:m/z675m△513m/z图13淫羊藿苷的裂解途径然后再对得到的二级质谱参数如破碎电压、碰撞电压等进行优化，使定性离子与定量离子产生的离子对强度达到最大时为最佳，得到淫羊藿苷的最佳质谱参数。淫羊藿苷在碰撞电压分别为-17V和-47V时，m/z513.2和m/z367.3碎片离子的强度最大，因此将上述碰撞电压作为质谱检测时的碰撞电压。检出限估值：采用信噪比法估计方法检出限：向空白样品基质添加目标分析物，信噪比为3时的添加浓度作为估算检出限。结果见表表9淫羊藿苷分析方法检出限验证估算结果(LC-MS)测定：选取空白样品基质至少20个平行样，分别添加估算检出表10方法检出限验证结果（LC-MS）表11淫羊藿苷分析方法定量限验证估算结果（LC-MS）测定：采用估算定量限浓度水平的有证标准物质/标准样品、质表12淫羊藿苷分析方法定量限验证结果称度表13淫羊藿苷标准曲线（LC-MS）1234567每个添加六个平行。结果显示平均加标回收率在80.3%～109.0%之表14-1胶囊样品添加回收率15表14-2片剂样品加标回收率15表14-3酒类样品加标回收率15表14-4软胶囊样品加标回收率15表14-5口服液样品加标回收率15表14-6保健茶样品加标回收率15表14-7颗粒样品加标回收率15表14-8粉剂样品加标回收率添加水平（mg/kg)测定值（mg/kg）平均回收率相对偏差（%)10.80680.682.32.010.80380.30.82482.40.84884.80.83283.20.82482.454.5791.494.03.804.5791.45.044.6593.04.6392.64.7595.09.3493.497.15.059.2792.79.7497.49.8298.29.4794.7表14-9丸剂样品加标回收率15表15样品稳定性测试（LC-MS）02468剂6103747015类74829